體外孵化模型中乳酸鹽對(duì)肌紅蛋白結(jié)構(gòu)影響的機(jī)理

李丙子,魏紅艷,雷 蕓,陳 騁,張玉斌,*

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,甘肅蘭州 730070；2.蘭州文理學(xué)院化工學(xué)院,甘肅蘭州 730000)

牦牛(Bosgrunniens)是生長(zhǎng)在青藏高原地區(qū)的動(dòng)物之一,是世界上唯一能夠在海拔3000 m以上生存的牛種,牦牛長(zhǎng)期生活在高原地區(qū)的缺氧、低溫以及飼料缺乏的環(huán)境下,具有極高的適應(yīng)力和抗逆性,牦牛生存環(huán)境處于高寒低氧的生態(tài)條件,血紅蛋白與肌紅蛋白含量較高,肉色比黃牛肉及豬肉更深紅[1]。在牦牛肉加工、儲(chǔ)運(yùn)及銷售的過程中,隨著鮮肉貨架期延長(zhǎng)和后續(xù)的加工處理,肉色表現(xiàn)出穩(wěn)定性變差、商業(yè)價(jià)格變低等現(xiàn)象。對(duì)于肉類加工業(yè)以及零售業(yè)來(lái)說,生鮮肉在貯藏和零售過程中,其外觀顏色是決定肉商品價(jià)值的最重要因素,決定了絕大多數(shù)消費(fèi)者的購(gòu)買意向[2]。因此,如何對(duì)宰后冷藏期間生鮮肉的色澤劣變進(jìn)行有效的控制,延長(zhǎng)貨架期并提高肉制品質(zhì)量,是目前急需解決的問題。

乳酸及其鹽類最初是以其防腐抑菌作用被應(yīng)用于肉制品加工業(yè)中的[3-4]。但最近十年已有大量研究者報(bào)道添加乳酸鹽對(duì)肉色穩(wěn)定性的影響,由此一些學(xué)者提出了底物和中間代謝物在肉中高鐵肌紅蛋白(MMb,Metmyoglobin)還原作用途徑的乳酸+乳酸脫氫酶+煙酰胺腺嘌呤二核苷酸體系假說[5-7],同時(shí)部分研究者證實(shí)了線粒體和胞漿之間存在著乳酸鹽的穿梭作用[8]。乳酸鹽的循環(huán)和穿梭是構(gòu)成多細(xì)胞生物氧化還原、能量和物質(zhì)代謝、酸堿平衡、合成與分解的基本條件[9]。目前有關(guān)乳酸鹽增強(qiáng)調(diào)控牛肉色澤穩(wěn)定性的基本機(jī)理,研究主要聚焦在以下兩個(gè)方面:肌紅蛋白(Myogolobin,Mb)和乳酸鹽的直接互動(dòng)作用以及酶促反應(yīng)和細(xì)胞系統(tǒng)的間接作用[10]。有相關(guān)研究已經(jīng)證明乳酸鹽可以調(diào)節(jié)Mb的功能[11]。但是,肉中MMb的還原是一個(gè)復(fù)雜的反應(yīng)體系。因此很有必要構(gòu)造一個(gè)體外綜合的肉色穩(wěn)定性分析方法,以體系研究的思路代替對(duì)單一物質(zhì)的研究[12]。Ramanathan等[13]發(fā)現(xiàn)在pH5.6和7.4(4 ℃)體外孵化條件下,乳酸鹽和氧合肌紅蛋白(OMb)的結(jié)合改善了氧化還原穩(wěn)定性。Kim等[14]提出了一種更間接的機(jī)制,其中乳酸鹽通過乳酸脫氫酶(Lactic dehydrogenase,LDH)介導(dǎo)的NADH(Nicotinamide adenine dinucleotide),產(chǎn)生從而提高了顏色的穩(wěn)定性。盡管以前的研究已經(jīng)評(píng)估了乳酸鹽和肉色穩(wěn)定性之間的關(guān)系,但乳酸鹽對(duì)Mb的更直接的作用機(jī)制并沒有更多的研究。

迄今為止,幾乎沒有研究能夠確認(rèn)乳酸鹽和Mb的共價(jià)加合作用,到底是通過與血紅素輔基還是非血紅素配體結(jié)合途徑來(lái)調(diào)節(jié)Mb的功能進(jìn)而影響肉色穩(wěn)定性的機(jī)制。因此,本實(shí)驗(yàn)從牦牛背最長(zhǎng)肌中提取分離Mb體,在體外重建Mb-乳酸鹽體外孵化反應(yīng)模型,從Mb血紅素輔基的角度出發(fā),采用紫外-可見光譜、熒光光譜和圓二色譜研究乳酸鹽與Mb的相互作用機(jī)制,為生物體內(nèi)乳酸鹽對(duì)肌紅蛋白的調(diào)控提供可靠實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

試驗(yàn)牦牛肉樣品 采樣自甘肅天瑪生態(tài)食品科技股份有限公司,選取年齡1～3歲生長(zhǎng)發(fā)育良好、健康無(wú)病的甘南牦牛,屠宰后取牦牛背最長(zhǎng)肌,剔除脂肪、筋膜,避光、真空包裝后置于恒溫箱運(yùn)送回實(shí)驗(yàn)室,在24 h之內(nèi)進(jìn)行肌紅蛋白的分離純化;丙稀酰胺溶液、Tris-HCI、SDS、APS、TEMED 分析純;Sephadex G-100 prep grade、DEAE-52 GE;馬心肌肌紅蛋白標(biāo)品 Sigma;預(yù)染Marker 北京康潤(rùn)科技有限公司;MES 天津光復(fù)精細(xì)化工研究所。

PPS-2型蛋白純化儀 上海金達(dá)生化儀器有限公司;J-810型圓二色光譜儀 日本分光株式會(huì)社JASCO公司;LS-55熒光分光光度計(jì) 美國(guó)PE公司;SP-756P紫外可見分光光度計(jì) 上海光譜儀器有限公司;25 D電泳槽 北京六一儀器廠;TGL-24M臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 長(zhǎng)沙平凡儀器儀表有限公司;AL204電子天平 梅特勒-托利多儀器有限公司;PHS-3C pH計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司;XHF-D高速分散器 寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 肌紅蛋白的分離純化與鑒定 參考Thiansilakul等[15]的方法稍加改進(jìn)。取切碎后的肉樣100 g,在4 ℃預(yù)冷的300 mL提取液(含1 mmol/L EDTA、10 mmol/L pH8.0 Tris-HCl、25 g/L Triton X-100)中混合,在低溫高速冷凍離心機(jī)中13000 r/min均質(zhì)30 s,取出勻漿液,將其在9500 g、4 ℃下離心10 min,取上清液,用濾紙過濾后得到Mb粗提液。采用硫酸銨溶液對(duì)粗提液進(jìn)行分級(jí)沉淀,飽和度梯度由65%至95%,然后4 ℃條件下3000×g離心10 min后棄去上清液,將沉淀物在5 mmol/L pH8.5的Tris-HCl緩沖液中溶解。然后用提前預(yù)冷至4 ℃的相同緩沖液透析10 h,透析液每隔1 h換一次,透析結(jié)束后在4 ℃下5000×g離心10 min,得到Mb初級(jí)純化液。接下來(lái)采用Sephadex G-100凝膠層析分離柱進(jìn)行精細(xì)純化,以5 mmol/L pH8.5的Tris-HCl緩沖液平衡層析分離柱,然后取適量初級(jí)純化液上樣,用上述緩沖液以0.5 mL/min的流速進(jìn)行洗脫,在540和280 nm(280 nm處為蛋白質(zhì)的特征吸收峰)處檢測(cè)吸光值。由于肌紅蛋白在540 nm處具有特征吸收峰,因此,收集在該波長(zhǎng)下吸光值較高的蛋白溶液,分離得到的Mb參考Laemmli等[16]的方法對(duì)其進(jìn)行光譜特性和SDS-PAGE鑒定。

1.2.2 肌紅蛋白光譜特性檢測(cè) 參考馬蘭等[17]的方法,將經(jīng)過1.2.1處理后的純化液進(jìn)行光譜測(cè)定已知肌紅蛋白中鐵離子在576 nm處有特征吸收峰,并且在該波長(zhǎng)下的毫摩爾消光系數(shù)為12.8 L/(mmol·cm),因此根據(jù)上清液在576 nm下的吸光值,計(jì)算樣品中肌紅蛋白(Mb)的含量,即:

式中:CMb:肌紅蛋白含量,μmol/g;A576:576 nm處吸光值;V:溶液體積,mL;m:樣品重量,g。

1.2.3 SDS-PAGE鑒定 參考Laemmli等[16]的方法。使用SDS-PAGE分析樣品對(duì)照組與處理組肌紅蛋白。按照表1分別配制濃度為15%的分離膠和4%濃縮膠。蛋白溶液與樣品緩沖液按體積比1∶1混合均勻后沸水加熱5 min。冷卻后進(jìn)行電泳,上樣量40 μL,濃縮膠電壓70 V,分離膠電壓120 V。電泳結(jié)束后剝離膠面,染色液染色40 min,脫色液脫色至條帶清晰可見。

表1 SDS-PAGE電泳凝膠配方(mL)Table 1 The formula of SDS-PAGE gel(mL)

1.2.4 體外反應(yīng)模型系統(tǒng)的構(gòu)建 pH5.6的磷酸鹽緩沖溶液體系(模擬肉成熟過程中pH),Mb溶液濃度1×10-5mol/L,選取乳酸鈣,濃度為1×10-4mol/L,加入提取的Mb溶液中(參考張玉斌等[18]實(shí)驗(yàn)結(jié)果0.3%為最佳添加量,加入的乳酸鈣為肌紅蛋白溶液含量的0.3%),對(duì)照為Mb磷酸鹽緩沖溶液,4 ℃條件下冷藏72 h,測(cè)定0、12、36、72 h,4個(gè)時(shí)間點(diǎn)肌紅蛋白的結(jié)構(gòu)變化情況。

1.2.5 紫外-可見吸收光譜測(cè)定 分別取不同時(shí)間點(diǎn)處理樣品移取至1.0 cm石英比色皿,以Mb磷酸鹽緩沖溶液為空白樣品進(jìn)行對(duì)比,掃描300～550 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)的紫外吸收光譜。

1.2.6 熒光光譜測(cè)定方法 使用LS-55熒光分光光度計(jì)進(jìn)行測(cè)定,測(cè)試條件:1.0 cm石英比色皿,激發(fā)波長(zhǎng)430 nm,熒光發(fā)射與激發(fā)狹縫寬度均為10 nm,掃描速度500 nm/min,掃描500～700 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)的熒光光譜。

1.2.7 圓二色光譜測(cè)定 采用圓二色光譜儀,長(zhǎng)波范圍163～900 nm氙燈作為光源;測(cè)定條件:掃描范圍190～300 nm,狹縫寬度1 nm,掃描速度50 nm/min,響應(yīng)時(shí)間1 s。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)中所有測(cè)定均做3次重復(fù),試驗(yàn)結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)分析軟件(美國(guó)IBM公司)進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理,平均數(shù)之間的顯著性差異(P<0.05)通過LSD法進(jìn)行比較分析,用Origin 8.0軟件(美國(guó)Origin Lab公司)進(jìn)行圖制作。

2 結(jié)果與分析

2.1 牦牛背最長(zhǎng)肌肌紅蛋白Sephadex G-100凝膠層析分離

圖1可知,Sephadex G-100凝膠柱共分離出3種組分,分為組分1、組分2、組分3,其中三種組分均在280 nm的吸光度系下出現(xiàn)吸收峰,但組分1和組分2未在540 nm處呈現(xiàn)出較為明顯的光譜吸收峰,其中組分3的吸收峰分離度比其他三種組分組分明顯,并且在肌紅蛋白特征吸收峰(540 nm)處,呈現(xiàn)出較為明顯的光譜吸收峰,因此初步判定組分3為分離后的肌紅蛋白提取液。

圖1 牦牛背最長(zhǎng)肌肌紅蛋白Sephadex G-100凝膠層析洗脫曲線Fig.1 Elution profile of myoglobin from yak LDon Sephadex G-100 column

2.2 牦牛背最長(zhǎng)肌Mb分離純化

由圖2可知對(duì)比肌紅蛋白粗提液、初級(jí)純化液和精細(xì)純化液組分3的SDS-PAGE電泳發(fā)現(xiàn),肌紅蛋白粗提取液中蛋白質(zhì)種類繁多,并且分子量主要分布于17～45 kDa之間,在17 kDa處有明顯的肌紅蛋白條帶,肌紅蛋白的純度較低,僅為18.52%。經(jīng)過硫酸銨沉淀初步純化后,雜蛋白種類明顯減少,肌紅蛋白特征條帶處有所加深,肌紅蛋白的純度增加到35.09%,但純度并未達(dá)到體外孵化要求。經(jīng)過高分辨率的Sephadex G-100凝膠層析柱進(jìn)行精細(xì)純化后,得到的組分3中蛋白質(zhì)的電泳條帶只出現(xiàn)在17 kDa處,說明組分3中蛋白質(zhì)組分單一,肌紅蛋白純度為94.55%。通過光譜吸收曲線進(jìn)一步對(duì)上述結(jié)果進(jìn)行的驗(yàn)證,在450～650 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi),肌紅蛋白的特征吸收峰分別出現(xiàn)在了540和580 nm。說明通過Sephadex G-100凝膠層析法能夠得到高純度的肌紅蛋白。

圖2 肌紅蛋白的光譜特性和SDS-PAGE鑒定Fig.2 Spectral characteristics and SDS-PAGE identification of myoglobin注:1:肌紅蛋白粗提取液;2:肌紅蛋白初級(jí)純化液;3:肌紅蛋白精細(xì)純化液組分3。

2.3 牦牛背最長(zhǎng)肌Mb與乳酸鈣結(jié)合的紫外-可見吸收光譜分析

由圖3可知,對(duì)照組四個(gè)不同的時(shí)間點(diǎn)在409 nm的吸光度分別為1.31、1.40、1.51、1.38,隨著時(shí)間的增長(zhǎng)在36 h時(shí)達(dá)到最大值,處理組在409 nm處不同時(shí)間的吸光度為1.96、1.98、1.82、1.79,相比于對(duì)照組分別增加了0.65、0.58、0.31、0.41。該現(xiàn)象說明乳酸鈣對(duì)Mb分子中的血紅素輔基影響較小。只是與肌紅蛋白表面的氨基酸殘基發(fā)生了作用,因?yàn)闃O性氨基酸殘基幾乎全部分布在分子表面,可與水結(jié)合,使肌紅蛋白具有可溶性[19]。

圖3 不同時(shí)間點(diǎn)下乳酸鈣與肌紅蛋白的紫外-可見光譜特性Fig.3 UV-Vis spectra character of myoglobin at different time

2.4 牦牛背最長(zhǎng)肌Mb與乳酸鈣結(jié)合的熒光光譜分析

由圖4可以看出,對(duì)照組肌紅蛋白的血紅素鐵卟啉環(huán)在597 nm處有一個(gè)熒光發(fā)射峰,當(dāng)加入一定量的乳酸鈣后,597 nm處發(fā)射峰強(qiáng)度減弱,隨著貯藏天數(shù)的增加,發(fā)射峰強(qiáng)度先增加至12 h最大值,后繼續(xù)減弱。但與紫外檢測(cè)的結(jié)果一致,用熒光光譜檢測(cè)肌紅蛋白的鐵卟啉環(huán)的發(fā)射峰位置沒有發(fā)生位移,但它的熒光強(qiáng)度隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)而減弱,添加乳酸鈣的處理組在0、12、36和72 h比對(duì)照組分別下降了4.64%、13.50%、18.30%和18.32%,發(fā)生熒光猝滅。但并沒有發(fā)生紅移或藍(lán)移現(xiàn)象(注:藍(lán)移或者強(qiáng)度發(fā)生變化說明二者相互作用,導(dǎo)致熒光性質(zhì)改變。如果是因?yàn)橥鈦?lái)物質(zhì)的加入使得熒光性質(zhì)改變,使得熒光基團(tuán)的疏水性增加,極性變小。紅移則相反),說明乳酸鈣與肌紅蛋白的血紅素鐵卟啉環(huán)并未直接發(fā)生反應(yīng)。

圖4 不同時(shí)間點(diǎn)下乳酸鈣與肌紅蛋白的熒光光譜特性Fig.4 Fluorescence spectra character of myoglobin at different time

2.5 牦牛背最長(zhǎng)肌Mb與乳酸鈣結(jié)合的圓二色譜分析

從圖5可以看出,肌紅蛋白的光譜圖是帶有螺旋結(jié)構(gòu)的譜圖,即對(duì)照組和乳酸鈣處理組在192、208和222 nm遠(yuǎn)紫外區(qū)附近,圓二色光譜都明顯可見一個(gè)典型的正峰和二個(gè)負(fù)峰的特征肩峰譜帶,它們均代表α-螺旋結(jié)構(gòu)的特征峰,在反應(yīng)體系中加入一定濃度的乳酸鈣對(duì)肌紅蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響甚微,遠(yuǎn)紫外區(qū)3個(gè)特征峰的形狀和肩峰的位置未發(fā)生明顯改變,190～240 nm處的圖譜在乳酸鈣處理組中和對(duì)照組一樣曲線平滑,說明乳酸鈣并未與Mb血紅素中心Fe原子發(fā)生了配位,這與上述紫外-可見光譜、熒光光譜圖結(jié)果相吻合。

使用光譜數(shù)據(jù)用目前較為常用的計(jì)算網(wǎng)站K2D2提供的方法進(jìn)行比較。本研究中選取波長(zhǎng)190～240 nm段圖譜擬合51個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn),經(jīng)計(jì)算和預(yù)測(cè),其主要的二級(jí)結(jié)構(gòu)為α-helix,對(duì)照組中α-helix 的含量為87.70%,β-strand的量為0.48%,在乳酸鈣處理組中α-helix 的含量為87.76%,β-strand的含量為0.47%,對(duì)照組與乳酸鈣處理組完全無(wú)差異。Mb的CD光譜在K2D2網(wǎng)頁(yè)中的擬合結(jié)果表明,進(jìn)一步根據(jù)Beer-Lambert定律進(jìn)行計(jì)算驗(yàn)證,實(shí)際測(cè)定結(jié)果軟件擬合計(jì)算結(jié)果相差不大。

圖5 不同時(shí)間點(diǎn)下乳酸鈣與肌紅蛋白的圓二色譜特性Fig.5 CD spectra character of myoglobin at different time注:pH5.6,Mb溶液濃度1×10-5 mol/L。

3 討論

肌紅蛋白是一種含有血紅素的儲(chǔ)氧蛋白,其在 Soret帶和Q帶的吸收峰是由卟啉環(huán)共軛體系π-π*躍遷引起的[20]。Soret帶在409 nm有一個(gè)強(qiáng)吸收峰,它是血紅素卟啉環(huán)上的特征譜帶,因此紫外一可見吸收光譜在409 nm處的吸收峰能夠反映血紅素輔基與膚鏈的結(jié)合情況。馬靜等[21]利用紫外-可見吸收光譜法對(duì)肌紅蛋白與Cu2+相互作用進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)隨著Cu2+的加入使Mb的的紫外吸收增強(qiáng)并且峰位藍(lán)移,說明Mb與Cu2+發(fā)生了較強(qiáng)的相互作用。本研究發(fā)現(xiàn)隨著乳酸鈣的加入,每個(gè)時(shí)間點(diǎn)處理組的紫外吸收強(qiáng)度增加,但并未發(fā)生藍(lán)移說明并未發(fā)生較強(qiáng)的相互作用。張?jiān)降萚22]用分子熒光光譜法和紫外可見分光光度法研究了肌紅蛋白與亞硝酸鈉的相互作用,發(fā)現(xiàn)隨著溶液中NaNO2濃度的增加,肌紅蛋白在280 nm處的吸光值不斷增加,說明亞硝酸鈉可使包裹在Mb內(nèi)部的色氨酸與酪氨酸暴露出來(lái),使發(fā)射峰增強(qiáng),即Mb與亞硝酸鈉發(fā)生了相互作用。本研究在進(jìn)行肌紅蛋白與乳酸鈣相互作用的研究中發(fā)現(xiàn),在不同的時(shí)間點(diǎn)上Mb在409 nm處的特征吸收峰吸收強(qiáng)度都略有增加,可能是隨著時(shí)間的增加,肌紅蛋白中心Fe2+在空氣中被氧化為Fe3+,使吸收峰強(qiáng)度略有增加。乳酸鈣處理組吸光度值在409 nm處的峰位幾乎沒有變化,該現(xiàn)象說明乳酸鈣對(duì)Mb分子中的血紅素輔基影響較小?？赡芘c肌紅蛋白的分子結(jié)構(gòu)有關(guān),因?yàn)闃O性氨基酸殘基幾乎全部分布在分子表面,可與水結(jié)合,使肌紅蛋白具有可溶性[23]。而非極性氨基酸殘基大多分布在分子的內(nèi)部,使內(nèi)部呈一個(gè)疏水空穴。血紅素輔基被包裹在疏水腔中,說明乳酸鈣分子未能進(jìn)入疏水腔內(nèi)與血紅素輔基發(fā)生相互作用,可能只是與肌紅蛋白外部的氨基酸殘基發(fā)生了相互作用。

蛋白質(zhì)的內(nèi)源熒光主要來(lái)源于色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)和苯丙氨酸(Phe)殘基。苯丙氨酸的量子產(chǎn)率很低,酪氨酸被電離或者接近氨基、羧基時(shí)其熒光幾乎全部猝滅[24],肌紅蛋白和血紅蛋白的核心官能團(tuán)是heme-Fe2+/3+,位于球蛋白4條肽鏈折疊而成的亞基之中,由咪唑基團(tuán)N原子和Fe原子相互配位,并由二硫鍵(-S-S-)將heme-Fe 與肽鏈形成穩(wěn)定結(jié)構(gòu)[25]。肌紅蛋白高級(jí)結(jié)構(gòu)的熒光光譜顯示其heme-Fe2+在597.27 nm處呈現(xiàn)其特征熒光發(fā)射峰[26],為五配位高自旋結(jié)構(gòu)。Chou等[27]指出肌紅蛋白中鐵卟啉環(huán)可發(fā)射 596 nm的熒光,并有報(bào)道研究了金屬離子同肌紅蛋白的相互作用。研究發(fā)現(xiàn)加入一定量的乳酸鈣后,597 nm處發(fā)射峰強(qiáng)度減弱,隨著貯藏天數(shù)的增加,發(fā)射峰強(qiáng)度繼續(xù)減弱。用熒光光譜檢測(cè)肌紅蛋白的鐵卟啉環(huán)的發(fā)射峰位置幾乎沒有發(fā)生變化,但它的熒光強(qiáng)度隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)而減弱,添加乳酸鈣的處理組在0、12、36和72 h比對(duì)照組分別下降了4.64%、13.50%、18.30%和18.32%,說明乳酸鹽體系與Mb發(fā)生了相互作用時(shí)更接近色氨酸殘基的位置,即對(duì)色氨酸殘基微環(huán)境的影響較大,造成色氨酸殘基微環(huán)境的極性減弱,疏水性增強(qiáng),Mb內(nèi)部疏水結(jié)構(gòu)更加緊湊,肽鏈的整體延伸程度有所減少[21],但峰圖并未發(fā)生紅移或藍(lán)移現(xiàn)象,說明乳酸鈣與肌紅蛋白的血紅素鐵卟啉環(huán)并未直接發(fā)生反應(yīng)。

蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)在遠(yuǎn)紫外(178～250 nm)區(qū)具有特征圓二色譜的變化[28],采用遠(yuǎn)紫外區(qū)CD技術(shù)檢測(cè)不同量乳酸鈣對(duì)Mb的二級(jí)結(jié)構(gòu)變化情況。202和222 nm處的2個(gè)負(fù)槽反映的是的光譜性α-helix質(zhì)[29]。林凱蕾[30]通過測(cè)試血紅蛋白在4～40 ℃范圍內(nèi)的變化,發(fā)現(xiàn)光譜圖的改變不明顯,計(jì)算值也非常接近。因此溫度范圍對(duì)肌紅蛋白CD的分析影響不大,所以本研究中體外孵化在4 ℃模擬冷藏條件下通過CD光譜法觀察乳酸鈣與肌紅蛋白的互作過程是具有一定可靠性的。馬靜等[21]通過CD光譜研究了Cu2+與Mb的相互作用,發(fā)現(xiàn)Mb與Cu2+作用后α-螺旋的含量由64.0%下降到 61.8%,表明金屬Cu2+離子誘導(dǎo)Mb的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生了輕微的改變。本研究結(jié)發(fā)現(xiàn)在乳酸鹽反應(yīng)體系中加入一定濃度的乳酸鈣對(duì)肌紅蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響甚微,遠(yuǎn)紫外區(qū)192、208和222 nm 3個(gè)特征峰的形狀和肩峰的位置未發(fā)生明顯改變,190～240 nm處的圖譜在乳酸鈣處理組中和對(duì)照組一樣曲線平滑,說明乳酸鈣并未與Mb血紅素中心Fe原子發(fā)生了配位。綜上所述,乳酸鹽與肌紅蛋白血紅素輔基的相互作用機(jī)制,主要是通過非血紅素配體結(jié)合的方式對(duì)Mb進(jìn)行調(diào)節(jié)。

4 結(jié)論

采用可見光譜法對(duì)冷藏期間牦牛背最長(zhǎng)肌肌紅蛋白與乳酸鹽作用機(jī)制進(jìn)行研究,研究結(jié)果表明不同光譜法互相佐證了乳酸鹽和Mb的共價(jià)加合作用并未發(fā)生在血紅素輔基上,而是通過非血紅素配體結(jié)合的方式來(lái)調(diào)節(jié)Mb,說明乳酸鹽對(duì)牦牛背最長(zhǎng)肌的作用機(jī)制,進(jìn)一步為乳酸鹽調(diào)控肉色的研究方向提供理論基礎(chǔ)。