遠(yuǎn)志地上部位芒果苷和總皂苷含量測定研究

魏 巍 劉雅晴 田 盛 吳雪梅 王海波

遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，遼寧 大連 116600

中藥遠(yuǎn)志最早記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品，并被視為養(yǎng)命要藥，其性溫，味苦、辛，具有安神益智、祛痰、消腫的功效。其來源為遠(yuǎn)志科植物遠(yuǎn)志PolygalatenuifoliaWilld．和卵葉遠(yuǎn)志P.sibiricaL.的干燥根[1]。從遠(yuǎn)志中可分離得到諸多活性成分，以三萜皂苷類、酮類和寡糖酯類為主要活性成分[2]，但其地上部位常常作為廢料丟棄。為更好利用遠(yuǎn)志藥材資源，進(jìn)一步考察遠(yuǎn)志主要藥效成分在其地上部位的分布及含量情況，對其地上部位花、莖、葉進(jìn)行了成分及含量測定分析。研究發(fā)現(xiàn)其地上部位含有芒果苷，是一種四羥基酮碳苷，屬雙苯吡酮類化合物。芒果苷具有抗病毒、抗癌、免疫調(diào)節(jié)、保肝利膽、止咳平喘等多種生物活性[3-5]。還可用于高血壓的治療，具有降壓及保護(hù)炎癥損傷等作用[6]。為綜合利用遠(yuǎn)志植株資源，本研究采用HPLC液相色譜法、比色法，對遠(yuǎn)志地上部位的芒果苷及總皂苷含量進(jìn)行測定，為遠(yuǎn)志非藥用部分的開發(fā)利用提供參考。

1 材料與試劑

1.1 儀器 Agilent1100高效液相色譜儀(美國Agilent公司)，RPL-D2000柱溫箱(大連日普利科技儀器有限公司)，Cculab Alc-110.4分析天平(德國Sartorius 公司)、CP225D分析天平(德國Sartorius 公司)、TD2002C型電子天平(天津天馬衡基儀器有限公司)、U3010 紫外分光光度計(日本日立公司)、HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋(江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司)。

1.2 試劑與試藥 細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷對照品(批號：141027)、芒果苷對照品(批號：160228)購于成都克洛瑪生物科技有限公司，純度≥98.5%，甲醇(色譜純，天津市大茂化學(xué)試劑廠)，乙腈(色譜純，天津市大茂化學(xué)試劑廠)，水(純凈水，杭州娃哈哈集團公司)，鹽酸(分析純，西隴化工股份有限公司)，磷酸(分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司)，甲醇、鹽酸(分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠)，遠(yuǎn)志地上部位樣品來源于遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院藥用資源苗圃園(遼寧大連，二年期，11月份采收)，見表1。經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)許亮教授、邸學(xué)高級實驗師鑒定，為遠(yuǎn)志科植物遠(yuǎn)志(P.tenuifoliaWilld.)的地上部位。

表1 遠(yuǎn)志植株來源情況

2 方法與結(jié)果

2.1 HPLC測定芒果苷含量

2.1.1 色譜條件 色譜柱：Kromasil ODS色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相：0.05%磷酸乙腈溶液(A)-0.05%磷酸水溶液(B),梯度洗脫：0～12 min: 10%～15%(A), 25～32 min: 22%～45%(A),35 min:12%(A)，柱溫：35 ℃，檢測波長：258 nm，流速1.0 mL/min;進(jìn)樣量：10 μL。色譜圖如圖1所示。

A.對照品；B.供試品；1.芒果苷圖1 高效液相色譜圖

2.1.2 對照品溶液的制備 精密稱取芒果苷對照品適量，加甲醇配制成每1 mL含1.25 mg的對照品溶液，作為對照品儲備液備用。精密稱取對照品儲備液適量，加甲醇配制成每1 mL含0.1 mg的對照品溶液，備用。

2.1.3 供試品溶液的制備 取遠(yuǎn)志地上部位藥材樣品粉末0.1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%乙醇25 mL，超聲處理二次，每次25 min，濾過，合并濾液，減壓濃縮至5 mL左右，定量轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，加50%乙醇定容至刻度。濾過，續(xù)濾液用微孔濾膜(0.45μm)過濾，即得。

2.1.4 線性范圍考察 分別精密吸取芒果苷對照品溶液2 μL、4 μL、6 μL、8 μL、10 μL、12 μL進(jìn)樣，以色譜峰面積Y對芒果苷對照品質(zhì)量X進(jìn)行回歸處理，得回歸方程為：Y=233.69X+33.60，r=0.9991。結(jié)果表明，芒果苷在0.2～1.2 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.5 精密度實驗 精密吸取芒果苷對照品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測得芒果苷色譜峰面積RSD值為2.0%，儀器精密度良好。

2.1.6 穩(wěn)定性實驗 精密吸取同一份遠(yuǎn)志地上部位供試品溶液，按“2.1.1”項下的色譜條件，分別于配制后的0、1、2、3、4、6、8、10 h進(jìn)樣分析，測得色譜峰面積的RSD值為2.4%。結(jié)果表明，供試品溶液在10 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.1.7 重現(xiàn)性實驗 按照“2.1.3”項下方法制備遠(yuǎn)志地上部位供試品溶液6份，按照“2.1.1”項下色譜條件進(jìn)行測定，測得RSD值為2.4%。方法重現(xiàn)性良好。

2.1.8 加樣回收率實驗 采用加樣回收率法，精密稱取已知含量的同一份遠(yuǎn)志地上部位藥材0.05 g，置具塞瓶中，加入相當(dāng)量的芒果苷對照品儲備液。按照“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，再按照“2.1.1”項下色譜條件進(jìn)行測定，計算其加樣回收率。結(jié)果表明本品的平均回收率為104.6%，RSD為2.8%，符合相關(guān)規(guī)定。

2.1.9 樣品含量測定，按“2.1.1”項下色譜條件測定6批樣品，結(jié)果見表2。

表2 遠(yuǎn)志地上部位芒果苷含量測定結(jié)果表

2.2 比色法測定總皂苷含量

2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱定細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷對照品適量，加甲醇配制成每1 mL含0.01 mg的對照品溶液，備用。

2.2.2 樣品測定 精密吸取對照品溶液及供試品溶液適量于試管中，再精密加入5%香草醛-冰醋酸溶液0.2 mL，高氯酸0.8 mL，密塞，60℃水浴加熱15 min,取出，冷卻5 min，加入5 mL冰醋酸稀釋，搖勻，靜置15 min，576 nm處測定吸光度。

2.2.3 供試品溶液的制備 取遠(yuǎn)志地上部位樣品0.1 g，精密稱定，置具塞試管中，精密加入75%乙醇5 mL，超聲處理50 min，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液，備用。

2.2.4 測定波長的選擇 精密吸取對照品溶液及供試品溶液適量，以相應(yīng)試劑為空白溶液；按“2.2.2”項下測定方法，于400～800 nm范圍內(nèi)進(jìn)行掃描。結(jié)果表明，對照品與供試品在576 nm處有最大吸收，故選擇576 nm為測定波長。

2.2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 分別精密吸取細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷對照品溶液5 μL、10 μL、15 μL、20 μL、30 μL、40 μL，按“2.2.2”項下測定方法進(jìn)行測定，以吸光度Y對細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷對照品質(zhì)量X進(jìn)行回歸處理，得回歸方程為：Y=0.0151X-0.0947，r=0.9896。結(jié)果表明，細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷在0.05～0.4 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.6 總皂苷含量測定結(jié)果 按“2.2.2”項下測定方法測定6批樣品，結(jié)果見表3。

表3 遠(yuǎn)志地上部位細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷含量測定結(jié)果表

3 結(jié)論與討論

3.1 色譜條件的優(yōu)化 芒果苷為多羥基酚類化合物，在色譜柱中拖尾嚴(yán)重，但在流動相中加入酸可以明顯減輕該現(xiàn)象，經(jīng)優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)使用0.05% 磷酸溶液作為水相時能夠較好地抑制芒果苷拖尾現(xiàn)象并提高了檢測的靈敏度。此外，本實驗采用了含磷酸乙腈—水溶液梯度洗脫，操作簡便，能夠?qū)崿F(xiàn)遠(yuǎn)志地上部分的快速檢測。在該色譜條件下，芒果苷出峰時間為15 min，測定方法簡便、快速。經(jīng)比較258 nm、320 nm兩個吸收波長，發(fā)現(xiàn)258 nm處有較強的紫外吸收，且峰形較好，基線平穩(wěn)，分離度較高，故選擇258 nm作為檢測波長。

3.2 遠(yuǎn)志地上部位利用 遠(yuǎn)志在安神益智、交通心腎上的功效良好，臨床應(yīng)用十分廣泛，但隨著遠(yuǎn)志需求量日益增加及野生資源日益減少，遠(yuǎn)志在市場中的供需矛盾日益顯現(xiàn)。且栽培遠(yuǎn)志因栽培期長，產(chǎn)量不大，價格較高，極大影響了遠(yuǎn)志成分及提取物的提取生產(chǎn)。而遠(yuǎn)志根莖入藥用，地上部位常被丟棄。遠(yuǎn)志地上部位來源廣，價格便宜，尚未得到充分的利用。因此，遠(yuǎn)志地上部位的開發(fā)逐漸受到關(guān)注。本研究結(jié)果顯示，遠(yuǎn)志的地上部位含有的芒果苷及總皂苷成分，平均含量分別為8.74 mg/g和0.53 mg/g。以芒果苷開發(fā)為例，其降血糖、抗炎、抗動脈粥樣硬化、抗癌等作用，在臨床上可用于糖尿病、急性支氣管炎、癌癥等疾病的預(yù)防與治療，抗氧化作用則可用于抗衰老的保健品或護(hù)膚品的研究開發(fā)。皂苷類成分是遠(yuǎn)志主要活性成分，在祛痰鎮(zhèn)咳、保護(hù)神經(jīng)元、改善學(xué)習(xí)記憶以及保護(hù)心腦血管等方具有良好的藥理活性。以細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷為例，其在實驗中被證實可通過抗Aβ沉積、抗Tau蛋白磷酸化、抑制炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生等生理活性達(dá)到抗癡呆及神經(jīng)保護(hù)方面的作用，具有良好的應(yīng)用前景[7-8]。藥用植物資源的綜合利用也已成為中藥資源可持續(xù)發(fā)展的趨勢，對遠(yuǎn)志地上部位的藥用成分含量研究，能夠為更好的綜合利用遠(yuǎn)志藥材資源提供研究支持。