基質(zhì)金屬蛋白酶9、基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑1在大鼠Ⅲ期、Ⅳ期壓瘡創(chuàng)面組織中的表達(dá)及意義

宋美毅，李 賢

（1.河北醫(yī)科大學(xué)，河北050051；2.河北省人民醫(yī)院）

壓瘡是長期臥床病人常見的難愈性潰瘍之一，此類病人骨隆突處，尤其是骶尾部皮膚和皮下組織長期受壓導(dǎo)致局部組織持續(xù)性缺血、缺氧，并最終引起局限性破損和壞死[1-2]。難愈性潰瘍的形成機(jī)制比較復(fù)雜，有研究表明，基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)過度分泌及持續(xù)性炎癥反應(yīng)是導(dǎo)致壓瘡膠原纖維過度降解的始動因素[3-4]。還有研究顯示壓瘡的形成與基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）和基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑1（TIMP-1）之間失去平衡有關(guān)[5-7]。所以，本研究擬通過動物實(shí)驗(yàn)，觀察對比大鼠Ⅲ期、Ⅳ期壓瘡形成時(shí)創(chuàng)面組織中MMP-9、TIMP-1 的表達(dá)水平及MMP-9/TIMP-1 的比值，明確MMP-9、TIMP-1 表達(dá)水平及MMP-9/TIMP-1 比值與壓瘡發(fā)生的關(guān)系，并探討MMP-9、TIMP-1 表達(dá)水平及MMP-9/TIMP-1 比值與壓瘡損傷程度的關(guān)系，從分子生物水平探討壓瘡發(fā)生發(fā)展機(jī)制，為臨床預(yù)防和治療壓瘡提供新靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與工具 選取清潔級健康雄性SD 大鼠30 只，購自河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，體重（200±20）g，合格證編號：1807223；圓形鐵片（直徑15.0 mm，厚0.3 mm，重0.6 g，高壓滅菌消毒）；圓形磁鐵（直徑15.0 mm，厚5.0 mm，重2.6 g，磁通量高達(dá)1 500 高斯，購自上海江翊機(jī)電設(shè)備有限公司）；MMP-9和TIMP-1 抗體試劑盒（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司）；顯微鏡（型號：NIKON Eclipse ci）；切片成像系統(tǒng)（型號：NIKON digital sight DS-FI2）；Image-Pro Plus 圖像分析系統(tǒng)；扭力天平（型號：TN 100F）；硫酸紙；卡紙等。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組 將30 只雄性SD 大鼠在臨床醫(yī)學(xué)研究中心動物實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)性飼養(yǎng)（飼養(yǎng)溫度20～25 ℃,飼養(yǎng)濕度40%～60%）1 周后,根據(jù)體重大小按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為Ⅲ期壓瘡組和Ⅳ期壓瘡組，每組15只，體重比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

1.3 建立大鼠Ⅲ期、Ⅳ期壓瘡模型 根據(jù)缺血再灌注損傷原理，參照Peirce 等[8-9]埋置鐵片加外用磁鐵加壓的造模方法，制作大鼠壓瘡模型。大鼠禁食禁水8 h 后稱重，按50 mg/kg的劑量腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉大鼠，在大鼠背部正中線左側(cè)臀部備皮，范圍為4 cm×4 cm，用5%聚維酮碘消毒后，切1 個(gè)2 cm 的切口，用鑷子鈍性分離筋膜和組織至露出肌肉，將高壓滅菌后的鐵片置于肌肉下，用4-0 DeXon 聚羥基乙酸線單純間斷縫合切口，再用5%聚維酮碘消毒縫合處以防感染。16～20 h 恢復(fù)期過后，大鼠接受缺血再灌注造模，即在大鼠臀部體外放置磁鐵對局部皮膚、肌肉等組織產(chǎn)生壓力，加壓2 h 后取下磁鐵，恢復(fù)血流半小時(shí)再重復(fù)以上循環(huán)，每天進(jìn)行5 個(gè)循環(huán)，第2 天重復(fù)進(jìn)行。Ⅲ期、Ⅳ期壓瘡模型判斷標(biāo)準(zhǔn)參考黃倩[10]的研究：大鼠受壓處全層傷口失去全層皮膚組織，除了骨、肌腱或肌肉尚未暴露外，可見皮下組織，提示Ⅲ期壓瘡造模成功；大鼠受壓處全層傷口失去全層皮膚組織，損傷深達(dá)肌肉組織，露出鐵片，提示Ⅳ期壓瘡造模成功。

1.4 觀測指標(biāo)和方法

1.4.1 壓瘡形成時(shí)的創(chuàng)面面積 在大鼠Ⅲ期、Ⅳ期壓瘡形成當(dāng)天，分別從兩組中隨機(jī)抓取3 只大鼠。參考張亞楠等[11]的卡紙法測量壓瘡創(chuàng)面面積：從質(zhì)地均勻的卡紙上剪下3 個(gè)不同位置的2 cm×2 cm 的正方形紙片，稱重后計(jì)算出每平方厘米的卡紙重量，再用透明尿酸紙拓出大鼠創(chuàng)面大小后，將透明尿酸紙放到同一卡紙上，畫出創(chuàng)面范圍后沿邊緣剪下稱重，精確到0.000 1 g。最后用畫有創(chuàng)面大小的卡紙重量除以該卡紙每平方厘米的重量，即可得出大鼠壓瘡創(chuàng)面面積。

1.4.2 病理學(xué)改變和MMP-9、TIMP-1 表達(dá)水平 在大鼠Ⅲ期、Ⅳ期壓瘡形成后，從兩組中分別隨機(jī)抓取3只大鼠剖取壓瘡部位組織，經(jīng)4%多聚甲醛溶液固定、脫水、石蠟包埋，制成4 μm 厚的切片，用于病理和免疫組化染色。①病理學(xué)結(jié)果：切片經(jīng)HE 染色后在光學(xué)顯微鏡下觀察病理學(xué)改變。②MMP-9、TIMP-1 表達(dá)水平：切片經(jīng)免疫組化染色（一抗用1∶200 的比例進(jìn)行稀釋）后分別在100 倍、400 倍光鏡下觀察。陽性表達(dá)為組織切片中細(xì)胞胞漿呈現(xiàn)為淡黃色至棕褐色。在400倍光鏡下每張切片隨機(jī)取5 個(gè)視野，用Image-Pro Plus圖像分析軟件，選擇合適的灰度分割閾值，測定切片陽性反應(yīng)物的累積光密度值（IOD 值）及面積（AREA），并求出平均光密度值（AO 值）作為MMP-9、TIMP-1的相對表達(dá)量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用Excel 和SPSS 23.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)錄入和統(tǒng)計(jì)分析,符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。兩組大鼠壓瘡形成當(dāng)天的創(chuàng)面面積及MMP-9、TIMP-1 表達(dá)量比較均進(jìn)行兩獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠Ⅲ期、Ⅳ期壓瘡形成當(dāng)天創(chuàng)面面積比較 Ⅲ期壓瘡的創(chuàng)面面積在壓瘡形成當(dāng)天為（1.71±0.41）cm2，明顯小于Ⅳ期壓瘡（3.08±0.88）cm2，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-5.434，P＜0.001）。

2.2 大鼠Ⅲ期、Ⅳ期壓瘡創(chuàng)面的病理改變 大體觀察大鼠Ⅲ期壓瘡創(chuàng)面可見表皮層大面積壞死脫落，核固縮深染，胞質(zhì)嗜酸性增強(qiáng)，真皮層大面積壞死溶解，并可見少量炎性細(xì)胞浸潤；局部可見大量出血；未見毛囊、皮脂腺等附屬器官。兩組大鼠創(chuàng)面組織病理學(xué)改變詳見圖1。Ⅳ期壓瘡創(chuàng)面病理學(xué)改變較Ⅲ期壓瘡加重，局部可見大面積肌纖維壞死，壞死肌纖維淡染，肌原纖維排列疏松，周圍可見較多的炎性細(xì)胞浸潤，大面積的肌纖維壞死溶解，溶解后被增生的結(jié)締組織取代，增生的結(jié)締組織中也可見彌漫性淋巴細(xì)胞以及單核細(xì)胞浸潤。由圖1 可見兩組壓瘡創(chuàng)面組織均發(fā)生病理學(xué)改變，但Ⅳ期壓瘡創(chuàng)面病理損傷程度更嚴(yán)重。

圖1 大鼠Ⅲ、Ⅳ期壓瘡創(chuàng)面組織病理學(xué)觀察（蘇木精-伊紅×100）

2.3 大鼠Ⅲ期、Ⅳ期壓瘡組織中MMP-9、TIMP-1 的表達(dá)水平及MMP-9/TIMP-1 比值 Ⅲ期壓瘡組織中MMP-9 的蛋白表達(dá)量為（21.17±1.34），Ⅳ期壓瘡組織中MMP-9 的蛋白表達(dá)量為（31.62±2.98），Ⅳ期壓瘡組織中MMP-9 的蛋白表達(dá)量明顯高于Ⅲ期壓瘡組織中的表達(dá)量，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

Ⅲ期壓瘡組織中TIMP-1 的蛋白表達(dá)量為（52.66±3.71），Ⅳ期壓瘡組織中TIMP-1 的蛋白表達(dá)量為（49.86±1.38），TIMP-1 在大鼠Ⅲ期、Ⅳ期壓瘡組織中的蛋白表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。Ⅳ期壓瘡組織中MMP-9/TIMP-1 比值為（0.64±0.07），明顯高于Ⅲ期壓瘡組織中的比值（0.40±0.01），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。大鼠Ⅲ期、Ⅳ期壓瘡組織MMP-9、TIMP-1 及MMP-9/TIMP-1 比較結(jié)果見表1。

表1 Ⅲ期、Ⅳ期壓瘡組織中MMP-9、TIMP-1 蛋白表達(dá)量及MMP-9/TIMP-1 比較(±s)

表1 Ⅲ期、Ⅳ期壓瘡組織中MMP-9、TIMP-1 蛋白表達(dá)量及MMP-9/TIMP-1 比較(±s)

組別Ⅲ期壓瘡組Ⅳ期壓瘡組t 值P MMP-9 21.17±1.34 31.62±2.98-5.536 0.005 TIMP-1 52.66±3.71 49.86±1.38 1.228 0.287 MMP-9/TIMP-1 0.40±0.01 0.64±0.07-5.623 0.005

2.4 大鼠Ⅲ期、Ⅳ期壓瘡創(chuàng)面組織MMP-9、TIMP-1 免疫組化染色表達(dá)情況（見圖2、見圖3）

圖2 大鼠Ⅲ期、Ⅳ期壓瘡創(chuàng)面組織MMP-9 免疫組化染色（二氨基聯(lián)苯胺-蘇木精×100）

圖3 大鼠Ⅲ期、Ⅳ期壓瘡創(chuàng)面組織TIMP-1 免疫組化染色（二氨基聯(lián)苯胺-蘇木精×100）

3 討論

3.1 大鼠Ⅲ期、Ⅳ期壓瘡創(chuàng)面面積及病理學(xué)比較 本研究結(jié)果顯示，Ⅳ期壓瘡創(chuàng)面的病理損傷程度明顯重于Ⅲ期壓瘡，且Ⅳ期壓瘡創(chuàng)面面積大于Ⅲ期壓瘡，說明隨著壓瘡分期的進(jìn)展，組織病理損傷越重，創(chuàng)面面積越大，壓瘡向不可逆損傷發(fā)展，越不易愈合。

3.2 MMP-9、TIMP-1 在Ⅲ期、Ⅳ期壓瘡組織中的表達(dá)及在壓瘡發(fā)生過程中的作用機(jī)制

3.2.1 MMP-9 在Ⅲ期、Ⅳ期壓瘡組織中的表達(dá)及在壓瘡發(fā)生過程中的作用機(jī)制 MMPs 是一種鋅依賴性內(nèi)肽酶，在中性pH 狀態(tài)下降解幾乎所有的細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜蛋白[12]，其中MMP-9 分子量最大，在細(xì)胞中普遍存在，比如巨噬細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等[13]。MMP-9 具有降解細(xì)胞外基質(zhì)的作用[14]，而細(xì)胞外基質(zhì)在正常組織的重塑、修復(fù)以及病理生理的過程中發(fā)揮重要作用[13]。本研究結(jié)果顯示，Ⅳ期壓瘡組織中MMP-9 的表達(dá)水平明顯高于Ⅲ期壓瘡，說明隨著壓瘡嚴(yán)重程度的加深，MMP-9 的含量也隨之升高，提示MMP-9 表達(dá)越高，越不利于創(chuàng)面愈合，甚至?xí)?dǎo)致壓瘡進(jìn)一步向不可逆方向進(jìn)展。時(shí)紅梅等[13]的研究同樣顯示，壓瘡病人的創(chuàng)面越嚴(yán)重，MMP-9 的含量就越高，創(chuàng)口就更難愈合，與本研究結(jié)果及結(jié)論一致。由此推測，MMP-9 在壓瘡發(fā)生過程中發(fā)揮重要機(jī)制，組織中MMP-9 的表達(dá)越高，提示發(fā)生壓瘡損傷程度越重。

3.2.2 TIMP-1 在Ⅲ期、Ⅳ期壓瘡組織中的表達(dá)及在壓瘡發(fā)生過程中的作用機(jī)制 TIMPs 具有抑制MMPs 活性、刺激細(xì)胞分裂、結(jié)合細(xì)胞外基質(zhì)、抑制血管形成、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的生物功能[13]。TIMP-1 是TIMPs 家族中的一種可溶性糖蛋白，主要由巨噬細(xì)胞和結(jié)締組織細(xì)胞分泌，在體內(nèi)分布廣泛，與MMP-9 的催化區(qū)以1∶1 可逆性結(jié)合，抑制MMP-9 的活性[15]。本研究結(jié)果顯示，TIMP-1 在Ⅳ期壓瘡組織中表達(dá)水平為（49.86±1.38），較 低 于Ⅲ期 壓 瘡 組 織（52.66±3.71），但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。兩組大鼠創(chuàng)面組織中TIMP-1 均處于較低水平，說明隨著壓瘡嚴(yán)重程度的加深，MMP-9 的表達(dá)上調(diào)，沒有足夠的TIMP-1 來結(jié)合高水平的MMP-9，導(dǎo)致組織中基質(zhì)過度分解，皮膚組織結(jié)構(gòu)的完整性受到破壞，內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)被打破，從而使壓瘡向更深程度發(fā)展。

3.2.3 MMP-9/TIMP-1 比值在Ⅲ期、Ⅳ期壓瘡組織中的表達(dá)及在壓瘡發(fā)生過程中的作用機(jī)制 在生理狀態(tài)下MMP-9 與TIMP-1 之間保持著動態(tài)平衡，協(xié)調(diào)細(xì)胞外基質(zhì)降解與重建，維持組織結(jié)構(gòu)的完整和內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，當(dāng)MMP-9/TIMP-1 的比值越高，組織出現(xiàn)過度降解的程度越重[16]。在本研究中，MMP-9/TIMP-1 比值在Ⅳ期壓瘡組織中明顯高于Ⅲ期壓瘡，說明壓瘡損傷程度越重，MMP-9/TIMP-1 比值越高。MMP-9 長期處于高表達(dá)的狀態(tài)，TIMP-1 表達(dá)缺乏，使MMP-9/TIMP-1 比值失衡，會引起局部受壓組織中的膠原、彈性蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)成分發(fā)生大量降解，皮膚、肌肉組織抵抗能力下降，進(jìn)而造成壓瘡的發(fā)生發(fā)展。張亞楠等[17]的研究同樣發(fā)現(xiàn)MMP-9/TIMP-1 的比例失衡是促進(jìn)壓瘡發(fā)生發(fā)展的重要因素。

3.3 MMP-9/TIMP-l 有望成為治療壓力性潰瘍的新靶點(diǎn) 本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著壓瘡組織損傷程度加深，組織中MMP-9 表達(dá)上調(diào)、MMP-9/TIMP-1 比值增高，而TIMP-1 表達(dá)水平幾乎沒有發(fā)生變化，臨床中是否可通過外用TIMP-1 來重新使MMP-9/TIMP-1 處于平衡狀態(tài)，阻止壓瘡組織中MMP-9 的水平過高而阻礙細(xì)胞外基質(zhì)降解，阻止細(xì)胞凋亡發(fā)生，從而逆轉(zhuǎn)壓瘡組織不可逆損傷，阻止壓瘡向更深程度的發(fā)展，促進(jìn)早期壓瘡的愈合。王越等[15]的研究同樣發(fā)現(xiàn)，滲出液中過高的MMP-9 表達(dá)水平及MMP-9/TIMP-1 比值不利于壓瘡的愈合，并且提出將MMP-9 表達(dá)水平及MMP-9/TIMP-1 比值作為預(yù)測創(chuàng)面愈合的一個(gè)評估指標(biāo)。所以，在下一步的研究中，應(yīng)積極探索MMP-9/TIMP-l 比值作為治療壓瘡新靶點(diǎn)的臨床實(shí)用價(jià)值。

4 小結(jié)

綜上所述，MMP-9 表達(dá)水平和MMP-9/TIMP-1比值在大鼠Ⅳ期壓瘡組織中表達(dá)明顯高于Ⅲ期壓瘡，說明隨著壓瘡損傷程度的加重和壓瘡分期的提高，MMP-9 的表達(dá)水平和MMP-9/TIMP-1 比值也隨之提高。MMP-9 和MMP-9/TIMP-1 比值與壓瘡損傷程度及分期有關(guān)，MMP 及其抑制劑的代謝平衡在壓瘡發(fā)生機(jī)制及損傷分期中起重要作用，調(diào)整MMP-9/TIMP-l比值有望成為治療壓力性潰瘍的新靶點(diǎn)。