穴位強化埋線療法對STC患者直腸組織中ICC和神經(jīng)元細(xì)胞的調(diào)節(jié)

謝振年 安曉靜 楊斌 李東冰 王芳麗 苗春紅 冷濤 賈小強 趙衛(wèi)兵 曹威巍 權(quán)隆芳 原小千 崔春暉

摘要?目的：探究穴位強化埋線療法對慢傳輸型便秘（STC）直腸組織中ICC細(xì)胞和神經(jīng)元的調(diào)節(jié)。方法：選擇STC患者41例，非便秘患者41例，分別設(shè)置為觀察組和對照組。觀察組給予穴位強化埋線療法，對照組未給予便秘相關(guān)治療。比較觀察組治療前后直腸組織中ICC細(xì)胞形態(tài)、相關(guān)蛋白干細(xì)胞因子（STem Cell FacTor，SCF）和c-kit mRNA的表達水平和神經(jīng)元凋亡情況。結(jié)果：觀察組患者經(jīng)穴位強化埋線治療后直腸組織中ICC細(xì)胞的數(shù)量較治療前增加，且形態(tài)趨于正常。與對照組比較，SCF和c-kit mRNA在治療前直腸組織中的表達明顯降低（P<0.05，P<0.01），而在治療后直腸組織中的表達要高于治療前（P<0.01）。治療前，觀察組患者直腸組織內(nèi)神經(jīng)元凋亡數(shù)量多于對照組（P<0.01）。治療后患者直腸組織內(nèi)凋亡細(xì)胞明顯減少，與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論：穴位強化埋線可改善STC患者直腸組織中ICC細(xì)胞的損傷，并減少神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡發(fā)生，從而改善便秘癥狀。

關(guān)鍵詞?穴位強化埋線;慢傳輸型便秘;Cajal間質(zhì)細(xì)胞;干細(xì)胞因子

Academy of Traditional Chinese Medicine， Beijing 100091， China; 3 Department of General Surgery， Aerospace Center Hospital， Beijing 100083， China; 4 Beijing Anorectal Hospital， Beijing， 102401， China; 5 Department of Anorectal Surgery， Pinggu District Hospital of Traditional Chinese Medicine， Beijing 101200， China）

Abstract?Objective：To explore the regulation of acupoint intensive catgut embedding therapy on ICC cells and neurons in rectal tissue of slow transit constipation （STC）. Methods：A total of 41 STC patients and 41 non-constipation patients were selected as the observation group and control group， respectively. The patients in treatment group were given acupoint intensive catgut embedding therapy， while the control group did not receive any constipation related treatment. The morphological of ICC and the expression of SCF and c-kit on RNA were compared before and after treatment in the treatment group. Results：The number of ICC in the rectum tissue increased with the normal morphology after treatment. Compared with the control group， both SCF mRNA and c-kit mRNA in the rectum were significantly lower without treatment （P<0.05， P<0.01）. The expression in rectal tissue after treatment was higher than before treatment （P<0.01）. Before treatment， the number of neuronal apoptosis in the rectal tissue of the observation group was more than that of the control group （P<0.01）. After treatment， the apoptotic cells in the rectal tissue of the patients were significantly reduced， which was significantly different from the control group （P<0.05）. Conclusion：Acupoint intensive catgut embedding therapy can improve the injury of ICC cells in rectal tissues of STC patients， reduce the apoptosis of neuron cells and improve the symptoms of constipation.

Keywords?Acupoint intensive catgut embedding; Slow transit constipation; Interstitial cells of Cajal; Stem cell factor

中圖分類號：R266;R245.9+1文獻標(biāo)識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.19.025

資料顯示全球成人慢性便秘發(fā)病率為2.5%～79%[1]，而在我國發(fā)病率約為6%。其中慢傳輸型便秘（Slow Transit Constipation，STC）占所有類型便秘的16%～40%，約占功能性便秘的45.5%[2]。對于STC的治療目前仍以對癥治療為主，尚無其他有效方法。STC的發(fā)病機制尚不明確。多數(shù)研究認(rèn)為位于腸道肌層內(nèi)的Cajal間質(zhì)細(xì)胞（Interstitial Cells of Cajal，ICC）是一種發(fā)揮起搏作用的細(xì)胞，維持了胃腸動力[3]。現(xiàn)代研究顯示干細(xì)胞因子（STem Cell FacTor，SCF）/c-kit信號通路對維持ICC的正常功能中發(fā)揮重要作用[4]。我們臨床上采用穴位強化埋線治療STC，取得較好的療效[5-6]。因此，本文就穴位強化埋線是否通過SCF/c-kit信號通路調(diào)節(jié)了ICC的功能展開研究。

1?材料與方法

1.1?一般資料?選取2011年4月至2013年4月中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院收治的符合納入標(biāo)準(zhǔn)和排除標(biāo)準(zhǔn)的慢傳輸型便秘患者和非便秘患者82例作為研究對象，按照隨機對照方法分為對照組（非便秘組）和觀察組（慢傳輸型便秘組），每組41例，對照組中男2例，女39例，年齡38～74歲，平均年齡（56.75±10.01）歲，病程2～38年，平均病程（37.87±11.69）歲;觀察組中男1例，女40例，年齡35～72歲，平均年齡（55.53±9.83）歲，病程1～40年，平均病程（38.56±12.87）年。2組患者一般資料比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。此研究方案已通過中國中醫(yī)科學(xué)院倫理委員會批準(zhǔn)（倫理審批號：2010XL072-2）。

1.2?納入標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1?對照組納入標(biāo)準(zhǔn)?1）年齡在30～75歲之間;2）意識清楚，配合治療;3）心血管和腦血管疾病、代謝疾病和其他系統(tǒng)性疾病處于穩(wěn)定期;4）簽訂知情同意書。

1.2.2?觀察組納入標(biāo)準(zhǔn)?符合對照組納入標(biāo)準(zhǔn)的同時，符合按照羅馬III結(jié)腸慢傳輸性便秘的診斷標(biāo)準(zhǔn);已停止參加其他便秘的臨床試驗1個月以上。

1.3?排除標(biāo)準(zhǔn)?1）出口梗阻型及混合型便秘患者;2）嚴(yán)重臟器功能障礙和嚴(yán)重糖尿病者;3）孕婦和哺乳期婦女;4）獨立活動嚴(yán)重受限患者;5）腸道器質(zhì)性梗阻或伴腸道運動異常的其他疾病患者。

1.4?治療方法

1.4.1?對照組?未給予治療便秘的干預(yù)措施。

1.4.2?觀察組?1）穴位處方：天樞、氣海透關(guān)元透中極、大腸俞、足三里（腧穴定位依據(jù)2000年孫國杰主編的第六版教材《針灸學(xué)》）;2）穴位強化埋線的概念：選用雙股可吸收羊腸線（吸收慢、體積大）（山東博達醫(yī)療用品有限公司，型號：2號），每股羊腸線長度在4 cm左右，在同一穴位重復(fù)埋線3次。埋線深度要求達到肌層，目的是加強對穴位的刺激作用，故將此操作方法稱之為穴位強化埋線。3）具體操作方法：常規(guī)碘伏（北京洗得寶消毒制品有限公司，20120603）消毒后，采用局部麻醉的方法，利用硬膜外穿刺針將長約4 cm的羊腸線1根埋入足三里穴約5 cm，再用醫(yī)用縫合針（規(guī)格為13 mm×55 mm）將長約4 cm的雙股羊腸線埋入上述其余穴位肌層中并重復(fù)埋線3次，線體不可外露，局部敷料包扎。

1.5?標(biāo)本采取?1）對照組：非便秘同時合并混合痔的患者采用吻合器技術(shù)采取直腸組織標(biāo)本。同一患者術(shù)后1個月來院復(fù)查用活檢鉗鉗取的直腸組織標(biāo)本。上述新鮮組織取下后即置入液氮冷凍。2）觀察組：治療前采用吻合器技術(shù)采取直腸組織標(biāo)本。同一患者術(shù)后1個月來院復(fù)查用活檢鉗鉗取的直腸組織標(biāo)本。上述新鮮組織取下后即置入液氮冷凍。

1.6?實驗試劑和儀器?1）試劑：二甲苯（淄博經(jīng)貿(mào)有限公司，批號：20120613）、無水乙醇（北京貞玉民生藥業(yè)有限公司，批號：201502014）、TRizol（百奧思科，批號：MD959-020）、氯仿（百奧思科，批號：MD4620-020）、異戊醇（百奧思科，批號：MD1962-020）、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（康為世紀(jì)，批號：CW2391）、細(xì)胞凋亡試劑盒（欣博盛，批號：FAK011.100）。2）儀器：低溫高速離心機（日立，日本，型號：CF16RXⅡ），型電泳儀（上海巴玖實業(yè)有限公司，型號：DYY-6C），PCR儀（伯樂，美國，型號：T100），超低溫冰箱（三洋，日本，型號：55700-159），烤片機（徠卡，德國，型號：HI1220），正置顯微鏡（Olympus公司，型號：BX51）等。

1.7?觀察時間和指標(biāo)

1.7.1?觀察時間?林琳等[2]報道，慢傳輸運動小鼠腸組織中Cajal間質(zhì)細(xì)胞等指標(biāo)在45 d時變化最為明顯。我們自2002年開始系統(tǒng)觀察慢傳輸型便秘患者，發(fā)現(xiàn)在治療后1個月時患者的臨床療效最為穩(wěn)定[7]。前期經(jīng)穴位強化埋線治療的15例STC患者的病理觀察發(fā)現(xiàn)在治療1個月時Cajal間質(zhì)細(xì)胞數(shù)量有明顯增加。基于以上依據(jù)我們把觀察時間定為1個月。

1.7.2?ICC的分布及形態(tài)變化?取石蠟切片，70 ℃加熱30 min，新鮮二甲苯Ⅰ、Ⅱ各浸泡15 min脫蠟。將切片依次在無水乙醇、85%乙醇、75%乙醇、蒸餾水中浸泡5 min，高溫高壓抗原修復(fù)2.5 min。3%H2O2浸泡10 min消除內(nèi)源性過氧化物酶，然后放入正常山羊血清37 ℃封閉30 min后，分別加入一抗、二抗試劑進行孵育。DAB顯色后，再進行蘇木素復(fù)染：1%鹽酸乙醇分化后，再將切片依次在75%乙醇、85%乙醇、無水乙醇中梯度脫水;隨后二甲苯Ⅰ、Ⅱ各浸泡5 min，封片后顯微鏡觀察。

1.7.3?ICC的數(shù)量變化?經(jīng)正常山羊血清37 ℃封閉30 min，去封閉液，加PBS稀釋好的一抗，放濕盒中4 ℃過夜。1×PBS清洗3 min×3次，加二抗試劑，37 ℃孵育20 min。加熒光二抗，1×PBS清洗3 min×3次。DAPI復(fù)染10 min，1×PBS清洗3 min×3次。滴加防熒光淬滅劑封片，用熒光顯微鏡拍照觀察。

1.7.4?直腸組織中的c-kit及SCFmRNA表達變化?將獲取的直腸組織冷凍標(biāo)本（約50 mg），手工研磨至粉末狀;轉(zhuǎn)入RNA專用的1.5 mL EP管中，每管加入1 mL trizol液，在室溫中靜置約30 min。提前講低溫離心機預(yù)冷，將上述準(zhǔn)備的EP管放入離心機中（4 ℃，12 000 r/min，離心半徑5 cm）離心5 min，講EP管取出。轉(zhuǎn)移EP管中上清液至另外準(zhǔn)備的EP管中，按0.2 mL/1 mL比例加入氯仿。同樣放入低溫離心機（4 ℃，12 000 r/min，離心半徑5 cm）離心15 min。再次將上層液體轉(zhuǎn)移至EP管中，再等體積加入異丙醇，上下顛倒混勻。再次同樣條件離心15 min，棄上清。隨后加入1 mL 75%乙醇（提前預(yù)冷），充分洗滌沉淀，離心5 min，棄去上清，留沉淀。將反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA溶液進行按需稀釋。加入引物，進行熒光定量PCR檢測。

1.7.5?直腸組織中的神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的檢測?取石蠟切片，70 ℃加熱30 min，新鮮二甲苯Ⅰ、Ⅱ各浸泡15 min脫蠟;將切片依次在無水乙醇、85%乙醇、75%乙醇、蒸餾水中浸泡5 min水化;按照凋亡試劑盒說明書進行，并用DAPI復(fù)染細(xì)胞核;滴加防熒光淬滅劑封片，熒光顯微鏡觀察拍照。

1.8?統(tǒng)計學(xué)方法?采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料采用（±s）表示，組間比較采用2個獨立樣本t檢驗，組內(nèi)比較采用配對t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2?結(jié)果

2.1?ICC的分布及形態(tài)變化?顯微鏡下觀察以細(xì)胞呈現(xiàn)棕黃色定義為c-kit蛋白表達陽性。病理形態(tài)學(xué)顯示ICC呈紡錘樣或衛(wèi)星樣，帶有細(xì)長突起，核呈卵圓形。免疫組化顯示，與對照組比較，觀察組治療前ICC突起減少，細(xì)胞變圓，黏膜下層及肌層中ICC數(shù)目均減少。治療后，觀察組ICC突起較前增多，細(xì)胞變細(xì)長，黏膜下層及肌層中ICC數(shù)目增多。見圖1。

2.2?ICC的數(shù)量變化?免疫熒光染色結(jié)果顯示黃綠色熒光為c-kit蛋白陽性。結(jié)果表明，與對照組比較，觀察組治療前ICC數(shù)目明顯減少，治療后，觀察組ICC數(shù)目較前明顯增多。見圖2。

2.3?直腸組織中的c-kit及SCF mRNA表達變化?治療前，觀察組c-kit mRNA及SCF mRNA表達均明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01，P<0.05）。治療后1個月，觀察組c-kit mRNA及SCF mRNA表達較前增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。見表1。

2.4?直腸神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡檢測?按照試劑盒說明書，Tunel標(biāo)記的細(xì)胞中有黃綠色顆粒者為陽性細(xì)胞，即凋亡的細(xì)胞。治療前，觀察組患者直腸組織內(nèi)可見凋亡細(xì)胞明顯多于對照組（P<0.01）。治療后1個月，觀察組患者直腸組織內(nèi)凋亡細(xì)胞明顯減少，與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），但對照組治療前后無明顯變化，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見圖3，表2。

3?討論

STC患者常表現(xiàn)為大便次數(shù)減少、無便意、排便困難和排便不盡感等。此類患者癥狀反復(fù)發(fā)作，經(jīng)久不愈，已成為影響人們生命質(zhì)量的重要因素之一[8]。STC發(fā)病機制尚不清，目前STC的機制研究主要集中在SCF/c-kit信號通路、腸神經(jīng)系統(tǒng)、水蛋白通道和胃腸激素變化等方面[9]。由于ICC細(xì)胞是胃腸道平滑肌運動的起搏細(xì)胞，加之其也是影響胃腸動力的重要細(xì)胞，所以ICC功能及形態(tài)的變化和SCF/c-kit信號通路與便秘關(guān)系研究較多，但穴位強化埋線療法是否也是調(diào)節(jié)了SCR/c-kit信號通路，影響了ICC的功能而發(fā)揮作用呢？

c-kit（酪氨酸激酶受體）是ICC細(xì)胞的特異性標(biāo)志物，c-kit相對應(yīng)的配體：SCF對ICC的生長、發(fā)育和成熟均具有調(diào)控作用[9-10]。SCF/c-kit信號通路是由干細(xì)胞因子SCF及其天然配體酪氨酸激酶受體c-kit構(gòu)成。SCF活化c-kit受體，隨后c-kit和SCF形成二聚體，從而活化細(xì)胞內(nèi)的酪氨酸激酶及磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）。隨之激活多條信號通路，參與ICC的增殖、分化和表型的維持等[11]。相關(guān)研究表明，任何導(dǎo)致c-kit或SCF表達下降及相應(yīng)的信號通路受阻的致病因素均可能引發(fā)ICC表型發(fā)生轉(zhuǎn)化，而失去相應(yīng)的功能，導(dǎo)致形態(tài)及功能異常[12]。有文獻報道在小鼠體內(nèi)，編碼c-kit基因發(fā)生突變及編碼kit配體干細(xì)胞因子的sl位點發(fā)生突變均可引起腸道ICC缺失[13]和腸道慢波的消失。有學(xué)者報道c-kit mRNA的表達和c-kit蛋白在STC患者結(jié)腸組織中明顯減少[14]。提示SCF/c-kit信號通路對ICC生理功能的維持中具有重要的作用。

穴位埋線是基于“久病者，邪氣入深，刺此病者，深納而久留之”的理論基礎(chǔ)上發(fā)展的一種新型的穴位刺激療法。該方法起于20世紀(jì)60年代。而我們的穴位強化埋線療法是在傳統(tǒng)埋線的基礎(chǔ)上加以改進和創(chuàng)新。我們用大號醫(yī)用縫合針將雙股2號羊腸線縫合進相應(yīng)的穴位并達肌層，每一穴位同時埋線3次，使其閾值迅速達到，充分體現(xiàn)了“深納而久留之，以治頑疾”的思想。穴位強化埋線過程包含了穴位封閉術(shù)、針刺療法、刺血療法、組織療法和割治治療，同時由于埋線較長時間埋入穴位所帶來的埋針效應(yīng)及后作用效應(yīng)，本方法將多種治療手段和效應(yīng)集中和整合起來，形成了穴位強化埋線獨特的治療效果。