附子理中湯對非酒精性脂肪性肝炎大鼠內毒素及其受體的影響

付勇剛 楊家耀

摘要?目的：探究附子理中湯對非酒精性脂肪性肝炎大鼠內毒素及其受體的影響。方法：將75只SD雄性大鼠隨機分為3組，分別為正常組，模型組，附子理中湯觀察組。采用腹主動脈取血法，收集血液后離心取上清，通過雙抗體夾心法檢測腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和鱟合成基質顯色法檢測內毒素表達水平;免疫組織化學法檢測肝組織內CD14表達水平，并利用逆轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）法檢測Toll樣受體-4（TLR-4）與TNF-α mRNA表達水平。結果：與正常組比較，模型組TNF-α水平顯著提高，且在第12～24周內持續(xù)維持較高水平;附子理中湯觀察組TNF-α水平較模型組顯著降低，但仍高于正常組;正常組大鼠肝臟TNF-α mRNA未見其表達，模型組TLR4和TNF-α mRNA表達量均顯著升高。與模型組比較，附子理中湯觀察組TLR4和TNF-α mRNA顯著低于模型組，但仍高于正常組TLR4和TNF-α mRNA表達;正常組只有少量細胞能夠表達CD14。與正常組比較，模型組大鼠肝組織在第12～24周內，CD14表達的陽性細胞數(shù)持續(xù)升高，在24周時略有降低，而附子理中湯觀察組CD14表達的陽性細胞數(shù)與模型組比較顯著減少。結論：附子理中湯可降低非酒精性脂肪性肝炎大鼠內毒素及其受體表達。

關鍵詞?附子理中湯;非酒精性脂肪性肝炎;內毒素;Toll樣受體-4;腫瘤壞死因子-α;CD14;信使核糖核酸;逆轉錄-聚合酶鏈反應;雙抗體夾心法;免疫組織化學法

Abstract?Objective：To explore the effects of Fuzi Lizhong Decoction on endotoxin and its receptor in rats with nonalcoholic steatohepatitis.Methods：A total of 75 SD male rats were randomly divided into 3 groups：a normal group，a model group and a treatment group with Fuzi Lizhong Decoction.Abdominal aortic blood sampling method was used，blood was collected and centrifuged to take supernatant，and the expression level of endotoxin was detected by double antibody filling method to detect tumor necrosis factor alpha（TNF-α）and Limulus synthetic matrix color method was used to detect endotoxin expression; immunohistochemical method was used to detect the expression level of CD14 in liver tissues，and the reverse transcription-polymerase chain reaction（RT-PCR）method was used to detect the expression levels of Toll-like receptor-4（TLR-4）and TNF-α mRNA.Results：Compared with the normal group，the level of TNF-α in the model group increased significantly，and continued to maintain a high level during the 12th to 24th weeks; the level of TNF-α in the Fuzi Lizhong Decoction was significantly lower than that in the model group，but it was still higher than that in the normal group.The expression of TNF-α mRNA in liver of normal group rats was not found，and the expression levels of TLR4 and TNF-α mRNA in model group were significantly increased.Compared with the model group，the TLR4 and TNF-α mRNA of the Fuzi Lizhong Decoction group were significantly lower than the model group，but it was still higher than TLR4 and TNF-α mRNA expression in the normal group; only a small number of cells in the normal group were able to express CD14.Compared with the normal group，the number of CD14-expressing positive cells in the model group′s liver tissue continued to increase from 12 to 24 weeks，and slightly decreased at 24 weeks，while the number of CD14-expressing positive cells in the Fuzi Lizhong Decoction group significantly reduced compared with the model group.Conclusion：Fuzi Lizhong Decoction can reduce the expression of endotoxin and its receptor in non-alcoholic steatohepatitis rats.

Keywords?Fuzi Lizhong Decoction; Nonalcoholic steatohepatitis; Endotoxin; Toll-like receptor4; Tumor necrosis factor-α; CD14; Messenger RNA; Reverse transcription-polymerase chain reaction; Double antibody filling method; Immunohistochemical method

中圖分類號：R289.4文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.19.009

非酒精性脂肪性肝炎（Nonalcoholic Steatohepatitis，NASH）是指沒有飲酒史，非肝炎病毒誘導的一類與酒精性脂肪肝炎具有相似的病理特征的一種疾病[1]。接近15%的非酒精性脂肪性肝炎可出現(xiàn)肝纖維化，10年病程的患者可發(fā)生肝硬化及肝衰竭，嚴重可致肝細胞癌[2]。非酒精性脂肪性肝炎的發(fā)病機制盡管尚未完全明確，但認為與脂質代謝紊亂、炎性反應及胰島素抵抗緊密相關。研究顯示非酒精性脂肪性肝炎患者均伴有不同程度的腸源性內毒素血癥，內毒素穿透細胞腸壁屏障，與脂多糖結合蛋白（Lipopolysaccharide Binding Protein，LBP）結合后輸送至肝臟，隨之由庫普弗（Kupffer）細胞清除[3-4]，同時肝臟固有免疫病原識別受體Kupffer細胞表面4型Toll樣受體-4（Toll-like Receptor4，TLR-4）被激活，誘導腫瘤壞死因子α（Tumor Necrosis Factor-α，TNF-α）、白細胞介素1β（Interleukin-1β，IL-1β）等炎性反應遞質生成與釋放，其中TNF-α結合TNF-α受體，可對肝細胞具有直接的毒性作用，可促使肝細胞壞死或凋亡，同時能趨化細胞內的中性粒細胞發(fā)生浸潤釋放自由基，誘導細胞損傷[5-7]。內毒素受體亞型中CD14的功能作用最突出。目前治療非酒精性脂肪性肝炎尚無特效藥，西藥治療非酒精性脂肪性肝炎多以保肝為主，且長期服藥也存在不良反應。中醫(yī)在非酒精性脂肪性肝炎通過辨證施治獲得了良好的效果，附子理中湯來源于宋代陳言所著的《三因極一病證方論》，臨床主要用于治療存在炎性反應的胃潰瘍[8]或慢性結腸炎[9]，我們將附子理中湯治療非酒精性脂肪性肝炎獲得了良好的效果，減輕重型肝炎患者的脾陽虛等現(xiàn)象，但治療的機制尚不明確，且近年來有較多的機制研究顯示中藥治療非酒精性脂肪性肝炎是與調控外周血或肝組織TLR4、TNF-α及CD14表達有關[10]。本研究通過研究附子理中湯對高脂誘導的非酒精性脂肪性肝炎大鼠肝組織TLR4、TNF-αmRNA及CD14表達等相關指標的影響，探究附子理中湯對非酒精性脂肪性肝炎大鼠的可能機制?，F(xiàn)將結果報道如下。

1?材料與方法

1.1?材料

1.1.1?動物

選取SD雄性大鼠，2月齡，200～220 g，購自北京動物醫(yī)學院。實驗時動物房保持12 h光照與黑暗交替，相對濕度60%左右，室溫保持在22 ℃左右，各組大鼠均可自由飲水、采食。

1.1.2?藥物

附子理中湯（人參10 g、白術15 g、干姜10 g、制附子10 g、炙甘草3 g），自制，加入5倍藥材的純凈水，浸泡30 min，大火煮沸，40 min，加入生姜10 g，連續(xù)煎煮2次，合并煎液，濃縮至相當于10 g生藥/mL，即得。

1.1.3?試劑與儀器

Toll樣受體-4（Toll-like Receptor4，TLR-4）與TNF-α上下游引物由北京的天根有限公司合成;高脂飼料（2%膽固醇，10%豬油，普通飼料）（自制）;水合氯醛（化學純，北京化工廠，批號：019663）;石蠟（化學純，北京化工廠，批號：020016）、β-actin（南京建成生物工程研究所，貨號：X1546）;顯色基質鱟試劑盒（廈門市鱟試劑實驗廠有限公司，貨號：020106）;大鼠CD14免疫組織化學試劑盒、TNF-α和內毒素酶聯(lián)免疫吸附試驗法（ELISA）試劑盒均購自武漢的默沙克生物科技有限公司，貨號為020117、019608、020152。c1000型PCR儀（Bio-rad公司，美國，貨號：c1000）;Multiskan Sky全波長酶標儀（Thermo公司，美國，貨號：51119570）;ME104E ME204E型萬分之一電子天平（美國梅特勒-托利多集團，美國，貨號：ME204）;VCM-3558型輪轉式石蠟切片機（新鄉(xiāng)市維克科教儀器有限公司，貨號：VCM-3558）。

1.2?方法

1.2.1?分組與模型制備

將75只SD雄性大鼠隨機分為3組，分別為正常組，模型組，附子理中湯觀察組。其中模型組和藥物觀察組喂食高脂飼料（2%膽固醇，10%豬油，普通飼料），正常組喂食普通飼料。

1.2.2?給藥方法

附子理中湯觀察組喂食高脂飼料的同時，每天定時灌胃附子理中湯。正常組，模型組每天定時灌胃生理鹽水。

1.2.3?檢測指標與方法

分別在第8、12、16周各取3只大鼠處死，24周后將其全部處死取材，并在大鼠處死前隔夜禁食。1）TNF-α和內毒素表達水平：使用10%水合氯醛將大鼠麻醉后，采用腹主動脈取血法獲得2 mL全血，3 500 r/min，離心半徑8 cm，4 ℃條件下離心15 min，轉移上清液至新的離心管中，置于-80 ℃保存。TNF-α使用雙抗體夾心法，內毒素檢測采用鱟合成基質顯色法進行檢測。采用免疫組織化學法檢測肝組織內CD14表達水平：10%水合氯醛將大鼠麻醉后，解剖其腹部，使肝組織暴露，剪取適當組織置于固定液中保存。固定2 h后進行脫水包埋，對包埋組織進行石蠟切片，隨即常規(guī)脫蠟，通過抗原修復，抗體孵育后，進行常規(guī)脫水和透明，封片待用。根據(jù)視野下觀察計數(shù)，讀取其陽性細胞數(shù)。采用逆轉錄-聚合酶鏈反應（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR）檢測Toll樣受體-4（TLR-4）與TNFα mRNA表達水平：使用TRizol法進行肝組織RNA提取，提取后的RNA立即進行RNA反轉錄，獲得CDNA。取適量CDNA，以β-actin為內參，對TLR4和TNFα基因進行擴增。根據(jù)設定參數(shù)進行引物擴增，擴增體系為：CDNA 7.5，加樣緩沖液1.5倍，進行20 g/L瓊脂糖凝膠電泳，并通過RT-PCR儀獲得擴增情況，從而計算相關基因的mRNA相對表達量，引物及序列見表1。

1.3?統(tǒng)計學方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)，計量資料用均數(shù)標準（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，2組間比較采用SNK檢驗，多組間計量資料的比較采用方差分析，計算F值。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2?結果

2.1?附子理中湯對非酒精性脂肪性肝炎大鼠血清內TNF-α水平的影響

與正常組比較，模型組TNF-α水平顯著提高，且在第12～24周內持續(xù)維持較高水平;附子理中湯觀察組TNF-α水平較模型組顯著降低，但仍高于正常組。見表2。

2.2?附子理中湯對非酒精性脂肪性肝炎大鼠肝臟內TLR4和TNF-α mRNA表達的影響

正常組大鼠肝臟TNF-α mRNA未見其表達，模型組TLR4和TNF-α mRNA表達量均顯著升高。與模型組比較，附子理中湯觀察組TLR4和TNF-α mRNA顯著低于模型組，但仍高于正常組TLR4和TNF-α mRNA表達。見表3和圖1。

2.3?附子理中湯對非酒精性脂肪性肝炎大鼠肝臟內毒素受體CD14的影響

正常組只有少量細胞能夠表達CD14。與正常組比較，模型組大鼠肝組織在第12～24周內，CD14表達的陽性細胞數(shù)持續(xù)升高，在24周時略有降低，而附子理中湯觀察組CD14表達的陽性細胞數(shù)與模型組比較顯著減少。見表4。

3?討論

附子理中湯為理中湯中加附子而成的用于溫中祛寒的理想藥方，且可增強小鼠耐寒、鎮(zhèn)痛的作用，同時對脾寒胃虛患者具有較強的調節(jié)作用。而關于附子理中湯對非酒精性脂肪性肝炎患者影響的報道較為少見。因此，本研究附子理中湯對非酒精脂肪性肝炎大鼠體內CD14、TLR4、TNF-α和內毒素表達影響，探究附子理中湯對非酒精性脂肪性肝炎大鼠內毒素及其受體的作用。

本研究結果發(fā)現(xiàn)附子理中湯可顯著降低非酒精性脂肪性肝炎大鼠體內TNF-α水平和CD14表達的陽性細胞數(shù)，同時可促使TLR4和TNF-α基因表達水平顯著下調。內毒素在血循環(huán)中與受體蛋白結合形成復合物后，便與位于細胞膜上的CD14受體結合，在相關蛋白的協(xié)同作用下，TLR4信號受體將其傳導至細胞，進而促進細胞內各種炎性反應遞質被激活、釋放。內毒素的肝毒性來源于庫普細胞，其在肝臟內主要表達TLR4和CD14，當其在肝組織內表達發(fā)生波動可反映出內毒素受體表達升高[11]。已知脂質過氧化物和氧化應激是造成非酒精性脂肪性肝炎二次損傷的主要原因，而脂質氧化的參與遞質內毒素在其中起著重要作用。CD14在主要位于庫普弗細胞表面，內毒素可通過CD14促進庫普弗細胞激活，進而促進炎性反應遞質的分泌，如TNF-α[12]。TNF-α作為肝臟疾病發(fā)展過程中的一個關鍵控制因子，與肝損傷有著密切的關系。酒精性肝硬化患者體內的TNF-α和其受體-P75，-55表達均顯著增加，且與其患病的嚴重程度有關[13]。而當將小鼠體內TNF-αR1被敲除后，發(fā)現(xiàn)乙醇引發(fā)的肝損傷較對照組顯著減輕，且TNF-αR1是TNF-α的激活劑，證實TNF-α在酒精性脂肪性肝炎發(fā)病中具有重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α是非酒精性脂肪性肝炎發(fā)生發(fā)展的關鍵遞質，ob/ob小鼠高脂喂養(yǎng)并給予抗-TNF-α抗體，實驗4周后對肝組織具有明顯的改善作用，且肝炎指標降低，IR和脂肪酸均減少[14]。因此，研究藥物對非酒精性脂肪性肝炎內TNF-α表達的影響，有利于判斷藥物對非酒精性脂肪性肝炎的影響。

內毒素不但對肝細胞具有直接毒性，而且可與結合蛋白相結合，如CD14和TLR4受體結合后能促使庫普弗細胞被激活后，促進核因子-κB等轉錄因子活化，進而促進各種化學因子和細胞因子轉錄合成、釋放，誘導肝損傷[15]。據(jù)報道，TNF-α不僅可介導內毒素生物學效應，且可誘導多種遞質的協(xié)同作用，進而促使內毒素的多種生物學效應被擴大，致使肝損害[16]。Bondeva等[17]發(fā)現(xiàn)，337例老年人中，約有21.5%患者患有內毒素血癥，血清中的內毒素含量與體質量指數(shù)、三酰甘油水平正相關。研究發(fā)現(xiàn)，非酒精性脂肪性肝炎患者的小腸內細菌出現(xiàn)過度生長現(xiàn)象的同時，血清內TNF-α表達水平也伴隨著升高[18]。在脂肪性肝炎的研究中發(fā)現(xiàn)，肝臟內出現(xiàn)CD14表達增強，血清內TNF-α表達上調等現(xiàn)象，間接表明非酒精性脂肪性肝炎與內毒素肝損傷具有相關性。

綜上所述，附子理中湯可降低非酒精性脂肪性肝炎大鼠內毒素及其受體表達。

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（2019-05-29收稿?責任編輯：楊覺雄）