復(fù)方中藥及其與抗生素聯(lián)用對斜帶石斑魚變形假單胞菌病的防治效果

徐曉津，李秀華，馬一帆，李慧耀，祁 欣，呂海龍，鄢慶枇

(1.集美大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，福建 廈門361021； 2.福建天馬科技股份集團(tuán)有限公司，福建 福州 350308；3.廈門醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院中醫(yī)科，福建 廈門361021； 4.廈門大學(xué)海洋與地球?qū)W院，福建 廈門 361005)

斜帶石斑魚(Epinepheluscoioides)肉質(zhì)鮮美，營養(yǎng)豐富，是我國海水魚類養(yǎng)殖的重要經(jīng)濟(jì)魚類。福建省石斑魚產(chǎn)業(yè)鏈產(chǎn)值超50億元，是福建省推進(jìn)水產(chǎn)千億產(chǎn)業(yè)鏈建設(shè)的11個(gè)品種之一，是海南、廣東、福建等地重要的工廠化養(yǎng)殖魚類[1]。多年來，養(yǎng)殖戶不斷提高養(yǎng)殖密度，多地已多次爆發(fā)石斑魚細(xì)菌性疾病，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，2012年天津斜帶石斑魚潰爛病爆發(fā)，造成的經(jīng)濟(jì)損失約為500萬元[2]。研究表明用變形假單胞菌(Pseudomonasglecoglossicida)人工感染斜帶石斑魚，病魚死亡率達(dá)100%，病魚脾臟出現(xiàn)大量白點(diǎn)[3-4]。抗生素已被較廣泛地用于魚類細(xì)菌病防治，但病原菌易產(chǎn)生耐藥性，且病魚機(jī)體有抗生素等藥物殘留。而中藥則含有多種免疫活性物質(zhì)，并有抑菌及滅菌作用[5-6]，無藥物殘留問題。因此復(fù)方中藥或中西藥聯(lián)用已被廣泛用于魚病治療。研究發(fā)現(xiàn)在飼料中添加板藍(lán)根、黃芪和茯苓等能治療南美白對蝦(Litopenaeusvannamei)疾病[7-9]。復(fù)方中藥已被用于治療刺參(Apostichopusjaponicus)、金絲魚(Tanichthrsaltbonubes)、黃顙魚(Pelteobagrusfulvidraco)、凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)、日本鰻鱺(Anguillajaponica)的疾病[8, 10-14]。但尚未有學(xué)者進(jìn)行復(fù)方中藥治療魚類變形假單胞菌病的研究，也未有中藥治療石斑魚變形假單胞菌病的報(bào)道。

本研究前期開展中藥及抗生素抑制變形假單胞菌研究，篩選出抑菌作用極強(qiáng)的三聯(lián)復(fù)方中藥黃連、黃芪、黃柏，在60 mg/mL 濃度下，其對變形假單胞菌的抑菌圈為21.95±1.48 mm，恩諾沙星的抑制細(xì)菌效果為敏感，抑菌圈直徑為22.55±1.82 mm[15]。本研究將篩選出的敏感藥物黃連、黃芪、黃柏及恩諾沙星添加至飼料中，治療石斑魚變形假單胞菌病，比較不同質(zhì)量比例的復(fù)方中藥及中西藥聯(lián)用治療斜帶石斑魚細(xì)菌性疾病的效果，為水產(chǎn)養(yǎng)殖病害防治提供參考。

1 材料及方法

1.1 菌種

本研究所用變形假單胞菌分離于患病石斑魚，保存于集美大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院病害實(shí)驗(yàn)室[16]。采用LB 液體培養(yǎng)基培養(yǎng)8～12 h，調(diào)整細(xì)菌OD600值為0.5，保存于-4 ℃冰箱。再用LB 液體培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)菌，采用麥?zhǔn)嫌?jì)數(shù)法調(diào)整變形假單胞菌濃度至1×107cfu/mL。

1.2 篩選及制備復(fù)方三聯(lián)中藥

采用前期篩選的中藥黃連、黃芪、黃柏制備不同的復(fù)方中藥配方。復(fù)方中藥配方Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組中黃連、黃芪、黃柏的質(zhì)量比分別為：0.9∶1.3∶0.9、1.2∶0.9∶1.0、1.0∶1.0∶1.0。中藥顆粒由江陰天江藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，通過炮制中藥藥材、濃縮藥液并制備顆粒，制備成與生藥藥性相同且可溶于水的顆粒劑。用無菌蒸餾水溶解中藥顆粒，隔水加熱30 min至中藥顆粒溶解，制備相當(dāng)于生藥材質(zhì)量濃度為60、70、80 mg/mL的藥液[17]。

1.3 復(fù)方三聯(lián)中藥抑菌活性測定

用改良牛津杯法進(jìn)行復(fù)方中藥抑制變形假單胞菌實(shí)驗(yàn)[17]，用移液槍吸取0.1 mL濃度為 1×108cfu/mL的菌懸液，滴在固體培養(yǎng)基上，涂勻。在1個(gè)孔中加入200 μL的無菌水作為對照，在另3個(gè)孔中分別加入200 μL含60、70、80 mg/mL生藥不同復(fù)方三聯(lián)中藥液，于28℃下培養(yǎng)18～24 h，用SupcreG1抑菌圈測量儀測量各組的抑菌圈大小[17]。中藥抑菌能力的判定標(biāo)準(zhǔn)為:抑菌直徑≥ 20 mm為極敏感“+ + +”，15 mm≤抑菌直徑<20 mm為高敏“+ +” ， 10 mm≤抑菌直徑< 15 mm及抑菌直徑< 10 mm分別為中敏、低敏或稱為無效“-”[17]。

1.4 三聯(lián)中藥及中西藥拌餌投喂治療魚變形假單胞菌病研究

黃連、黃芪與黃柏購于廈門蓮福堂藥店，采用購自天津市泰斯特儀器有限公司的中藥粉碎機(jī) (FW177)，將各藥材粉碎為約150 μm大小，將粉末用山東三清不銹鋼設(shè)備有限公司生產(chǎn)的超微粉碎機(jī)(三清振動微粉機(jī)，SQW-60)再次粉碎至約5～10 μm大小的超微藥粉[17]?？股囟髦Z沙星購于興化市恒威生物技術(shù)有限公司。石斑魚飼料由福建天馬科技股份集團(tuán)有限公司提供。在飼料中添加黃連、黃芪與黃柏復(fù)方中藥或復(fù)方中藥與恩諾沙星聯(lián)用做為實(shí)驗(yàn)組，以基礎(chǔ)飼料投喂組為對照。烘干黃連、黃芪與黃柏中藥超微藥粉，按等質(zhì)量混勻，用 160目篩絹過濾，三聯(lián)中藥質(zhì)量分?jǐn)?shù)為基礎(chǔ)飼料的2.2%。用SLX-80型飼料擠壓機(jī)，制作成1.0 mm的顆粒飼料，烘干(60 ℃，12 h)、裝袋并密封備用[17]。

通過預(yù)實(shí)驗(yàn)，采用攻毒后80%斜帶石斑魚有變形假單胞菌病的癥狀，且無病魚死亡的攻毒細(xì)菌濃度(1×102cfu/g)為本研究的攻毒細(xì)菌濃度。斜帶石斑魚體長為(12±2) cm，體重為(21±3) g，購于福建省寧德市養(yǎng)殖場。設(shè)實(shí)驗(yàn)組和對照組，每組各20 尾魚，于18 ℃的1 t循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)內(nèi)暫養(yǎng)斜帶石斑魚1周。采過胸腔注射的方式對受試魚進(jìn)行攻毒，變形假單胞菌的濃度為1×102cfu/g。對照組魚注射PBS緩沖液。陰性照組Ⅰ為健康魚且僅投喂飼料、陽性對照組Ⅱ?yàn)楦腥炯?xì)菌的病魚組且僅投喂飼料。

以下各組均進(jìn)行變形假單胞菌攻毒斜帶石斑魚實(shí)驗(yàn)。其中三聯(lián)復(fù)方中藥實(shí)驗(yàn)組Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ投喂的飼料中添加黃連∶黃芪∶黃柏的質(zhì)量比為0.9∶1.3∶0.9、1.2∶0.9∶1.0、1.0∶1.0∶1.0。實(shí)驗(yàn)組Ⅳ、V、VI為中西藥聯(lián)用復(fù)方組，在投喂的飼料中添加三聯(lián)復(fù)方中藥及恩諾沙星，黃連∶黃芪∶黃柏∶恩諾沙星的質(zhì)量比例為 0.9∶1.3∶0.9∶1.3、1.2∶0.9∶1.0∶0.9、1.0∶1.0∶1.0∶1.0。同時(shí)進(jìn)行三聯(lián)復(fù)方中藥與生產(chǎn)常用藥物板黃散及大黃五倍子散的藥效對比研究，添加的板黃散及大黃五倍子散占飼料質(zhì)量比為2.2%，添加板黃散的為對照組Ⅲ；添加大黃五倍子散的為對照組Ⅳ，均進(jìn)行3次重復(fù)。每天于8:00、17:00投喂2次，按斜帶石斑魚魚體質(zhì)量的2%～3%作為投飼量，每日吸出殘余餌料并換水。

每天檢查患病石斑魚癥狀與死亡率，統(tǒng)計(jì)病魚累積死亡率(Rate of Cumulative Mortality,RCM) 。

RCM(%)= [(N0-Nt)/N0]×100

(1)

式(1)中:RCM是累積死亡率(%) ，N0指開始實(shí)驗(yàn)石斑魚的總數(shù)，Nt為結(jié)束實(shí)驗(yàn)時(shí)石斑魚的總數(shù)。各實(shí)驗(yàn)組魚死亡率為100%時(shí)結(jié)束實(shí)驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)各組石斑魚死亡率。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

用SPSS 24.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)，包括單因素方差 (ANOVA)分析，通過Duncan’s多重比較法進(jìn)行各數(shù)據(jù)的差異顯著性(p<0.05)分析，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(X±SD) 表示。

2 結(jié)果與討論

2.1 復(fù)方三聯(lián)中藥體外抑制變形假單胞菌的比較

由表1可知，復(fù)方中藥配方I、II、III組隨著藥物濃度的增大，藥物抑制細(xì)菌的效果也增強(qiáng)。藥物濃度為60 mg/mL，黃連、黃芪、黃柏質(zhì)量比為1.2∶0.9∶1.0的復(fù)方中藥配方Ⅱ?yàn)樽罴雅浞?表1)，是具有用藥少且抑制細(xì)菌效果強(qiáng)的藥物配方。

表1 復(fù)方中藥配方I、 II、III制備的不同濃度中草藥溶液的抑菌情況Tab.1 Bacteriostatic effect of different concentrations of Chinese herbal formulas I, II and III on Pseudomonas plecoglossicida in vitro

2.2 復(fù)方中藥和中西藥聯(lián)用治療斜帶石斑魚變形假單胞菌病的效果分析

注射變形假單胞菌2 d后，各實(shí)驗(yàn)組、對照組Ⅳ及對照組Ⅲ魚飼料殘留增加，斜帶石斑魚減少攝食飼料。5 d后，各組感染細(xì)菌的斜帶石斑魚有死亡現(xiàn)象，病魚腹部膨大，脾臟出血、有白點(diǎn)，解剖發(fā)現(xiàn)病魚腸內(nèi)食物少，少量無癥狀且死亡。各組魚的死亡情況見表2。

表2 投喂復(fù)方中藥與中西藥聯(lián)用效果比較Tab.2 Comparison of survivals among groups fed with Chinese herbal formula along and Chinese and Western medicine combination formula

各組魚感染變形假單胞菌40 d 后，病魚的死亡數(shù)有明顯差別(圖1)，不同實(shí)驗(yàn)組與對照組斜帶石斑魚的死亡率由高到低為：對照組Ⅱ>對照組Ⅳ>對照組Ⅲ>實(shí)驗(yàn)組Ⅰ>實(shí)驗(yàn)組Ⅲ>實(shí)驗(yàn)組Ⅱ>實(shí)驗(yàn)組V>實(shí)驗(yàn)組VI>實(shí)驗(yàn)組Ⅳ>對照組Ⅰ。

圖1 投喂復(fù)方中藥藥餌后不同時(shí)間段實(shí)驗(yàn)組與對照組魚死亡情況Fig.1 Mortalities of fish fed with Chinese herbal formula bait in experimental and control groups with times

對照組Ⅰ的健康魚未出現(xiàn)死亡或病癥，攝食正常。對照組Ⅱ攻毒3 d后開始出現(xiàn)1尾魚死亡，病魚死亡高峰期在第17天，死亡率為100%。

復(fù)方中藥投喂組：感染變形假單胞菌8～10 d后，實(shí)驗(yàn)組Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ均出現(xiàn)2尾魚死亡，病魚死亡數(shù)量多出現(xiàn)在43～45 d， 至58～73 d病魚死亡率為100%。攻毒40 d后，實(shí)驗(yàn)組Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的病魚死亡率分別為(38.7±1.2)%、(31.7±0.6)%、(34.3±0.6)%。實(shí)驗(yàn)組Ⅱ在對病魚所投喂的飼料中添加質(zhì)量比例為1.2∶0.9∶1.0的黃連∶黃芪∶黃柏，其治療魚病效果最好。

中西藥聯(lián)用投喂組：感染變形假單胞菌15～21 d后，實(shí)驗(yàn)組V、VI、Ⅳ中組均有1尾魚死亡，在45～55 d病魚死亡數(shù)量大。在攻毒60～73 d后，各組病魚死亡率為100%。中西藥聯(lián)用實(shí)驗(yàn)組Ⅳ、V、VI，40 d魚死亡率為(16.7±1.5)%、(21.0±1.0)%、(19.3±1.2)%。實(shí)驗(yàn)組Ⅳ在對病魚投喂的飼料中添加質(zhì)量比例為0.9∶1.3∶0.9∶1.3的黃連∶黃芪∶黃柏∶恩諾沙星，治療斜帶石斑魚變形假單胞菌病效果最好。對照組Ⅲ與對照組Ⅳ中的板黃散與大黃五倍子散為養(yǎng)殖場常用藥物，攻毒40 d后，對照組Ⅲ、Ⅳ病魚的死亡率為(83.3±1.5)%、(93.7±1.5)%，板黃散與大黃五倍子散治療組的病魚死亡率高于復(fù)方中藥與中西藥聯(lián)用投喂組。結(jié)果表明各配方藥物均比生產(chǎn)常用藥物板黃散、大黃五倍子散的療效強(qiáng)，中西藥聯(lián)用配方比復(fù)方中藥組藥物療效好。

2.3 討論

變形假單胞菌能引起石斑魚內(nèi)臟白點(diǎn)病[18]，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。在水產(chǎn)養(yǎng)殖中長期使用抗生素治療魚病，病原菌易產(chǎn)生耐藥性。而中藥具有副作用小、無藥物殘留、價(jià)格低、療效好等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)能提高魚類免疫力。中藥能抑制或殺滅細(xì)菌，已被長期用于養(yǎng)殖場魚病防治。研究表明枸杞(Lyciumbarbarum)、香菇多糖及黃芪對金絲魚(Tanichthysaltbonubes)的用藥安全濃度分別為156.81、278.92、239.49 mg/L，是安全、低毒性的飼料添加劑[12]，在魚病防治工作中已取得較好的療效。盡管中藥已被廣泛地應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖病害防治，并取得較好的療效[7]，但不少中藥抑制及殺滅細(xì)菌的機(jī)理未明了，不同中藥對細(xì)菌的抑制作用也不同，不同中藥對不同魚類細(xì)菌性疾病的治療效果不同。因此，通過不同藥物進(jìn)行魚類病害治療的實(shí)驗(yàn)加以比較、驗(yàn)證，才能篩選出有效的復(fù)方中藥及中西藥聯(lián)用藥物。本研究通過采用不同質(zhì)量比的黃連、黃芪、黃柏進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)，通過不同質(zhì)量比的復(fù)方中藥、中西藥聯(lián)用藥物進(jìn)行斜帶石斑變形假單胞菌病的治療效果比較研究，篩選治療魚病效果好的復(fù)方。黃連、黃芪、黃柏、恩諾沙星組成的中西藥聯(lián)用藥物比中草藥復(fù)方療效強(qiáng)；不同質(zhì)量比的復(fù)方中藥及中西藥聯(lián)用藥物對斜帶石斑變形假單胞菌病的療效均強(qiáng)于生產(chǎn)常用藥板黃散、大黃五倍子散。這與其他學(xué)者的研究結(jié)果相似[19]。

不少學(xué)者采用中藥進(jìn)行魚病防治，結(jié)果顯示復(fù)方中藥療效好，可提高草魚(Ctenopharyngodonidellus)免疫力、抗病力[19]。復(fù)方中藥已被用于治療日本鰻鱺、鋸緣青蟹(Scyllaserrata)疾病[20-21]。金銀花、山楂、黃芪和黨參可增強(qiáng)刺參抗病力[22-23]。葛根、黃連、金銀花、板藍(lán)根和黃芪等復(fù)方中藥能降低凡納濱對蝦白斑綜合征病毒(WSSV)病的死亡率[24]。茵陳三黃湯為主的藥物能減少鮭鱒魚(Oncorhynchusmykiss)肝損傷，降低病魚死亡率，有效防治細(xì)菌性疾病[11]。具有協(xié)同作用的復(fù)方中藥(黃芪、板藍(lán)根、金銀花和生石膏) 與黃芪對魚的免疫保護(hù)率分別為79.19%、46.00%[19]，說明復(fù)方中藥的藥效高于單方中藥。多聯(lián)中藥已被用于治療草魚細(xì)菌性疾病，研究表明投喂周期為14～21 d能增加病魚免疫力、抗病力[19]。

抗生素恩諾沙星對魚類細(xì)菌性疾病的治療效果好，在飼料中添加恩諾沙星，其在大福瑞鯉(Cyprinuscarpio)肌肉、肝胰臟、腎臟中的濃度均先升后降[25]。但如果使用抗生素，在16、25 ℃等不同溫度、10、20 mg/kg等不同給藥劑量和肌注、口灌等不同給藥方式條件下，在鋸緣青蟹血淋巴中均能檢出恩諾沙星，含量較低[26]。在集約化、規(guī)?；乃a(chǎn)養(yǎng)殖中，飼料中添加多聯(lián)中藥或中西藥聯(lián)用藥物，能減少抗生素的使用，降低細(xì)菌耐藥性，減少魚體殘留抗生素超標(biāo)等問題，達(dá)到無公害水產(chǎn)養(yǎng)殖病害防治準(zhǔn)則。

3 結(jié)論

本研究采用不同質(zhì)量比例的黃連、黃芪、黃柏進(jìn)行抑制變形假單胞菌實(shí)驗(yàn)，隨著復(fù)方中藥濃度的增加，藥效也不斷增強(qiáng)。藥物濃度為60 mg/mL，黃連、黃芪、黃柏質(zhì)量比為1.2∶0.9∶1.0為最佳抑菌配方，藥物用量少且抑菌效果較強(qiáng)。

同時(shí)設(shè)置由不同質(zhì)量比例的黃連、黃芪、黃柏組成的復(fù)方中藥組，及不同質(zhì)量比例的三種中藥與恩諾沙星組成的中西藥聯(lián)用藥物組，展開治療斜帶石斑魚變形假單胞菌病的研究。結(jié)果表明復(fù)方中藥組中實(shí)驗(yàn)組Ⅱ(在飼料中添加的黃連、黃芪、黃柏質(zhì)量比例為1.2∶0.9∶1.0)對斜帶石斑變形假單胞菌病的治療效果最好。中西藥聯(lián)用組中實(shí)驗(yàn)組Ⅳ的藥效最好，其黃連、黃芪、黃柏與恩諾沙星質(zhì)量比例為0.9∶1.3∶0.9∶1.3。本研究各配方藥物能較好地治療石斑魚變形假單胞菌病，采用的不同比例的黃連、黃芪、黃柏組成的藥物配方均比生產(chǎn)常用藥物板黃散、大黃五倍子散治療魚病的效果好。且中西藥聯(lián)用配方較復(fù)方中藥組藥物的治療效果更佳。