• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    近海沉積物與水體中天然大分子聚合物降解菌的原位富集與多樣性分析

    2020-11-18 06:18:48齊明明李建洋劉憲華邵宗澤
    應(yīng)用海洋學學報 2020年4期
    關(guān)鍵詞:蝦殼幾丁質(zhì)原位

    齊明明,李建洋,劉憲華,邵宗澤

    (1.天津大學環(huán)境科學與工程學院,天津 300387; 2.自然資源部第三海洋研究所、自然資源部海洋遺傳資源重點實驗室、福建省海洋遺傳資源重點實驗室,福建 廈門 361005)

    海洋中存在各種來源的天然有機物,是一個巨大的碳庫,在全球碳循環(huán)中起著決定性作用[1-2]。海洋中有機物的礦化是全球碳循環(huán)的一個中心過程,影響著全球海洋生態(tài)系統(tǒng)與全球氣候的變化走勢[3],而各種微生物通過對有機物的分解代謝在這一過程中發(fā)揮著重要作用[4]。前人對海洋水體環(huán)境中由生物的碎片、糞球和細胞外多糖所聚集形成的懸浮顆粒物及其附著的異養(yǎng)細菌有較多研究[4],然而對動植物組織及其大分子進入海洋環(huán)境中與微生物的相互作用研究不多。目前從海洋環(huán)境中分離得到的常見有機物降解菌多為好氧細菌,包括海桿菌屬(Marinobacter)、鹽單胞菌屬(Halomonas)、黃桿菌屬(Flavobacterium)、假單胞菌屬 (Pseudomonas)、產(chǎn)氣單胞菌屬(Aeromonas)、弧菌屬(Vibrio)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、交替假單胞菌屬(Pseudoalteromonas)等[5],種類多樣性較高。然而,有機物降解過程中消耗大量氧氣造成有機物局部微環(huán)境缺氧,海洋沉積物等厭氧環(huán)境下有機物降解菌的多樣性還有待進一步研究。

    本實驗通過選取不溶于水的代表性天然有機物,于近海沉積物與海水表層環(huán)境中進行降解菌原位富集。底物包括魚鱗、蝦殼、海帶葉片、幾丁質(zhì)和殼聚糖,其中魚鱗、蝦殼和海帶葉片是從海洋中有機體脫落下來的以生物高分子聚合物為主要成分的生物組織;而幾丁質(zhì)和殼聚糖是海洋甲殼類外骨骼的重要成分,在海洋中含量豐富,但較難降解。據(jù)報道,實驗室分離得到的魚鱗降解菌多為芽孢桿菌類,如枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)[6]、蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)[7]等;海洋幾丁質(zhì)降解菌有粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratiamarcescens)、 環(huán)狀芽孢桿菌(Bacilluscirculans)、交替單胞菌屬(Alteromonas)等[8];海洋殼聚糖降解的細菌主要來源于芽孢桿菌屬[9-11]、鏈霉菌屬(Streptomyces)、假單胞菌屬[12]、微桿菌屬(Microbacterium)[13],此外還有曲霉屬(Aspergillus)、木霉屬(Trichoderma)[12]、青霉屬(Penicillium)[14]等真菌;海帶降解菌有芽孢桿菌屬[15-16]、類芽孢桿菌屬(Paenibacillus)[17]等。

    目前有機物的降解菌主要通過實驗室好氧條件培養(yǎng)分離得到,而在海洋原位環(huán)境下,有哪些細菌真正參與了這些有機物的降解與礦化還不清楚。本研究結(jié)果將有助于我們認識難降解大分子天然有機物在近海環(huán)境下的微生物礦化過程,為分析有機物礦化與海洋碳循環(huán)提供參考。

    1 材料與方法

    1.1 近海原位培養(yǎng)

    以魚鱗、海帶葉片、蝦殼、幾丁質(zhì)和殼聚糖為有機底物,分別取1.5 g樣品裝入50 cm3離心管,用300目紗絹封口,高溫120 ℃滅菌20 min后分別布放于廈門觀音山潮間帶(24.50°N,118.21°E)海水表層和沉積物兩種環(huán)境中,將離心管分別固定在懸浮繩索或埋藏在沉積物表層下10 cm處,每組設(shè)置3個平行。原位富集30 d后,于2018年9月1日取回實驗室,經(jīng)過孔徑為0.22 μm的聚碳酸酯膜(直徑為47 mm)采用負壓過濾的方法將微生物富集樣品收集到濾膜上[18]。過濾完成之后迅速將濾膜于-80 ℃保存,30 d內(nèi)完成 DNA 樣品的提取。

    1.2 富集菌群的基因組DNA提取和16S rRNA基因的高通量測序

    將采集的濾膜樣品剪碎研磨,按照DNA提取試劑盒(上海賽百勝基因技術(shù)有限公司)的步驟說明進行DNA提取。利用NanoDrop 2000核酸測定儀[賽默飛世爾科技(中國)有限公司]測定樣品DNA濃度。限于實驗條件,選取每組平行樣品中高濃度的DNA樣品送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進行高通量測序,細菌引物為338F(5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’)和806R(5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’),進行雙端測序。經(jīng)過序列篩選后,從10個環(huán)境樣本中共獲得590 708條序列和326 100個分類操作單元(Operational Taxonomic Unit, OTU,通常對大于97%相似水平下的OTU進行生物信息統(tǒng)計分析)。統(tǒng)計結(jié)果顯示,各樣本序列數(shù)范圍為43 660~72 433條,平均每個樣本約59 071條序列。

    1.3 數(shù)據(jù)分析與處理

    為保證后續(xù)數(shù)據(jù)的準確性,對高通量測序得到的數(shù)據(jù)進行質(zhì)控分析得到去掉 Barcode的Clean數(shù)據(jù)。利用USEARCH軟件[19]對序列進行拼接去重復(fù),將相似度大于97%的物種聚類為1個OTU。通過Greengene數(shù)據(jù)庫對所得到的OTU進行分類比對,利用Mothur軟件[20]對序列進行抽平計算α-多樣性指數(shù)Sobs、Shannon、Simpson、Ace、Chao和Coverage。在不同分類學水平上對樣品進行主成分分析,繪制相關(guān)性熱圖。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 天然有機物原位富集樣品30 d后表觀描述

    樣品原位富集30 d后,沉積物環(huán)境下離心管中充滿黑色液體,有刺鼻的硫化氫氣味;水上環(huán)境下離心管中液體渾濁,不同環(huán)境下底物均有剩余。

    2.2 天然有機物原位富集降解菌群的細菌α-多樣性分析

    通過高通量測序,共獲得兩種環(huán)境5種有機底物的10個富集菌的16S rRNA基因測序數(shù)據(jù),通過α-多樣性分析獲得多樣性指數(shù)統(tǒng)計結(jié)果(表1)??梢钥闯?,所有樣品的序列Coverage值均在0.99以上,說明測序數(shù)據(jù)有效可靠。由表1中Sobs、Chao、Ace指數(shù)顯示,兩種環(huán)境下不同有機物原位富集的物種豐度和多樣性存在明顯的差異。水體環(huán)境富集樣品的物種豐富度明顯高于沉積物環(huán)境。推測相對于水體富集物,沉積物樣品中各種有機物在第30天優(yōu)勢降解菌群得到更顯著的富集。

    表1 大于97%相似水平下不同樣品的α-多樣性指數(shù)Tab.1 α-diversity indexes at more than 97% similarity level in different samples

    續(xù)表1

    2.3 各種原位富集物的細菌群落組成

    從OTU 聚類結(jié)果來看,本次實驗共得到45個門,95個綱,214個目,360個科,598個屬。其中占比較高的細菌門分別是:變形菌門、擬桿菌門、厚壁菌門、梭桿菌門和熱袍菌門。沉積物環(huán)境下海帶葉片樣品中占比最大的為熱袍菌門,占總細菌的比例為50.87%,而在其他所有富集樣品中,變形菌門占有絕對優(yōu)勢,占總細菌的比例分別為:①海水表層環(huán)境中,魚鱗:57.49%、海帶葉片:54.08%、殼聚糖:33.27%、幾丁質(zhì):25.33%、蝦殼:30.71%;②沉積物環(huán)境中,幾丁質(zhì):70.69%、蝦殼:38.44%、殼聚糖:35.38%、魚鱗:32.51%、海帶葉片:24.80%。沉積物海帶葉片富集樣品中的OTU數(shù)目僅為470,物種組成明顯較低。

    在綱水平上,各樣品中細菌組成差異較大,如圖1所示。在沉積物中,除海帶葉片富集菌群中的優(yōu)勢菌群為熱袍菌綱外,其他均為δ-變形菌綱。在海水中,海帶葉片、魚鱗富集菌的優(yōu)勢類群為γ-變形菌綱。擬桿菌綱在殼聚糖和蝦殼樣品中占比較大,而Modulifexia綱是幾丁質(zhì)富集樣品的優(yōu)勢類群,占比達到18.70%,但在其他樣品中占比均比較低。

    圖1 廈門近岸海水與沉積物中大分子聚合物原位富集過程中細菌在綱水平上的群落結(jié)構(gòu)Fig.1 Community structure of bacteria at the class level during in situ enrichment of macromolecules in nearshore seawater and sediments of Xiamen水體:HDW表示海帶葉片,JDZW表示幾丁質(zhì),KJTW表示殼聚糖,XKW表示蝦殼,YLW表示魚鱗;沉積物:HDS表示海帶葉片,JDZS表示幾丁質(zhì),KJTS表示殼聚糖,XKS表示蝦殼,YLS表示魚鱗,下同。

    2.4 不同有機物富集菌群群落間相似性分析

    基于OTU水平構(gòu)建物種相似樹圖(圖2),同一種有機物,海水表層與沉積物環(huán)境中富集菌群結(jié)構(gòu)差異較大。不同底物樣品,海水表層環(huán)境富集樣品OTU組成雖然也有較大差異,但傾向于匯集一起。

    圖2 基于OTU的樣品間聚類關(guān)系樹Fig.2 Similarity tree based on OTU samples

    幾丁質(zhì)和殼聚糖樣品無論是海水表層還是沉積物環(huán)境中,相似性都最高。沉積物環(huán)境中它們以δ-變形菌綱為優(yōu)勢菌綱(>20%),在海水表層環(huán)境中,γ-變形菌綱為優(yōu)勢菌綱(>20%),沉積物中海帶葉片樣品與其他樣品差別較大。

    在屬水平構(gòu)建相似性熱圖(圖3),其中色塊顏色梯度來展示樣本中不同物種的占比變化情況??傮w上看,在所有樣品中脫硫桿菌屬(Desulfobacter)是優(yōu)勢菌屬;而弧菌屬在沉積物樣品殼聚糖和幾丁質(zhì)中占比較高,其中幾丁質(zhì)樣品中占比高達26.21%,表明其參與了幾丁質(zhì)降解。比較不同環(huán)境下幾丁質(zhì)樣品在屬水平上群落組成發(fā)現(xiàn),沉積物環(huán)境下弧菌含量明顯高于海水表層環(huán)境,推測沉積物環(huán)境下的條件更有利于弧菌的活性。在目前研究中,莫照蘭等(2000)在蝦池中篩選出了高效降解菌Vibriospp.[21],肖湘等(2003)分離得到了幾丁質(zhì)高效降解弧菌Vibriosp.11211[22],暗示了弧菌菌株可能高效地降解幾丁質(zhì)同時研究發(fā)現(xiàn)弧菌可以產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶降解幾丁質(zhì),獲得生長所需碳源和氮源[23]。本研究通過近海原位培養(yǎng),證明弧菌在自然海洋環(huán)境中是幾丁質(zhì)的重要分解者。

    2.5 不同環(huán)境下細菌群落差異性分析

    在科水平上,采用“Wilcoxon秩和檢驗”雙尾檢驗方法,比較兩種環(huán)境下,全部樣品的菌落差異,如圖4所示,不同環(huán)境下種群分布和占比存在較大差異,其中在脫硫弧菌科、黃桿菌科、弧菌科和紅細菌科存在顯著差異(0.01

    圖4 不同環(huán)境組間群落科水平上占比顯著性差異檢驗Fig.4 Tests for significant differences in compositions between different environmental groups at the family level“*”表示0.01

    為了進一步比較不同環(huán)境下樣品群落結(jié)構(gòu)組成,選擇幾丁質(zhì)樣品,比較其在不同環(huán)境下科水平上菌落組成差異,結(jié)果如圖5所示。得到不同環(huán)境下,群落組成和占比存在極顯著差異(p<0.001)。

    圖5 不同環(huán)境下幾丁質(zhì)樣品科水平上菌群比較 Fig.5 Comparison of microbial communities in chitin samples from different habitats at the family level“***”表示p<0.001,樣品中菌群差異性極顯著;圖中綠色代表沉積物環(huán)境下的幾丁質(zhì)樣品,紅色代表海水表層環(huán)境下的幾丁質(zhì)樣品。

    2.6 討論

    海洋細菌在海洋生態(tài)系統(tǒng)中占據(jù)重要的地位[24],在海洋微食物網(wǎng)、有機物礦化與元素生物地球化學循環(huán)過程中發(fā)揮著重要作用。本研究通過利用不同天然有機物在近海環(huán)境中原位富集、高通量DNA測序,認識近海原位環(huán)境下海洋來源的高聚物降解菌多樣性。結(jié)果發(fā)現(xiàn),無論是海水表層還是沉積物環(huán)境富集物中,厭氧降解菌與好氧降解菌并存。從多樣性上看,海水表層富集物高于沉積物。在海水表層環(huán)境富集樣品中,黃桿菌科細菌占比較大,而沉積物樣品中脫硫桿菌科細菌為優(yōu)勢種。樣品在沉積物中埋藏7 d后,顏色明顯變黑,產(chǎn)生濃厚的硫化氫氣體,表明各種有機物厭氧降解過程耦合著硫酸鹽還原;而在海水表層,推測初期的好氧環(huán)境,隨著降解過程推進,也會導(dǎo)致樣品內(nèi)部缺氧。黃桿菌是擬桿菌門中最大的科,多為好氧,少量是微好氧與厭氧[25]。其中Kaoutari等(2013)在動物腸道菌群中發(fā)現(xiàn),部分擬桿菌門細菌編碼較多糖苷水解酶和多糖裂解酶的基因,暗示該類微生物參與了多糖類有機物的降解[26],陳三鳳等(1993)發(fā)現(xiàn)了1株可降解幾丁質(zhì)的黃桿菌B1[27]。脫硫桿菌菌株為嚴格厭氧,可以將有機物氧化成CO2,本研究中在沉積物富集樣品中,脫硫桿菌菌株作為優(yōu)勢菌之一,推測它們參與了有機物的降解。在沉積物富集中的蝦殼和魚鱗富集樣品,梭菌科占有絕對優(yōu)勢,其次為脫硫桿菌科。梭菌科為發(fā)酵型專性厭氧革蘭氏陰性桿菌,可以發(fā)酵有機物,產(chǎn)生各種有機酸,如乙酸、丙酸、丁酸、甲酸或琥珀酸[28]。魚鱗和蝦殼被梭菌科細菌降解發(fā)酵后,產(chǎn)生的有機酸可能為脫硫桿菌提供電子供體,也可能脫硫桿菌直接參與了蝦殼和魚鱗的厭氧降解。

    本實驗通過對不同天然大分子有機聚合物原位富集30 d,得到不同有機物菌群組成和占比差異明顯,例如幾丁質(zhì)樣品在沉積物和海水表層環(huán)境下占比最大的分別為弧菌科;沉積物環(huán)境下,脫硫弧菌科在不同樣品中占比較大,推測可能在原位富集有機物降解中發(fā)揮較大的作用,但所占的比例差異明顯。同時結(jié)合現(xiàn)有研究報道[26-28],原位條件下參與有機物降解的細菌與實驗室得到結(jié)果也存在一定差異。

    3 結(jié)論

    為研究在原位環(huán)境下參與有機物降解的菌群種類,本實驗選取蝦殼、魚鱗、海帶葉片、幾丁質(zhì)和殼聚糖作為有機底物,分別在海水表層和沉積物中進行富集,定期取樣,通過高通量測序分析菌群多樣性。得出不同富集環(huán)境下不同底物菌群結(jié)構(gòu)、物種多樣性存在較大差異,本研究分析結(jié)果可為研究有機物的礦化提供一定的理論依據(jù)。

    猜你喜歡
    蝦殼幾丁質(zhì)原位
    物歸原位
    幼兒100(2024年19期)2024-05-29 07:43:34
    產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的無色桿菌ZWW8的發(fā)酵產(chǎn)酶及酶學性質(zhì)研究
    響應(yīng)面優(yōu)化超聲波輔助蝦殼快速脫鹽工藝
    有機酸軟化凡納濱對蝦蝦殼的效果研究
    蝦殼在1-乙基-3-甲基咪唑醋酸鹽離子液體中的溶解特性
    未培養(yǎng)微生物原位培養(yǎng)技術(shù)研究進展
    微生物幾丁質(zhì)酶的研究進展及應(yīng)用現(xiàn)狀
    中國釀造(2017年8期)2017-09-03 06:20:01
    磷酸鹽緩沖液活化蝦殼材料脫除鎘的初步研究
    原位強化的鋁基復(fù)合材料常見增強相及制備方法
    河南科技(2014年12期)2014-02-27 14:10:29
    幾丁質(zhì)酶及其在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用
    浙江柑橘(2013年2期)2013-01-22 01:34:29
    国产成人影院久久av| 亚洲av片天天在线观看| 亚洲成人久久性| 一a级毛片在线观看| 天天添夜夜摸| 精品无人区乱码1区二区| 黑人欧美特级aaaaaa片| 亚洲国产精品合色在线| 啦啦啦免费观看视频1| 午夜福利免费观看在线| 亚洲人成伊人成综合网2020| 亚洲午夜理论影院| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 午夜福利在线免费观看网站| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 多毛熟女@视频| www日本在线高清视频| 午夜免费成人在线视频| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 在线观看免费午夜福利视频| 91老司机精品| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 国产精品国产av在线观看| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 国产精品av久久久久免费| 日韩有码中文字幕| 亚洲 欧美一区二区三区| 亚洲精品在线美女| 久久天堂一区二区三区四区| 香蕉国产在线看| 正在播放国产对白刺激| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 亚洲成人国产一区在线观看| 亚洲人成电影免费在线| 看片在线看免费视频| 不卡一级毛片| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 香蕉国产在线看| 国产在线精品亚洲第一网站| 自线自在国产av| 久久久水蜜桃国产精品网| 欧美色视频一区免费| 9色porny在线观看| 成人av一区二区三区在线看| 久久久久久久午夜电影 | 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 欧美日本中文国产一区发布| 99热国产这里只有精品6| 99精品在免费线老司机午夜| 老司机靠b影院| 亚洲男人天堂网一区| 日韩大码丰满熟妇| xxxhd国产人妻xxx| 亚洲精品中文字幕在线视频| videosex国产| 首页视频小说图片口味搜索| 亚洲av五月六月丁香网| 欧美激情 高清一区二区三区| 亚洲一区二区三区欧美精品| 黄色怎么调成土黄色| 身体一侧抽搐| 国产精品九九99| 欧美日韩福利视频一区二区| 香蕉久久夜色| av欧美777| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 高清av免费在线| a级毛片黄视频| 久久亚洲精品不卡| 国产精品偷伦视频观看了| 国产高清国产精品国产三级| 麻豆成人av在线观看| 国产精品久久久人人做人人爽| a级毛片在线看网站| www.熟女人妻精品国产| 亚洲精品中文字幕在线视频| 国产一区二区三区在线臀色熟女 | 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 成人亚洲精品av一区二区 | 成年人黄色毛片网站| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 欧美日韩黄片免| 在线天堂中文资源库| 中文字幕人妻熟女乱码| 在线国产一区二区在线| 亚洲国产精品999在线| 国产成人精品无人区| 高清av免费在线| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 99精品欧美一区二区三区四区| 久久性视频一级片| 国产精品野战在线观看 | 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 九色亚洲精品在线播放| 色在线成人网| 成在线人永久免费视频| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 色综合欧美亚洲国产小说| 岛国在线观看网站| 在线永久观看黄色视频| 久久精品亚洲av国产电影网| 国产激情欧美一区二区| 村上凉子中文字幕在线| 在线看a的网站| 欧美中文综合在线视频| 亚洲三区欧美一区| 90打野战视频偷拍视频| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 一级黄色大片毛片| videosex国产| 久久久国产一区二区| 一级a爱视频在线免费观看| 久久天堂一区二区三区四区| 精品国产一区二区久久| 一本综合久久免费| 久久天堂一区二区三区四区| 久久这里只有精品19| 香蕉久久夜色| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 免费在线观看亚洲国产| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 精品国产美女av久久久久小说| 青草久久国产| 午夜91福利影院| 美女午夜性视频免费| 电影成人av| 精品第一国产精品| 午夜影院日韩av| 交换朋友夫妻互换小说| 高潮久久久久久久久久久不卡| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 一a级毛片在线观看| 久久久精品欧美日韩精品| 欧美日韩视频精品一区| 日韩大尺度精品在线看网址 | 亚洲精品在线观看二区| 精品免费久久久久久久清纯| 国产高清国产精品国产三级| 久久久久亚洲av毛片大全| 日本免费a在线| 久久久国产一区二区| 亚洲熟女毛片儿| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 最新在线观看一区二区三区| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 一个人免费在线观看的高清视频| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 亚洲欧美激情在线| 国产成人精品在线电影| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 久久久久久免费高清国产稀缺| 国产成人精品在线电影| 人妻久久中文字幕网| 久久香蕉精品热| 99在线人妻在线中文字幕| 精品一区二区三区四区五区乱码| 国产精品免费视频内射| 黄色视频不卡| 精品久久久久久成人av| 国产高清视频在线播放一区| 免费人成视频x8x8入口观看| 午夜日韩欧美国产| 一区福利在线观看| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 无限看片的www在线观看| 免费av毛片视频| 在线观看日韩欧美| 欧美不卡视频在线免费观看 | 久久久久久久久中文| 国产又爽黄色视频| 一进一出抽搐动态| 亚洲精品成人av观看孕妇| 亚洲熟妇熟女久久| 亚洲男人的天堂狠狠| 999久久久精品免费观看国产| 美女高潮到喷水免费观看| 午夜亚洲福利在线播放| 欧美大码av| 亚洲全国av大片| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放 | 90打野战视频偷拍视频| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 99国产极品粉嫩在线观看| cao死你这个sao货| 美女福利国产在线| 国产xxxxx性猛交| 久久久久九九精品影院| 老司机深夜福利视频在线观看| 国产精品免费一区二区三区在线| 婷婷丁香在线五月| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 99精国产麻豆久久婷婷| 丰满迷人的少妇在线观看| 婷婷精品国产亚洲av在线| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 精品国产乱子伦一区二区三区| 国产野战对白在线观看| 制服诱惑二区| 亚洲色图av天堂| www.999成人在线观看| 性少妇av在线| 亚洲成人久久性| 满18在线观看网站| 亚洲国产欧美网| 日韩欧美一区视频在线观看| 午夜精品久久久久久毛片777| 99国产精品一区二区三区| www.999成人在线观看| 久久草成人影院| 成人特级黄色片久久久久久久| 午夜福利在线免费观看网站| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 亚洲成人精品中文字幕电影 | 亚洲一区中文字幕在线| 免费高清在线观看日韩| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 黄色女人牲交| 精品午夜福利视频在线观看一区| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 老司机福利观看| 国产亚洲精品综合一区在线观看 | 免费不卡黄色视频| 老司机靠b影院| 高清黄色对白视频在线免费看| 黄色怎么调成土黄色| 欧美在线黄色| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 嫩草影院精品99| 久久国产精品人妻蜜桃| 午夜a级毛片| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 丝袜美腿诱惑在线| 黄色a级毛片大全视频| 亚洲第一av免费看| 亚洲成a人片在线一区二区| 国产亚洲av高清不卡| 免费观看人在逋| 午夜免费鲁丝| 18禁国产床啪视频网站| 一区二区三区精品91| 久久久久国产一级毛片高清牌| 亚洲黑人精品在线| 欧美丝袜亚洲另类 | 免费一级毛片在线播放高清视频 | 91字幕亚洲| 母亲3免费完整高清在线观看| 久久国产亚洲av麻豆专区| 另类亚洲欧美激情| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 免费在线观看影片大全网站| 夜夜爽天天搞| 久久精品国产综合久久久| 欧美黑人欧美精品刺激| 国产精品永久免费网站| 亚洲精品在线观看二区| 女警被强在线播放| 国产成人欧美| a在线观看视频网站| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 99在线人妻在线中文字幕| 成人18禁在线播放| 美女午夜性视频免费| 操出白浆在线播放| 国产99白浆流出| av网站免费在线观看视频| 成人精品一区二区免费| 亚洲精品粉嫩美女一区| 国产成人av激情在线播放| 男人舔女人下体高潮全视频| 精品久久蜜臀av无| 少妇 在线观看| 亚洲精品粉嫩美女一区| 一级作爱视频免费观看| 麻豆一二三区av精品| 久久欧美精品欧美久久欧美| 日本免费a在线| 脱女人内裤的视频| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 岛国视频午夜一区免费看| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 激情在线观看视频在线高清| 乱人伦中国视频| 日韩视频一区二区在线观看| 少妇的丰满在线观看| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 午夜精品久久久久久毛片777| 亚洲精品成人av观看孕妇| 最近最新中文字幕大全免费视频| 国产伦一二天堂av在线观看| 国产精品爽爽va在线观看网站 | 久久性视频一级片| 夜夜看夜夜爽夜夜摸 | 黑人操中国人逼视频| 国产精品一区二区三区四区久久 | 色精品久久人妻99蜜桃| 欧美性长视频在线观看| 中文字幕人妻丝袜制服| 美国免费a级毛片| 成人亚洲精品一区在线观看| 国产成人免费无遮挡视频| 久久精品国产清高在天天线| 久久伊人香网站| 在线视频色国产色| 女人精品久久久久毛片| 村上凉子中文字幕在线| 久久久国产成人精品二区 | 法律面前人人平等表现在哪些方面| 亚洲精品一区av在线观看| 午夜精品久久久久久毛片777| 亚洲中文字幕日韩| 午夜免费激情av| 日韩国内少妇激情av| 大陆偷拍与自拍| 可以在线观看毛片的网站| 亚洲精品一二三| 国产成人啪精品午夜网站| 精品久久久久久,| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 纯流量卡能插随身wifi吗| 精品欧美一区二区三区在线| 精品久久久久久,| 精品久久久久久电影网| 乱人伦中国视频| 一进一出抽搐动态| ponron亚洲| 欧美色视频一区免费| 亚洲三区欧美一区| 久久九九热精品免费| 国产精品免费视频内射| 视频在线观看一区二区三区| 亚洲欧美激情在线| 两性夫妻黄色片| 亚洲中文字幕日韩| 欧美乱妇无乱码| 亚洲欧美激情在线| 两性夫妻黄色片| 一区二区三区激情视频| 日韩大码丰满熟妇| 亚洲精品在线美女| 狠狠狠狠99中文字幕| 淫妇啪啪啪对白视频| 12—13女人毛片做爰片一| 精品久久久久久久毛片微露脸| 成年女人毛片免费观看观看9| 美女福利国产在线| 日本欧美视频一区| 两人在一起打扑克的视频| 久久人人97超碰香蕉20202| 麻豆国产av国片精品| 久久精品91蜜桃| 十八禁人妻一区二区| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 亚洲人成电影观看| 亚洲一区二区三区色噜噜 | 美女国产高潮福利片在线看| 亚洲黑人精品在线| 麻豆成人av在线观看| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 老司机在亚洲福利影院| 日韩高清综合在线| 亚洲精品国产区一区二| 99在线视频只有这里精品首页| 超碰97精品在线观看| 中文欧美无线码| 亚洲成人免费电影在线观看| 久久性视频一级片| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 99热国产这里只有精品6| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 99国产极品粉嫩在线观看| 老司机午夜十八禁免费视频| 纯流量卡能插随身wifi吗| 久99久视频精品免费| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 亚洲人成伊人成综合网2020| 在线视频色国产色| 欧美另类亚洲清纯唯美| 国产欧美日韩一区二区三| 天堂影院成人在线观看| 日本精品一区二区三区蜜桃| 免费一级毛片在线播放高清视频 | 精品一区二区三区四区五区乱码| 亚洲美女黄片视频| 成年女人毛片免费观看观看9| 国产成人系列免费观看| 校园春色视频在线观看| av视频免费观看在线观看| 国产av一区在线观看免费| 国产91精品成人一区二区三区| 亚洲国产中文字幕在线视频| 日本五十路高清| 成年人黄色毛片网站| 99在线视频只有这里精品首页| 天堂影院成人在线观看| 午夜精品久久久久久毛片777| 制服人妻中文乱码| 久久久久亚洲av毛片大全| 久久精品亚洲av国产电影网| 一二三四在线观看免费中文在| 久久人妻熟女aⅴ| 热re99久久国产66热| 亚洲中文av在线| 国产片内射在线| av视频免费观看在线观看| 国产单亲对白刺激| 久久人人97超碰香蕉20202| 久久午夜亚洲精品久久| 国产免费男女视频| 欧美激情极品国产一区二区三区| 高清在线国产一区| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 久99久视频精品免费| 神马国产精品三级电影在线观看 | 亚洲精品在线美女| 女警被强在线播放| 无遮挡黄片免费观看| 人妻久久中文字幕网| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 精品国产乱子伦一区二区三区| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 亚洲国产欧美网| 午夜亚洲福利在线播放| 少妇 在线观看| 香蕉国产在线看| 亚洲专区中文字幕在线| 成人国语在线视频| 在线观看免费视频网站a站| 午夜成年电影在线免费观看| 岛国视频午夜一区免费看| 国产精品电影一区二区三区| 久久中文字幕一级| 激情在线观看视频在线高清| 91国产中文字幕| 老熟妇仑乱视频hdxx| 精品一区二区三区四区五区乱码| 99re在线观看精品视频| xxx96com| 91成年电影在线观看| 国产成+人综合+亚洲专区| 交换朋友夫妻互换小说| 不卡一级毛片| 桃色一区二区三区在线观看| 精品人妻在线不人妻| 免费看a级黄色片| 亚洲免费av在线视频| 美女午夜性视频免费| 男女高潮啪啪啪动态图| 国产黄a三级三级三级人| 99久久99久久久精品蜜桃| 亚洲av第一区精品v没综合| 一级a爱视频在线免费观看| 欧美乱妇无乱码| 波多野结衣高清无吗| 91麻豆av在线| 免费在线观看完整版高清| 99精品在免费线老司机午夜| 黄频高清免费视频| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 在线观看日韩欧美| 天天影视国产精品| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 国产一区二区在线av高清观看| 在线观看舔阴道视频| 精品福利永久在线观看| 精品国产亚洲在线| 亚洲欧美激情综合另类| 久热这里只有精品99| 黄色怎么调成土黄色| 大陆偷拍与自拍| 9热在线视频观看99| 大香蕉久久成人网| www.自偷自拍.com| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 黄片小视频在线播放| 国产精品野战在线观看 | 日韩中文字幕欧美一区二区| 99久久国产精品久久久| 日韩精品免费视频一区二区三区| 淫妇啪啪啪对白视频| 天天添夜夜摸| 在线观看66精品国产| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 在线观看一区二区三区激情| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 国产免费现黄频在线看| 又黄又爽又免费观看的视频| 成人黄色视频免费在线看| av中文乱码字幕在线| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 国产欧美日韩精品亚洲av| 成人永久免费在线观看视频| 麻豆av在线久日| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 国产激情久久老熟女| www.999成人在线观看| 日韩免费高清中文字幕av| 亚洲一区二区三区欧美精品| www.自偷自拍.com| 日本三级黄在线观看| 99在线人妻在线中文字幕| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 免费看十八禁软件| 国产精品影院久久| 高清在线国产一区| 国产精品爽爽va在线观看网站 | 免费av中文字幕在线| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 免费av中文字幕在线| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 国产精品国产高清国产av| 国产av又大| 91成人精品电影| 最新美女视频免费是黄的| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 九色亚洲精品在线播放| 三级毛片av免费| av在线播放免费不卡| 午夜免费鲁丝| 在线看a的网站| 免费在线观看影片大全网站| 精品日产1卡2卡| 国产欧美日韩一区二区三| 真人做人爱边吃奶动态| a级毛片在线看网站| 精品电影一区二区在线| 高清av免费在线| 一二三四社区在线视频社区8| 99国产精品一区二区三区| 制服诱惑二区| 99re在线观看精品视频| 丁香六月欧美| 99国产精品一区二区蜜桃av| 12—13女人毛片做爰片一| 久久久国产一区二区| 国产一区二区在线av高清观看| 亚洲av五月六月丁香网| 无人区码免费观看不卡| 在线永久观看黄色视频| 在线观看舔阴道视频| 大香蕉久久成人网| 在线观看一区二区三区激情| 脱女人内裤的视频| 免费搜索国产男女视频| 久久欧美精品欧美久久欧美| 制服人妻中文乱码| 日本免费a在线| 久久婷婷成人综合色麻豆| 亚洲免费av在线视频| 深夜精品福利| 亚洲国产精品合色在线| 女警被强在线播放| 他把我摸到了高潮在线观看| 国产亚洲精品综合一区在线观看 | 97碰自拍视频| 天堂影院成人在线观看| 免费观看人在逋| 丝袜在线中文字幕| 国产成人啪精品午夜网站| 国产精品爽爽va在线观看网站 | 欧美久久黑人一区二区| 91av网站免费观看| 亚洲成人久久性| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 亚洲人成77777在线视频| 一级黄色大片毛片| 亚洲免费av在线视频| 亚洲熟妇中文字幕五十中出 | 欧美人与性动交α欧美精品济南到| av在线播放免费不卡| 亚洲中文日韩欧美视频| 午夜免费激情av| 在线观看一区二区三区激情| 中文字幕av电影在线播放| 中国美女看黄片| 村上凉子中文字幕在线| 免费在线观看日本一区| 69av精品久久久久久| 日韩欧美国产一区二区入口| 国产人伦9x9x在线观看| 久久人妻熟女aⅴ| ponron亚洲| 成人影院久久| 香蕉丝袜av| 国产成人欧美| 国产精品永久免费网站| 免费观看人在逋| 久久久久久人人人人人| 国产高清videossex| 国产精品av久久久久免费| 亚洲精品在线美女| 亚洲男人的天堂狠狠| 成在线人永久免费视频| 久久婷婷成人综合色麻豆| √禁漫天堂资源中文www| 丝袜美腿诱惑在线| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 级片在线观看| 久久精品国产亚洲av高清一级| 自线自在国产av| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 男女下面插进去视频免费观看| 大型黄色视频在线免费观看| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 亚洲一码二码三码区别大吗| 精品人妻1区二区|