王甘翔,唐 古,彭 頔,李媛媛,楊 慶,李飛鵬,*
(1. 平湖市漁業(yè)技術(shù)推廣中心,浙江嘉興 314200;2. 上海理工大學(xué)環(huán)境與建筑學(xué)院,上海 200093)
斑馬魚胚胎對有毒有害物質(zhì)非常敏感,已經(jīng)成為國際上生物醫(yī)學(xué)和環(huán)境毒理學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)模式生物,廣泛應(yīng)用于常規(guī)毒性試驗(yàn)、分子及細(xì)胞生態(tài)毒理研究和生物誘導(dǎo)效應(yīng)檢測等多個方面。國際標(biāo)準(zhǔn)組織已將斑馬魚推薦為河水毒性檢測的試驗(yàn)魚種,并提出了相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)方法(ISO 07346);我國生態(tài)環(huán)境部亦發(fā)布了《水質(zhì) 急性毒性的測定 斑馬魚卵法》(HJ 1069—2019),適用于測定地表水、地下水、生活污水和工業(yè)廢水的急性毒性。斑馬魚飼養(yǎng)容易,利用其胚胎的毒性檢測方法具有節(jié)約空間、費(fèi)用低等諸多優(yōu)勢,因此,在生態(tài)毒理學(xué)研究和水環(huán)境檢測等領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用[1]。在利用斑馬魚胚胎評價(jià)環(huán)境污染物毒性時,致死性反應(yīng)毒理學(xué)終點(diǎn)是環(huán)境安全評估的一項(xiàng)重要指標(biāo);但是,在自然水生態(tài)系統(tǒng)中,污染物通常具有濃度低、種類多、成分和作用機(jī)制復(fù)雜等特點(diǎn),受污染的生物通常表現(xiàn)為畸形、突變等非致死性反應(yīng)。通過觀測經(jīng)毒性物質(zhì)染毒條件下魚卵胚胎心跳的情況,判斷魚卵胚胎發(fā)育的毒性效應(yīng),是評價(jià)分析毒性物質(zhì)的一種重要方法,同時,胚胎的心率變化也是相對較早可檢測到的指標(biāo)。
當(dāng)前,針對斑馬魚胚胎的心率監(jiān)測,多依賴于顯微鏡觀測的計(jì)數(shù)方法,準(zhǔn)確性受觀測者主觀判斷的影響較大。在研究不同酒制大黃對斑馬魚胚胎發(fā)育的影響時,朱淑珍等[2]采用倒置光學(xué)顯微鏡和CCD數(shù)碼攝像機(jī)對胚胎的發(fā)育終點(diǎn)進(jìn)行研究,統(tǒng)計(jì)胚胎發(fā)育全過程的死亡數(shù)和畸形數(shù),拍照記錄發(fā)育狀態(tài),錄像并以人工計(jì)數(shù)心率;然而,這種基于斑馬魚胚胎錄制視頻文件、以人工計(jì)數(shù)心率的方式具有工作量大、存在誤差等劣勢。此外,當(dāng)前斑馬魚胚胎心跳觀測普遍采用24孔板染毒,置于顯微鏡觀測并計(jì)數(shù)胚胎心跳。在這種觀測環(huán)境下,魚卵胚胎和試驗(yàn)培養(yǎng)液直接暴露于室內(nèi)空氣中,難以保證較好的觀測條件,同時也會影響試驗(yàn)的準(zhǔn)確性[3]。計(jì)算機(jī)視覺是使用計(jì)算機(jī)及相關(guān)設(shè)備對生物視覺的一種模擬技術(shù),能夠代替人眼對目標(biāo)進(jìn)行識別、跟蹤和測量,并可以進(jìn)一步對圖形進(jìn)行處理和分析,在水環(huán)境監(jiān)測和生態(tài)學(xué)研究中逐漸開始得到廣泛應(yīng)用[4-6]。針對水質(zhì)毒性試驗(yàn)和評價(jià)的需求,本研究基于計(jì)算機(jī)視覺技術(shù),建立了精確檢測斑馬魚心率的自動觀測系統(tǒng),并進(jìn)行了初步驗(yàn)證,旨在提高斑馬魚毒性檢測方法的效率和精度,為水質(zhì)毒性檢測方法提供一種新思路。
試驗(yàn)所用的斑馬魚購自同濟(jì)大學(xué)長江水環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,個體長度為4~5 cm,飼養(yǎng)于充分曝氣的自來水中,水溫保持在(26±1)℃,pH值控制在7~8,光照/黑暗周期控制為14 h∶10 h。每日喂食2次(冷凍紅線蟲,購于上海曲陽花鳥市場),并輔助混合干飼料喂食以增加產(chǎn)卵量。斑馬魚飼養(yǎng)3個月以上并達(dá)到性成熟后進(jìn)行試驗(yàn),飼養(yǎng)期間活動正常、無死亡。一般,斑馬魚卵胚胎在受精24 h后(24 hpf)心臟發(fā)育成形,即可在顯微鏡下觀測到心跳[7]。
試驗(yàn)前夜,在暗室內(nèi)將產(chǎn)卵器放入魚缸,親魚按1∶2雌雄比放入產(chǎn)卵器內(nèi),中間用隔板隔開,下方放置魚卵收集器,次日清晨抽出隔板,光照30 min以刺激斑馬魚產(chǎn)卵。取出魚卵收集器,用闊口膠頭滴管(管口直徑大于卵徑)將卵吸出,然后用標(biāo)準(zhǔn)稀釋水清洗魚卵數(shù)次,以除去糞便等雜質(zhì),挑選出正常的受精卵培養(yǎng)備用。
標(biāo)準(zhǔn)稀釋水配置參照《水質(zhì) 急性毒性的測定 斑馬魚卵法》(HJ 1069—2019)的方法進(jìn)行。
心率觀測系統(tǒng)由實(shí)驗(yàn)室卵胚胎培養(yǎng)裝置、組裝的高速攝像顯微鏡和視頻圖像心率識別程序組成。實(shí)驗(yàn)室卵胚胎培養(yǎng)裝置結(jié)構(gòu)如圖1所示。組裝的高速攝像和顯微鏡系統(tǒng)采用高清(1 920×1 080/50P)攝像機(jī),在APS-C商用畫幅下能得到0.1 μm2/ Pixel(像素)的分辨率;顯微鏡采用光學(xué)倒置顯微鏡(Olympus CKX41)(圖2)。
圖1 實(shí)驗(yàn)室卵胚胎培養(yǎng)裝置結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 Structure Diagram of Laboratory Culture Device for Zebrafish Embyro
圖2 計(jì)算機(jī)視覺系統(tǒng)裝置Fig.2 Picture of Computer Visual System
為了得到較準(zhǔn)確的斑馬魚卵胚胎心跳觀測結(jié)果,需控制觀測裝置的環(huán)境溫度、光照等因素以保證魚卵胚胎的正常發(fā)育,并防止外界污染物進(jìn)入培養(yǎng)液,從而保證單一變量試驗(yàn),同時需保證胚胎固定穩(wěn)固,以利于觀測。因此,本研究自行設(shè)計(jì)了魚卵胚胎培養(yǎng)裝置,由相互連通的容納單元、恒溫水流動單元組成,可固定于組裝的高速攝像顯微鏡載物臺。
容納單元腔室為圓柱形,由上蓋板、下底板、側(cè)板構(gòu)成腔室,腔室與側(cè)板之間、腔室與腔室之間均留有空隙。腔室的數(shù)量設(shè)置為4個,內(nèi)徑為2 cm,深度為2 cm,每個腔室均設(shè)置上部的高位換水孔和下部的低位換水孔,相錯設(shè)置,同時與側(cè)板連通。
上蓋板、下底板及腔室內(nèi)均填充透光纖維團(tuán),為腔室提供一定的光源,保障觀測時的光線條件。使用中上蓋板蓋合,使得魚卵胚胎心跳觀測裝置封閉,防止外界污染。充氧的恒溫水通過高位換水孔向低位換水孔持續(xù)流動,為腔室內(nèi)斑馬魚卵胚胎生存提供了充足的氧氣和恒溫水浴條件;換水孔徑較小(3 mm)使得腔室內(nèi)水體流動較緩,加上腔室內(nèi)填充的纖維團(tuán)緩沖了水體流動對腔室造成的沖擊,腔室底部的纖維絮層固定魚卵胚胎,總體上防止了觀測中魚卵胚胎抖動影響觀測結(jié)果的準(zhǔn)確性。
在對Schulte等[8]的研究方法進(jìn)行改進(jìn)的基礎(chǔ)上,采用自主設(shè)計(jì)加工的卵胚胎培養(yǎng)裝置(圖1)進(jìn)行染毒試驗(yàn)。挑選出4枚24 hpf正常受精卵置于培養(yǎng)裝置胚胎放置腔內(nèi),組裝好培養(yǎng)裝置,利用染毒試液構(gòu)建恒溫水浴環(huán)境對胚胎進(jìn)行染毒。
在室溫與目標(biāo)溫度相近的情況下,將染毒試液由泵水管與恒溫進(jìn)水口相連,控制壓力保持胚胎腔室液位穩(wěn)定,不溢出。試驗(yàn)時,先將位于透光上蓋板內(nèi)壁上的標(biāo)記黏結(jié)固定合適大小、形狀的纖維團(tuán)(透光化纖),再將進(jìn)樣泵一端連接恒溫水源,進(jìn)樣泵另一端連接進(jìn)水孔;在進(jìn)樣泵作用下,恒溫水通過進(jìn)水孔進(jìn)水,進(jìn)入容納單元,充滿側(cè)板與腔室之間及腔室相互之間的空隙以及各個腔室,然后通過出水孔流出??刂扑畨?,保持腔室水位穩(wěn)定后,通過吸管將卵胚胎放入腔室底部,再鋪上脫脂棉薄層,使魚卵胚胎固定在纖維絮層上,并蓋上已黏結(jié)纖維團(tuán)的上蓋板,封閉腔室,隨著上蓋板蓋合,纖維團(tuán)即可插入纖維絮層并填充腔室,之后將該裝置放置于倒置顯微鏡上,通過透光的下底板觀測魚卵胚胎心跳的情況,進(jìn)行觀察及視頻錄制。
室溫與目標(biāo)溫度相差較大會影響胚胎生理指標(biāo),此時,只需將進(jìn)樣泵水管連接水體恒溫裝置后再與恒溫進(jìn)水口相連即可。
視頻文件由心率識別程序處理后得到胚胎心率指標(biāo)。心率識別程序采用Matlab數(shù)學(xué)軟件編寫,通過對基于灰度變化的斑馬魚心室圖像面積的Matlab程序編碼。編寫的8組M碼文件可以組合應(yīng)用于Matlab軟件,對視頻圖像文件不同部分進(jìn)行黑色和白色處理,最終得到心室面積的實(shí)時變化值。心室面積變化值反映了心臟的收縮和擴(kuò)張,心室面積值-時間曲線的2次波峰之間的時間間隔內(nèi)即發(fā)生了1次完整的心跳。因此,通過對心室面積值-時間曲線的分析即可得到心率,從而實(shí)現(xiàn)心室圖像心率識別。
為觀測正常的斑馬魚胚胎心跳,以日常放置半天的自來水為試驗(yàn)試劑,通過上述心率檢測系統(tǒng)進(jìn)行正常環(huán)境下斑馬魚胚胎的觀測、視頻錄制和心率識別,以驗(yàn)證本研究構(gòu)建的觀測系統(tǒng)的準(zhǔn)確性。本例所用視頻文件總時長為6 min,心率識別程序每隔0.02 s對視頻圖像進(jìn)行1次處理,共得到18 000個面積數(shù)據(jù)值。
利用Excel 2013從所得的面積數(shù)據(jù)值中隨機(jī)選取5組連續(xù)5 s內(nèi)的數(shù)據(jù)值,根據(jù)各面積-時間曲線圖總體趨勢,5組曲線走勢類似,且均可清晰地分辨出波峰數(shù)量,數(shù)據(jù)波峰數(shù)量均為9,隨機(jī)抽取的1組心室面積值-時間折線圖如圖3所示。為判斷心率與波峰的對應(yīng)關(guān)系,對心率識別程序所用視頻文件進(jìn)行人工計(jì)數(shù),同樣采用隨機(jī)選取4組1 min時長進(jìn)行計(jì)數(shù),所得結(jié)果分別為112、105、108、114次/min,平均心率為110次/min。1 min斑馬魚胚胎平均心跳數(shù)為108次,與人工計(jì)數(shù)所得幾乎一致,波峰與心率基本吻合,說明通過構(gòu)建的計(jì)算機(jī)識別程序可準(zhǔn)確計(jì)數(shù)斑馬魚胚胎的心率變化。Park等[9]在利用斑馬魚心臟毒性模型預(yù)測藥物引起心率過緩情況時,使用立體顯微鏡對斑馬魚卵胚胎心率進(jìn)行30 s人工計(jì)數(shù),發(fā)現(xiàn)未染毒對照組斑馬魚卵胚胎平均心率為105次/min;Chakraborty等[10]在研究咖啡因、諾氟沙星和尼美舒利對斑馬魚胚胎心率影響時,發(fā)現(xiàn)空白對照組的斑馬魚卵胚胎平均心率為110次/min。斑馬魚心率觀測系統(tǒng)所得平均心率值與上述已有研究結(jié)果十分接近,且其結(jié)果與人工計(jì)數(shù)結(jié)果相差無幾,同時,在觀測操作和心率計(jì)數(shù)方面具有更加便捷、快速和精確的優(yōu)勢。
圖3 隨機(jī)抽取的心室面積-時間曲線圖Fig.3 Random Selection of Ventricular Area-Time Curve
采用混合地表徑流樣品為試驗(yàn)試劑進(jìn)行培養(yǎng),分別用顯微鏡人工觀測和本系統(tǒng)觀測斑馬魚胚胎心率。顯微鏡觀測斑馬魚胚胎發(fā)育48 h的心率為(153±13)次/min,本系統(tǒng)觀測的平均值為151次/min,與人工技術(shù)結(jié)果一致,進(jìn)一步說明了系統(tǒng)觀測的準(zhǔn)確性。
在以斑馬魚為受試生物的環(huán)境毒理學(xué)研究中,斑馬魚胚胎心率在不同濃度染毒試劑中的變化情況已有廣泛的研究。葉露[7]采用倒置顯微鏡對斑馬魚胚胎進(jìn)行15 s人工計(jì)數(shù),得到了不同濃度全氟辛酸(PFOA)和全氟化合物(PFCs)所對應(yīng)的斑馬魚胚胎平均心率值;楊洋等[11]發(fā)現(xiàn)了雙酚AF暴露對胚胎期的毒性效應(yīng),構(gòu)建了不同濃度的雙酚AF所對應(yīng)的斑馬魚胚胎平均心率;Wu等[12]在研究上海市高架道路降雨徑流水質(zhì)毒性時,采用斑馬魚作為受試生物,得到了不同批次降雨徑流所對應(yīng)的斑馬魚平均心率。同時,這些研究的斑馬魚胚胎心率變化構(gòu)建出染毒試劑濃度和斑馬魚胚胎心率關(guān)系曲線,含有對應(yīng)污染物的水質(zhì),即可通過斑馬魚胚胎心率變化進(jìn)行定量化表征,從而實(shí)現(xiàn)水質(zhì)情況的快速、實(shí)時監(jiān)測。在心率計(jì)數(shù)時,人工計(jì)數(shù)的方式造成的誤差是不可避免的,且誤差大小具有不確定性,雖然同樣可以取多組人工計(jì)數(shù)求出平均心率,但由于人工計(jì)數(shù)耗時較多,數(shù)據(jù)組不可能取無限多次以減小誤差。本研究所提供的斑馬魚心率觀測系統(tǒng),基于計(jì)算機(jī)視覺技術(shù),可隨機(jī)選出足夠多組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,從而實(shí)現(xiàn)心率結(jié)果誤差最小化。本研究提供的方法可在后續(xù)的研究中構(gòu)建更多的水體污染物濃度與心率關(guān)系曲線,實(shí)現(xiàn)對水質(zhì)的快速檢測。同時,斑馬魚心率觀測系統(tǒng)能夠更好地模擬自然環(huán)境,可以對卵胚胎發(fā)育全過程進(jìn)行實(shí)時觀測和圖像提取分析,在研究胚胎發(fā)育形態(tài)方面也具有較大優(yōu)勢。在對污染物濃度變化大的降雨徑流水質(zhì)和毒性比較時,Chen等[13]發(fā)現(xiàn),基于傳統(tǒng)方法的水質(zhì)評價(jià)并不能完全反應(yīng)降雨徑流的生態(tài)毒性水平,應(yīng)考慮同時進(jìn)行徑流的毒性和水質(zhì)檢測。本方法可在觀測斑馬魚胚胎毒理學(xué)指標(biāo)的同時,構(gòu)建在線監(jiān)測系統(tǒng)進(jìn)行水體水質(zhì)監(jiān)測,可實(shí)現(xiàn)水質(zhì)指標(biāo)和生態(tài)毒性指標(biāo)的協(xié)同在線檢測。
本研究提供了一種斑馬魚心率觀測系統(tǒng)的建立方法,改進(jìn)了胚胎觀測的條件,能夠更好地模擬斑馬魚胚胎發(fā)育的自然環(huán)境,從而使觀測結(jié)果更加準(zhǔn)確;通過編寫的視頻圖像心率識別程序,與傳統(tǒng)人工計(jì)數(shù)方式相比,基于計(jì)算機(jī)視覺的胚胎心率計(jì)數(shù)更加高效、快速和準(zhǔn)確;斑馬魚心率觀測系統(tǒng)在檢測系統(tǒng)中的應(yīng)用驗(yàn)證了系統(tǒng)的可行性和準(zhǔn)確性。在具體的水質(zhì)檢測應(yīng)用中,可以采用斑馬魚卵胚胎在水樣中染毒,構(gòu)建出心率與水質(zhì)變化的規(guī)律,從而通過心率變化實(shí)現(xiàn)對水質(zhì)和毒性的實(shí)時協(xié)同監(jiān)測。