金雞顆粒中兩面針摻偽檢測方法的研究

胡亮，李瑞蓮，王銀紅*

1.湖南省藥品檢驗研究院，湖南藥用輔料檢驗檢測中心，長沙 410001；2.湖南省藥品質量評價工程技術研究中心，長沙410001

金雞顆粒處方由金櫻根、雞血藤、兩面針、功勞木、穿心蓮和千斤拔6味藥材組成，具有清熱解毒、健脾除濕、通絡活血等作用，通常用于濕熱下注引起的附件炎、盆腔炎等癥［1-4］，其質量標準收載于《衛(wèi)生部藥品標準》［5］。兩面針為蕓香科植物兩面針Zanthoxylum nitidum（Roxb.）D C.的干燥根。具有活血化瘀，行氣止痛，祛風通絡等功效［6-8］。金雞顆?，F行質量標準中未對兩面針進行質量控制，同時《中國藥典》2015 年版一部收載的兩面針藥材項下明確規(guī)定應不得檢出毛兩面針素［6］，但現實狀況是兩面針藥材的資源不足，兩面針常見混有偽品飛龍掌血（特征成分為毛兩面針素）等，實際生產中可能存在替代兩面針投料生產的情況［9-10］。

本文采用薄層色譜法（TLC）、高效液相色譜法（HPLC）和液相色譜-質譜法（LC-MS）建立了金雞顆粒中毛兩面素的檢查方法［11］，并對收集的21 批樣品進行檢查研究，具體方法如下。

1 儀器與試藥

Waters Xevo G2 Q-TOF 液質聯(lián)用儀；Waters 2695 液相色譜儀；2998 二級管陣列檢測器（沃特世科技有限公司）；METTLER AE240 型電子天平（梅特勒-托利多，萬分之一）；XSE205DU 型電子天平（梅特勒-托利多，十萬分之一）；超聲波清洗儀KQ500DE（500W，40KHz）；進口硅膠G 預制板TLC Silica gel 60（Merck）。毛兩面針素對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號111531-201603）；乙腈為色譜純（Fisher Chemical），其他試劑均為分析純。樣品來源為國家食品藥品監(jiān)督管理總局國家藥品評價抽驗工作金雞系列品種抽驗樣品及企業(yè)提供的部分樣品。

2 方法與結果

2.1 兩面針薄層色譜鑒別

取本品8 g，研細，加水30 mL 使溶解，用濃氨試液調pH 值至11，用二氯甲烷振搖提取2 次，每次30 mL，合并二氯甲烷提取液，蒸干，殘渣加1 mL 二氯甲烷使溶解，作為供試品溶液。另取兩面針對照藥材1 g，加水30 mL，煮沸30 min，放冷，自“用濃氨試液調pH 值至11”起，同法制成對照藥材溶液。按處方工藝制成不含兩面針的樣品，同供試品溶液制備方法制成缺兩面針陰性對照溶液。照薄層色譜法（中國藥典2015 年版四部通則0502）試驗，吸取上述兩種溶液各10 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以二氯甲烷-甲醇-濃氨試液（40∶1∶0.2）為展開劑，展開，取出，晾干，在紫外光365 nm 下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上顯相同顏色的熒光斑點，陰性對照無干擾，斑點清晰，分離度較好,見圖1。

圖1 兩面針薄層色譜鑒別圖

2.2 兩面針摻偽研究

2.2.1 薄層色譜（TLC）檢查取本品8 g，研細，加乙醇40 mL，密塞，超聲處理40 min，放冷，濾過，濾液蒸干，殘渣加乙醇1mL 使溶解，作為供試品溶液。取毛兩面針素對照品，加乙醇制成每1 mL含1 mg 的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法（中國藥典2015 年版四部通則0502）試驗，吸取對照溶液5 μL，供試品溶液10 μL，分別點于同一硅膠G 薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲醇-異丙醇-濃氨試液（20 ∶5 ∶3 ∶1 ∶0.18）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光（365 nm）下檢視。供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，出現與毛兩面針素相同顏色的斑點，提示可能存在用兩面針混偽品投料的情況,見圖2。

圖2 毛兩面針素薄層色譜鑒別圖

2.2.2 高效液相色譜（HPLC）檢查對照品溶液的制備：取毛兩面針素對照品適量，精密稱定，加乙醇制成每1 mL 中含30 μg 的溶液，作為對照品溶液。供試品溶液的制備：取本品適量，研細，取4 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇20 mL，密塞，稱定重量，超聲處理（功率500 W,頻率40 KHz）40 min，放冷，再稱定重量，用70%乙醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。陰性對照溶液的制備：另按顆粒劑處方稱取除兩面針外的其他藥味及輔料適量，按照樣品制備工藝，同法制備陰性對照溶液。色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗：采用Hypersil BDS C18 色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫：35℃；流動相：乙腈-0.1%磷酸（21 ∶79）；PDA 檢測器，流速：0.8 min/mL；檢測波長：330 nm。理論塔板數按毛兩面針素峰計算應不低于3 000。取金雞顆粒陰性樣品溶液、毛兩面針素對照品溶液和初篩顯陽性樣品溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖,見圖3。

圖3 高效液相色譜圖

采用二極管陣列檢測器比較相應色譜峰在200～400 nm 波長范圍的紫外吸收光譜，初篩顯示金雞顆粒陽性樣品溶液與毛兩面針素對照品溶液的PDA 檢測紫外吸收光譜圖基本一致，見圖4。

圖4 紫外－可見吸收光譜圖

2.2.3 液質聯(lián)用（HPLC-MS/MS）確證3批疑似陽性樣品采用HPLC-MS/MS 進行確認，結果均出現與毛兩面針素對照色譜保留時間相同的色譜峰，且相應的提取離子流色譜圖與對照品一致。具體條件為：ACQUITY UPLC BEH C18 色譜柱（1.8 μm，50 mm×2.1 mm）；以乙腈-10 mmol醋酸銨溶液（18∶82）為流動相；柱溫30 ℃；電噴霧電離源（ESI），正離子模式，毛細管電壓2.5 kv，錐孔電壓40 V，萃取錐孔電壓4.0 V，脫溶劑溫度350 ℃，鞘氣流速600 L/h。毛兩面針素對照品溶液ESI+分子離子峰為m/z 309.13，與其結構吻合。對照品溶液及陽性樣品溶液一級質譜和二級質譜掃描圖見圖5。

圖5 液質聯(lián)用分析圖

2.2.4 篩查結果在本次篩查的21 批次樣品中，共有3 批金雞顆粒樣品檢出毛兩面針素，陽性樣品色譜保留時間與對照品色譜保留時間一致，且樣品峰在210～400 nm 波長范圍的紫外吸收光譜與對照品基本一致。對3 批次陽性樣品采用HPLC-MS/MS進行確認，出現與毛兩面針素對照品色譜保留時間相同的色譜峰，且與對照品的二級質譜圖一致。涉及樣品含量范圍為65.48～73.94 μg/g。

2.3 HPLC含量測定

2.3.1 對照品溶液的制備精密稱取毛兩面針素對照品12.22 mg，置50 mL 量瓶中，加乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得對照品溶液①（244.4 μg/mL），精密量取對照品溶液①3 mL 置10 mL 量瓶中，加乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得對照品溶液②（73.32 μg/mL）。

2.3.2 供試品溶液的制備及色譜條件供試品溶液的制備及色譜條件均同“2.2.2”項。

2.3.3 線性關系考察精密吸取對照品溶液②1、5、8、10 μL，對照品溶液①5、10 μL 注入液相色譜儀，測定，以峰面積積分值為縱坐標，進樣量（μg）為橫坐標，繪制標準曲線。其回歸方程為：Y=3×106X-2.03×105，R2=0.999 5。結果表明：毛兩面針素對照品在0.073 32～2.444 μg 范圍內線性關系良好。

2.3.4 精密度試驗精密吸取對照品溶液②（73.32 μg/mL），連續(xù)進樣6次，每次10 μL，分別記錄峰面積，計算RSD 為0.74%，結果表明儀器精密度良好。

2.3.5 重復性試驗取金雞顆粒（批號20160101），分別按照“2.2.2”項下方法制備供試品溶液各6 份，進樣10 μL 進行分析，金雞顆粒中毛兩面針素含量平均值為71.53 μg/g，RSD 為1.69%。結果表明該法重復性良好。

2.3.6 穩(wěn)定性試驗取“2.3.6”項下金雞顆粒同一份供試品溶液，室溫下放置，在0、2、6、12、22 h分別進樣10 μL 進行分析，分別記錄峰面積，計算RSD 為0.48%，結果表明供試品溶液在22 h 內穩(wěn)定性良好。

2.3.7 加樣回收率試驗取已測定含量的樣品（20160101，含毛兩面針素71.53 μg/g）2.0 g，共6 份，分別精密稱定，置已精密加入對照品溶液②（73.32 μg/mL）1.80 mL 蒸干后的具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇20 mL，密塞，稱定重量，超聲處理40 min，放冷，稱定重量，用70%乙醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。在上述液相色譜條件下進樣分析，按外標法計算加樣回收率，6 批樣品平均回收率為94.3%，RSD 為0.61%。結果表明該法加樣回收率較好。

2.3.8 檢出限和定量限精密量取“2.3.1”項下毛兩面針素對照溶液①（244.4 μg/mL）1 mL 置200 mL 容量瓶中，加乙醇稀釋至刻度，得對照品溶液③（1.222 μg/mL），根據進樣量不同，以信噪比為3∶1 的濃度作為儀器檢出限，信噪比為10 ∶1 的濃度為儀器定量限，測定其檢出限和定量限分別為1.22 ng 和3.44 ng。

2.3.9 樣品測定取金雞顆粒陽性樣品，照“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，進樣10 μL 進行測定，用外標法計算含量，測定結果表明3 批次毛兩面針素平均含量為70.31 μg/g，其中最高為73.94 μg/g，最低為65.48 μg/g。

3 討論

由于兩面針藥材生長周期較長，需求量逐年增加而野生資源不斷減少，導致兩面針市場混偽現象嚴重，造成臨床療效和用藥安全隱患。本文建立了金雞顆粒中兩面針的薄層色譜鑒別方法，同時對21批次樣品進行毛兩面針素檢查。結果表明，21 批次樣品中3 批次檢出毛兩面針素，檢出率為14%，表明可能存在用兩面針混偽品投料生產的情況，應對中成藥制劑中的摻偽或偽品投料情況引起高度重視，并加強監(jiān)管力度。