葡萄耐鋁毒基因MATE的克隆與表達分析

張永福，莫麗玲，徐金會，徐仕琴，裴徐梨

（昆明學院農(nóng)學與生命科學學院，云南昆明 650214）

【研究意義】地殼中含量最豐富的金屬元素是鋁，在pH值<5.0的酸性土壤中，大量Al3+進入土壤溶液而使作物遭受鋁毒害，嚴重抑制其生長[1]。全世界約有35%的可耕作土地為酸性（pH<5.0）土壤，而潛在的可耕種土地中約70%為酸性土壤[2]。酸性土壤占我國耕地總面積的21%，廣泛分布于南方各省（區(qū)）[3]。葡萄（Vitisspp.）為世界大宗果樹，因其漿果營養(yǎng)豐富、口感極佳而深受市場歡迎，取得較好的經(jīng)濟效益，因此近年來我國南方酸性土壤地區(qū)葡萄栽培面積迅速增加[4]。但葡萄耐鋁毒能力弱，鋁毒脅迫下，植株生長受抑，丙二醛含量、氧自由基產(chǎn)生速率、及SOD 和POD 活性均上升，根系活力下降[5]?？梢?，挖掘并克隆葡萄自身的耐鋁毒基因，獲得耐鋁性強的種質(zhì)資源勢在必行?！厩叭搜芯窟M展】植物在長期進化中產(chǎn)生了多種解除鋁毒的途徑[6-8]，其中，通過分泌蘋果酸[9]、檸檬酸[10-12]和草酸[13]等有機酸與Al3+螯合來緩解鋁毒是一條重要的途徑，相對而言檸檬酸螯合鋁的能力最強[14]。分泌檸檬酸的檸檬酸通道蛋白即次級主動運輸?shù)鞍准易逯械亩嗨幖岸拘詮秃衔锱懦龅鞍譓ATE（multidrug and toxic compound extrusion）[15]，該蛋白與植物次生代謝產(chǎn)物的解毒機制密切相關[10,16]。鋁毒脅迫下，MATE基因的表達能夠促進檸檬酸分泌和根尖生長，表明該基因的表達量與作物的耐鋁性呈正相關[17-18]。自從在高粱（Sorghum bicolor）中發(fā)現(xiàn)了第一個鋁誘導編碼的檸檬酸轉運蛋白基因即SbMATE基因[17]后，相距發(fā)現(xiàn)了擬南芥（Arabidopsis thali?ana）AtMATE基因[19]、玉米（Zea mays）ZmMATE基因[16]、飯豆（Vigna unguiculata）VuMATE基因[20]、紫花苜蓿（Medicago sativa）MsMATE基因[21]及香橙（Citrus junos）CjMATE基因[22]等，這些MATE基因通過介導檸檬酸的分泌來增強其耐鋁毒能力。【研究切入點】目前，雖然在上述植物中都克隆得到了MATE基因，且已知該基因編碼的MATE蛋白具有降低鋁毒對植物危害的功能，但在葡萄上還未見有MATE基因克隆與表達方面的研究報道。【擬解決的關鍵問題】本研究在前期對葡萄種質(zhì)資源耐鋁性評價的基礎上，挑選耐鋁性強的歐亞種品種‘紅地球’和耐鋁性弱的美洲種間雜種品種‘貝達’為試材，通過克隆分別獲得了VvMATE和VrlMATE兩個轉錄因子，并對其進行生物信息學分析和鋁脅迫下的基因表達、丙二醛含量和抗氧化酶活性分析，為進一步探明葡萄耐鋁毒的分子調(diào)控機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料及鋁脅迫處理

供試的葡萄品種‘紅地球’（Vitis vinifera‘Red Globe’）和‘貝達’（V.riparia×V.labrusca‘Beta’）均來源于云南省彌勒市東風農(nóng)場管理局，為1年生扦插苗。材料收集后用無土栽培的方式保存于昆明學院農(nóng)學實踐園，取其健康、成熟葉片用于MATE基因克隆。采集的葉片立即放入液氮中速凍后置于-80 ℃超低溫冰箱中保存。

鋁脅迫處理采用PVC 管道栽培的方式，管道一共兩層，間距80 cm，在兩層管道兩端的上部，用直徑3 cm 的PVC 管連接，并在一端安裝抽水泵，使管中液體在上下兩層管子中循環(huán)流動，調(diào)節(jié)抽水泵的抽水量使上下兩層管中的液體量保持動態(tài)平衡，每天打開泵抽水時間不少于4 h。用于栽培葡萄的管道直徑18 cm、長200 cm，管道的同一面上每隔40 cm 設置一個直徑為10 cm 的栽培孔。鋁脅迫前，分別把‘紅地球’和‘貝達’1 年生苗的根系放入栽培孔中并用陶粒固定，在每一層管道內(nèi)加入2/3 管的1/2 Hoagland’s營養(yǎng)液（pH=4.5）。緩苗后，在1/2 Hoagland’s營養(yǎng)液（pH=4.5）中加入5 mmol/L鋁[Al2（SO4）3·18H2O，pH=4.5]進行脅迫處理。在鋁脅迫的第0、7、14、21、28 天時，分別采集兩份試材的健康、成熟葉片，用于MATE基因的表達分析。采集的葉片立即放入液氮中速凍后置于-80 ℃超低溫冰箱中保存。

1.2 RNA的提取和cDNA的合成

稱取0.1 g 葉樣品，加1 mL TPIzol 提取液后研磨成勻漿，再加0.2 mL 氯仿后室溫放置5 min，4 ℃、12 000 r/min離心10 min。取上清，加入異丙醇0.5 mL，搖勻后室溫放置10 min，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，倒棄上清，用75%乙醇洗滌沉淀，倒去乙醇后風干沉淀，加DEPC 水100 μL 溶解DNA。cDNA 第1 鏈用TaKaRa公司的PrimeScript 1stStrand cDNA Synthesis Kit試劑盒進行逆轉錄合成，方法參照說明書。

1.3 MATE全長cDNA的克隆

按照已報道的擬南芥AtMATE 蛋白序列，在Phytozome葡萄基因組數(shù)據(jù)庫中進行BlastP搜索，獲得葡萄同源基因的cDNA 及氨基酸序列。根據(jù)該cDNA 序列，用Premier 5.0 設計引物（表1）并送生物公司合成。用高保真酶PrimeSRAHS DNA Polymerase 進行基因擴增。擴增程序：98 ℃預變性2 min；98 ℃變性10 s，58 ℃復性10 s，72 ℃延伸25 s，35個循環(huán)；最后72 ℃延伸2 min。擴增結束后，產(chǎn)物在1.2%瓊脂糖凝膠上點樣進行電泳檢測，切膠回收目的條帶（從Axygen 公司購買回收試劑盒），與pMD19-T Vector 連接，轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞，把陽性克隆挑出送北京擎科新業(yè)生物技術有限公司測序。

1.4 MATE基因生物信息學分析

MATE基因翻譯成蛋白質(zhì)序列使用NCBI在線分析軟件ORFfinder，預測蛋白質(zhì)分子量和理論等電位使用ProtParam tool（http://web.expasy.org/protparam/）；預測蛋白質(zhì)二級結構使用GOR4（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_gor4.html）；預測蛋白質(zhì)三級結構使用SWISS-MODEL（https://www.swissmodel.expasy.org/interactive）；堿基酸序列分析比對用NCBI的BlastN、BlastP，氨基酸多序列比對和構建系統(tǒng)進化樹用DNAMAN 8.0和MEGA 7.0軟件。

1.5 MATE基因的表達量分析

參照TSE202[2xT5 Fast qPCR Mix（SYBR Green I），擎科]的說明書進行熒光定量PCR 分析，以GAP?DH基因作為內(nèi)參基因，對鋁脅迫不同時期的葡萄葉片MATE基因表達量進行熒光定量，引物序列見表1。以合成的cDNA 作為模板，按照2×T5 Fast qPCR Mix（SYBR Green I）試劑盒的說明書進行操作，反應體系為2×T5 Fast qPCR Mix（SYBR Green I）10μL、上下游引物各0.8μL、cDNA 1.0μL，加Nuclease-free Water至20μL。熒光定量PCR 反應程序為：預變性95 ℃1 min；循環(huán)階段95 ℃10 s，60 ℃5 s，72 ℃10 s，40 個循環(huán)；熔解階段95 ℃15 s，60 ℃1 min、95 ℃15 s、0.3 ℃/20 s。待反應結束后進行熒光值變化曲線和溶解曲線分析。

表1 研究所用引物序列Tab.1 Sequence of primers in this research

1.6 生理指標的測定

通過雙組分光光度法測定丙二醛含量，通過氮藍四唑光還原法測定超氧化物歧化酶（SOD）活性，通過愈創(chuàng)木酚-H2O2顯色法測定過氧化物酶（POD）活性[23]。

2 結果與分析

2.1 葡萄MATE基因ORF序列的克隆

分別從‘紅地球’和‘貝達’葉片中提取總RNA后，使用核酸蛋白檢測儀測得濃度分別為561.2μg/mL和603.6μg/mL，A260/A280分別為1.81和1.78，說明所提取的RNA 純度較高，可直接將其保存于-80 ℃冰箱中備用。以逆轉錄得到的‘紅地球’和‘貝達’cDNA為模板，用特異性引物擴增出長度均為1 800 bp 左右的條帶，與目標條帶的大小一致（圖1）。將二者的克隆結果送到北京擎科新業(yè)生物技術有限公司測序，發(fā)現(xiàn)二者的序列長度均為1 794 bp，序列與轉錄組獲得的序列一致，通過DNAMAN 8.0分析得出其編碼的氨基酸均為597個和1個終止密碼子（圖2和圖3）。

2.2 MATE氨基酸序列的理化性質(zhì)

用ProtParam tool 在線工具對‘紅地球’和‘貝達’的MATE 多肽鏈氨基酸數(shù)目、分子式、等電點、相對分子量等進行預測。在‘紅地球’中，MATE基因共編碼597 個氨基酸，分子式為C3133H4918N838O820S26，分子質(zhì)量為68.28 ku，理論等電點（pI）為10.15，含9 735 個原子；在‘貝達’中，MATE基因共編碼597 個氨基酸，分子式為C3162H4905N837O848S19，分子量為68.82 ku，理論等電點（pI）為9.92，含9 771個原子。

2.3 MATE蛋白的結構預測

圖1 葡萄MATE基因PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.1 The gel electrophoresis PCR product ofMATEin grape

圖2 ‘紅地球’的MATE基因cDNA全長序列及氨基酸序列Fig.2 MATEgene cDNA and amino sequence of‘Red Globe’

蛋白多肽鏈本身的折疊和盤繞方式即蛋白的二級結構。用GOR4對MATE基因編碼的蛋白二級結構進行預測，結果如圖4所示：在組成‘紅地球’MATE蛋白的597個氨基酸中，無規(guī)則卷曲（Cc）占52.43%、α-螺旋（Hh）占26.97%、折疊延伸鏈（Ee）占20.60%；在組成‘貝達’MATE 蛋白的597 個氨基酸中，無規(guī)則卷曲（Cc）占49.73%、α-螺旋（Hh）占33.21%、折疊延伸鏈（Ee）占17.06%。兩個品種二級結構中占比由高到低均有無規(guī)則卷曲、α-螺旋和折疊延伸鏈的規(guī)律，α-螺旋（Hh）對蛋白骨架主要起到穩(wěn)定作用，而無規(guī)則卷曲（Cc）結構決定了蛋白質(zhì)的功能，兩個葡萄品種MATE蛋白無規(guī)則卷曲（Cc）和α-螺旋（Hh）所占比例最大，說明MATE基因對葡萄的解毒起著重要的作用。

圖3 ‘貝達’MATE基因全長序列及氨基酸序列Fig.3 MATEgene cDNA and amino sequence of‘Beta’

用SWISS-MODEL 在線工具進行預測后發(fā)現(xiàn)，葡萄MATE 蛋白的三維結構由α-螺旋、β-折疊片、β-轉角等組成。如圖5 所示，‘紅地球’MATE 蛋白的三級結構含有2 個α-螺旋、3 個β-折疊片、4 個β-轉角；‘貝達’MATE蛋白的三級結構含有2個α-螺旋、3個β-折疊片、3個β-轉角。

圖4 MATE蛋白的二級結構預測Fig.4 Secondary structure prediction of the MATE protein

2.4 MATE系統(tǒng)進化關系結果

利用生物分析軟件MEGA 7.0 構建了‘紅地球’、‘貝達’、甘藍（Brassica oleracea）、油菜（Brassica na?pus）、擬南芥、紫花苜蓿、大豆（Glycine max）、飯豆、黑麥（Secale cereale）、高粱、水稻（Oryza sativa）、大麥（Hordeum vulgare）、小麥（Triticum aestivum）、棉花（Gossypium arboretum）、蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）、木豆（Cajanus cajan）、玉米等的MATE 同源蛋白的系統(tǒng)進化樹。發(fā)現(xiàn)‘紅地球’和‘貝達’的MATE 蛋白在氨基酸序列上具有高度同一性，相似度達91%。二者與大麥、小麥、高粱、水稻的同源性均在70%以上，與其他幾個種的同源性在40%～60%。此外，從系統(tǒng)進化樹上亦發(fā)現(xiàn)，‘紅地球’與‘貝達’在同一個分支上，表明二者的MATE基因具有極近的親緣關系；二者與高粱、水稻、大麥、小麥等的MATE蛋白氨基酸序列親緣關系較近，與棉花、蒺藜苜蓿、木豆、玉米的MATE蛋白氨基酸序列親緣關系較遠（圖6）。

圖5 MATE蛋白的三級結構模型預測Fig.5 Prediction results of the tertiary structure model of the MATE protein

圖6 葡萄MATE蛋白與其他植物MATE蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹構建Fig.6 Phylogenetic tree construction results of MATE protein and other plant MATE proteins

2.5 鋁脅迫期間葡萄MATE基因的相對表達量及MDA含量、抗氧化酶活性

通過qRT-PCR 分析發(fā)現(xiàn)，鋁脅迫前，‘紅地球’和‘貝達’的MATE基因相對表達量均在900 以下，但‘紅地球’比‘貝達’高130.09%；‘紅地球’MATE基因表達量的峰值在鋁脅迫的第14 天，比鋁脅迫前上升了281.08%，而到鋁脅迫的第28 天則下降了15.14%，此時比‘貝達’高1868.15%；‘貝達’MATE基因表達量的峰值在鋁脅迫的第7 天，比鋁脅迫前上升了83.88%，而到鋁脅迫的第28 天則降至比鋁脅迫前低52.28%（圖7）?？梢姡X脅迫下耐鋁性強的葡萄品種‘紅地球’MATE基因表達量高，上升幅度大，且峰值出現(xiàn)的晚。

丙二醛是細胞膜脂過氧化的產(chǎn)物，其含量與膜脂受氧化破壞的程度呈正相關。圖7所示，鋁脅迫前，‘紅地球’與‘貝達’的丙二醛含量相差不大；從鋁脅迫開始至脅迫的第21天，兩個品種均呈上升趨勢，且‘貝達’的含量始終高于‘紅地球’，到鋁脅迫的第21 天時，‘貝達’達到峰值，比‘紅地球’高18.45%；鋁脅迫的第21 天后，‘紅地球’丙二醛含量繼續(xù)上升，‘貝達’則開始下降，到鋁脅迫的第28 天時，‘紅地球’比‘貝達’高44.31%。

SOD和POD可通過分解活性氧來防止膜脂被氧化破壞，其活性與防止膜脂被氧化破壞的能力呈正相關。從圖7還可看出，鋁脅迫期間，‘紅地球’的SOD活性均不同程度的高于‘貝達’；從鋁脅迫開始至第7天，兩個品種的SOD活性均上升，且‘貝達’于鋁脅迫的第7天達到峰值，此時比鋁脅迫前高33.93%、比‘紅地球’低18.82%；‘紅地球’的峰值在鋁脅迫的第14天出現(xiàn)，此時比鋁脅迫前高61.20%、比‘貝達’高49.64%；到鋁脅迫的第28天，‘紅地球’比‘貝達’高97.41%。鋁脅迫前，‘貝達’的POD活性比‘紅地球’高140.20%，在鋁脅迫的第14天達到峰值，此時比鋁脅迫前高21.22%；而‘紅地球’從鋁脅迫開始至第28天均在上升，到第28天時共上升了226.47%，此時比‘貝達’高23.33%?？梢姡弯X性強的‘紅地球’在鋁脅迫下丙二醛含量和抗氧化酶活性的峰值出現(xiàn)較晚，細胞膜受破壞的程度低，這與MATE基因的表達量較一致。

圖7 鋁脅迫期間MATE基因的相對表達量及膜脂過氧化指標的變化Fig.7 Relative expression ofMATEgene and changes of membrane lipid peroxidation indices during aluminum stress

3 討論與結論

全世界的耕地約有35%為酸性土壤[2]，而我國南方地區(qū)幾乎全為酸性土壤[3]。這些地區(qū)起源的植物為適應環(huán)境而進化出多種耐鋁機制，如分泌有機酸就是其耐鋁機制之一[10-12]。植物感受到鋁脅迫信號后立即激活細胞膜上的H+-ATPase酶，然后通過把大量H+泵到細胞外形成質(zhì)子電化學梯度，使大量檸檬酸從檸檬酸通道蛋白中排出，從而使其耐鋁性提高[24]。檸檬酸通道蛋白的合成受檸檬酸通道蛋白基因控制，第一個由鋁誘導編碼檸檬酸通道蛋白的基因是在高粱中發(fā)現(xiàn)的SbMATE基因[17]，隨后相距發(fā)現(xiàn)了擬南芥AtMATE基因[19]、小麥TaMATE1基因[25]、玉米ZmMATE基因[16]和丹波黑大豆GmMATE基因[26]。據(jù)報道[27]，把耐鋁性強的大麥品種的MATE基因轉入耐鋁性弱的大麥和小麥品種中，轉基因植株的檸檬酸分泌量增多，耐鋁性明顯增強。這些為探究葡萄MATE基因提供了研究思路和理論依據(jù)。

在前期研究探明了‘紅地球’的耐鋁毒能力強于‘貝達’的基礎上，本研究分別克隆出了二者的MATE基因，分別命名為VvMATE和VrlMATE基因。MATE基因在植物的耐鋁性中起著重要作用，這在擬南芥[19]、高粱[17]和玉米[16]等多種作物中均有報道。張寶云[19]發(fā)現(xiàn)，紫花苜蓿由MsMATE基因編碼的MsMATE通道蛋白定位于質(zhì)膜上，鋁脅迫下促進檸檬酸分泌，可推測本研究由VvMATE和VrlMATE基因編碼的VvMATE 蛋白和VrlMATE 蛋白亦定位于質(zhì)膜上且具有響應鋁脅迫分泌檸檬酸的功能。進化分析表明，兩個葡萄品種‘紅地球’VvMATE 蛋白與‘貝達’VrlMATE 蛋白的親緣關系最近，同源性達91%，二者與大麥HvMATE、小麥TaMATE、高粱SbMATE 和水稻OsMATE 的同源性均在70%以上，與甘藍BoMATE、油菜BnMATE、紫花苜蓿MsMATE 和大豆GmMATE 等的同源性僅40%～60%不等?？梢?，不同植物MATE蛋白的氨基酸序列同源性相對較低，這與前人的研究結果相似[28-29]，且不同物種間MATE 蛋白氨基酸具有較高的保守性。

鋁脅迫可調(diào)控絕大多數(shù)植物MATE基因的表達，如鋁毒脅迫下高粱SbMATE基因[17]、擬南芥AtMATE基因[19]、玉米ZmMATE基因[16]及丹波黑大豆GmMATE2基因[26]的表達量均顯著增高，但亦有研究報道[30]，鋁脅迫下，大豆GmMATE基因的表達量并沒有明顯的變化。本研究中，在整個鋁脅迫期間，耐鋁性強的‘紅地球’的MATE基因表達量遠高于耐鋁性弱的‘貝達’；在鋁脅迫的前14 d，‘紅地球’的VvMATE基因表達量均大幅度上升，但從脅迫的第14天至第28天，則略有下降趨勢；而‘貝達’的VrlMATE基因表達量僅在鋁脅迫前7 d 略有上升。整個鋁脅迫期間，‘紅地球’的丙二醛含量和POD 活性一直上升，SOD 活性則大幅度上升后又緩慢下降，說明該品種耐鋁性強的原因除了VvMATE基因的高表達量使其分泌大量檸檬酸外，抗氧化酶活性增強使細胞膜受氧化破壞程度較輕也是一個重要的原因。

綜上，本研究克隆了兩個葡萄品種‘紅地球’和‘貝達’的VvMATE和VrlMATE基因，二者的序列長度均為1 794 bp，編碼597 個氨基酸；二者的分子質(zhì)量分別為68.28 ku 和68.82 ku，理論等電點（pI）分別為10.15 和9.92?！t地球’和‘貝達’的二級結構各組分占比由高到低均為無規(guī)則卷曲、α-螺旋>折疊延伸鏈，三級空間結構由α-螺旋、β-折疊片和β-轉角等組成。系統(tǒng)進化樹分析發(fā)現(xiàn)，VvMATE和VrlMATE的同源性為91%，二者與大麥HvMATE、小麥TaMATE、高粱SbMATE 和水稻OsMATE 的同源性均在70%以上。此外，鋁脅迫下，兩個葡萄品種的MATE基因表達量均先上升后下降，其中耐鋁性強的‘紅地球’MATE基因表達量與抗氧化酶的上升幅度均大于耐鋁性弱的‘貝達’。