檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒和豬圓環(huán)病毒的二重?zé)晒釲AMP方法的建立

謝志勤，張民秀，謝芝勛，范晴，羅思思，謝麗基，黃嬌玲，王盛，曾婷婷，張艷芳，李孟，李丹，鄧顯文，劉加波

(廣西獸醫(yī)研究所，廣西獸醫(yī)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南寧 530001)

豬繁殖與呼吸綜合征(porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome viruses，PRRSV)引起的豬一種急性傳染病，俗稱豬藍(lán)耳病，病豬表現(xiàn)為食欲不振，體溫升高，以耳跟和腹部發(fā)紅為明顯特征，發(fā)病率和死亡率極高，該病對豬的危害性極大，引起極大的經(jīng)濟(jì)損失[1-2]。豬圓環(huán)病毒病(porcine circovirus disease,PCVD))是由豬圓環(huán)病毒2型(porcine circovirus 2,PCV2)引起的豬一種傳染病，病豬以早期淋巴結(jié)腫大，食欲不振，呼吸困難，腹瀉，早產(chǎn)及死胎等為特征，發(fā)病率20%～60%和死亡率5%～35%[3-5]。PRRSV和PCV2可同時引起豬致病，臨床上常有PRRSV和PCV混合感染的報道[6-10]，而且兩種病引起豬的臨床癥狀有時很相似，共同的癥狀表現(xiàn)為體溫升高、急性死亡、懷孕母豬流產(chǎn)或死胎等，單靠臨床診斷很難作出判斷，需要借助實(shí)驗(yàn)室才能進(jìn)行確診。目前實(shí)驗(yàn)室診斷這兩種病的方法常見的有病原分離鑒定[11-13]、PCR方法[14-20]、熒光定量PCR方法[21-23]、ELISA方法[24-25]、LAMP方法[26]和GeXP方法[27]等，這些方法都各有優(yōu)點(diǎn)與缺點(diǎn)。本研究建立一種檢測PRRSV和PCV的二重?zé)晒釲AMP方法，可直接通過觀察反應(yīng)顏色來判斷結(jié)果。

1 材料與方法

1.1 所用儀器和實(shí)驗(yàn)試劑 Loopamp度儀：日本榮研公司產(chǎn)品(型號Loopamp LA-320C)；核酸測定儀:美國ThermoFisher Scientific公司產(chǎn)品(型號NanoDrop 2000)；多色熒光成像分析系統(tǒng)：美國BIO-RAD公司產(chǎn)品；LAMP 試劑盒購自榮研生物科技(中國)有限公司產(chǎn)品(批號8Y007)；Bst 3.0 DNA/RNA 聚合酶購自NEB 公司(New England Biolabs Inc.Catalog# M0374)；RNA/DNA提取試劑盒和質(zhì)粒小量提取試劑盒購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；premixTaq PCR試劑盒和PMD-20T載體購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.2 試驗(yàn)用毒株 豬繁殖與呼吸綜合征毒株 CH-1R(美洲型)購自哈爾濱維科生物技術(shù)開發(fā)公司，豬圓環(huán)病毒2 BH5 株(PCV2 BH5)由廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所保存提供。對照用的毒株：豬口蹄疫O型滅活疫苗(Food and mouth Disease Virus,FMDV O型)購自蘭州獸醫(yī)研究所，豬細(xì)小病毒 (Porcine Parvovirus,PPV)、豬日本乙型腦炎病毒(Japanese Encephalitis Virus,JEV)、豬偽狂犬病病毒(Pseudorabies Virus,PRV)、豬布氏桿菌2號(Brucellasuis,BS2)、豬鏈球菌2型(Streptococcussuis,SS2)由廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所保存提供，豬瘟兔化弱毒株(C株)由廣西麗原生物股份有限公司提供，豬瘟毒株石門株(F114)購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.3 設(shè)計引物和探針 根據(jù)Genebank上發(fā)表的豬繁殖與呼吸綜合征病毒NSP2基因(登錄號：MF772778.1)和豬圓環(huán)病毒 ORF2基因(登錄號：KY947578.1)序列保守區(qū)域，通過MEGA 5.0 在線比對分析，然后用 primer premier 5.0和Primer explore V4軟件分別設(shè)計了2套用于LAMP特異性擴(kuò)增的引物及探針。特異性引物包括外引物F3和B3，內(nèi)引物FIP(FIP=F1c+F2)和BIP(BIP=B1c+B2)。設(shè)計的探針序列介于F1c和B1c之間，并且在探針的兩端分別標(biāo)記熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)。PRRSV-Probe 探針的5’端標(biāo)記熒光基團(tuán)FAM，3’端標(biāo)記了淬滅基團(tuán)BHQ1，在520 nm波長通道下，游離的FAM熒光基團(tuán)會激發(fā)出綠色熒光。PCV-Probe 5’端標(biāo)記熒光基團(tuán)Cy5.5，3’端標(biāo)記淬滅基團(tuán)BHQ2,在690 nm上下波長通道下，游離的Cy5.5熒光基團(tuán)會激發(fā)出紅色。引物由大連寶生物公司合成,HPLC級純化,引物序列見表1，引物設(shè)計位置示意圖見圖1。

圖1 PRRSV和PCV2 引物設(shè)計位置示意圖

1.4 病原核酸提取 按照RNA/DNA提取試劑盒說明書要求步驟進(jìn)行病原核酸的提取，首先吸取250 μL 病毒液或經(jīng)處理的臨床樣品上清液至1.5 mL離心管中，加入裂解液200 μL和蛋白酶K 20 μL混合，然后按步驟進(jìn)行病原RNA/DNA提取，最后加TE洗脫緩沖液25 μL離心洗脫RNA/DNA，分裝放-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)模板的制備 將提取PRRSV CH-1R的RNA反轉(zhuǎn)錄成 cDNA,然后用PRRSV外引物(PRRSV-B3，PRRSV-F3)擴(kuò)增反轉(zhuǎn)錄后的cDNA模板，擴(kuò)增產(chǎn)物片斷大小約為228 bp。同樣，用PCV外引物(PCV-F3，PCV-B3)擴(kuò)增PCV2 BH5的DNA模板，擴(kuò)增產(chǎn)物片斷大小約為324 bp。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳切膠回收，與PMD-20T載體連接轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α，經(jīng)PCR和雙酶切鑒定重組菌，用質(zhì)粒小量試劑盒提取培養(yǎng)的陽性重組菌中的質(zhì)粒。用NanoDrop 2000測定提取質(zhì)粒的濃度，然后按公式計算換為拷貝數(shù)：拷貝數(shù)(copies/μL)=6.02×1023/660×3000×10-9×質(zhì)粒濃度(g/μL)。將等量的兩種模板按不同濃度進(jìn)行配比或按梯度進(jìn)行稀釋混合，制備標(biāo)準(zhǔn)模板保存于-70 ℃?zhèn)溆没蛑苯討?yīng)用。

1.6 二重?zé)晒釲AMP反應(yīng)的建立 將制備的PRRSV CH-1R和PCV2 BH5標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒模板，按不同的濃度進(jìn)行配比混合，然后加入二重?zé)晒釲AMP反應(yīng)體系，并對反應(yīng)體系中引物濃度、探針濃度及退火延伸溫度范圍進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化的引物濃度、探針濃度及溫度范圍如下：內(nèi)引物5～60 pmoL/μL，外引物1～20 pmoL/μL，探針0.1～1 pmoL/μL，退火和延伸溫度范圍60～68 ℃。

1.7 LAMP結(jié)果判定 將反應(yīng)產(chǎn)物取出，置多色熒光成像分析系統(tǒng)中，選擇520 nm和690 nm熒光通道下顯色，在520 nm熒光通道下，PRRSV標(biāo)準(zhǔn)樣品呈綠色，PCV標(biāo)準(zhǔn)樣品及陰性對照樣品為無色。在690 nm熒光通道下，PCV標(biāo)準(zhǔn)樣品呈紅色，PRRSV標(biāo)準(zhǔn)樣品及陰性對照樣品為無色。在520 nm和690 nm共同熒光通道下，同時含有PRRSV和PCV標(biāo)準(zhǔn)混合樣品呈黃色，陰性對照樣品為無色。在以上熒光通道樣品成立的情況下，根據(jù)顏色判斷檢測樣品結(jié)果，結(jié)果直觀準(zhǔn)確，容易判斷。

1.8 二重LAMP特異性測試 提取PRRSV CH-1R 的RNA 和PCV2 BH5 的DNA,對照毒株CSFV C、FMDV O型、PPV、JEV、PRV、BS2、SS2 的RNA或DNA，并測定其濃度，用建立的方法對這些核酸進(jìn)行二重?zé)晒釲AMP擴(kuò)增檢測，驗(yàn)證本方法的特異性。

1.9 二重LAMP敏感性和干擾性測試 將制備的PRRS CH-1R和PCV2 BH5毒株的標(biāo)準(zhǔn)模板測定濃度，根據(jù)濃度換算為拷貝數(shù)，然后作10倍梯度稀釋為1×107～100拷貝/μL，將各梯度相同拷貝濃度的PRRSV和PCV 核酸等體積混合，利用本實(shí)驗(yàn)建立的二重?zé)晒釲AMP方法對PRRSV和PCV 混合模板進(jìn)行測試，檢驗(yàn)本方法的最低檢出的拷貝數(shù)。同樣，將不同拷貝濃度的PRRSV和PCV 核酸交叉兩兩等體積混合，利用本實(shí)驗(yàn)建立的二重?zé)晒釲AMP方法對PRRSV和PCV 混合模板進(jìn)行測試，檢驗(yàn)不同的模板濃度對本方法的干擾性。

1.10 臨床樣品檢測驗(yàn)證 采集來自廣西不同地區(qū)不同豬場的患病豬的臨床樣品93份，這些樣品包括肺組織41份和淋巴結(jié)52份。提取肺組織及淋巴結(jié)組織中病毒核酸：取適量的肺組織、淋巴結(jié)分別進(jìn)行研磨，按1∶5加入滅菌的磷酸鹽緩沖溶液(PBS)繼續(xù)研磨勻漿，吸取1.5 mL勻漿放入到2 mL EP管中，-70 ℃反復(fù)凍融 3次，3000 r/min 離心5 min，吸取上清液250 μL按RNA/DNA提取試劑盒說明提取核酸，然后用本實(shí)驗(yàn)建立的二重?zé)晒釲AMP進(jìn)行擴(kuò)增檢測，同時用已建立的PRRSV和PCV熒光定量PCR方法作對比檢測,擴(kuò)增陽性PCR產(chǎn)物送生物公司進(jìn)行測序測定，以驗(yàn)證本方法建立的二重?zé)晒釲AMP的準(zhǔn)確性。

2 結(jié)果與分析

2.1 二重LAMP方法的建立 將制備的PRRSV CH-1R和PCV2 BH5標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒模板加入到二重?zé)晒釲AMP反應(yīng)，反應(yīng)體系為25 μL，經(jīng)優(yōu)化后的最佳反應(yīng)試劑如下：2×LAMP buffer 12.5 μL(日本SIGMA Tokyo公司產(chǎn)品，內(nèi)含100 mM KCl，200 Mm pH 8.8的Tris-HCl，100 mM (NH4)2SO4，80 mM MgSO4，8M betaine，1% Tween-20，14 mM dNTPs)，Bst3.0 DNA/RNA 聚合酶320 U，40 pmoL/μL內(nèi)引物PRRSV-FIP、PRRSV-BIP、PCV-FIP和PCV-BIP各1 μL(工作終濃度分別為1.6 pmoL)，5 pmoL外引物PRRSV-F3、PRRSV-B3、PCV-B3和PCV-F3各1 μL(工作終濃度分別為0.2 pmoL)，0.5 pmoL探針PRRSV-Probe和PCV-Probe各1 μL(工作終濃度分別為0.02 pmoL)，模板 2 μL，用滅菌超純水補(bǔ)足25 μL。將各試劑輕輕混合，然后置Loopamp濁度儀或恒溫水浴鍋。經(jīng)優(yōu)化后最佳的退火延伸溫度為62 ℃，反應(yīng)90 min，85 ℃ 5 min結(jié)束反應(yīng)。獲得的結(jié)果見圖2。圖2中A為520 nm熒光通道下，含有PRRSV CH1R樣品的1管和3管呈綠色，含有PCV2、對照水及CSFV C株的2管、4管和5管呈無顏色。B為690 nm熒光通道下，含有PCV2 BH5樣品的2管和3管呈紅色，含有PRRSV CH1R、對照水及CSFV C株的1管、4管和5管呈無顏色。C為520 nm和690 nm共同熒光通道下，含有PRRSV CH1R樣品的1管呈綠色，含有PCV2 BH5樣品的2管呈紅色，同時含有PRRSV CH1R和PCV2 BH5樣品的3管呈黃色，含有對照水及CSFV C株的4管和5管呈無顏色。

2.2 特異性測試結(jié)果 用建立的方法對PRRSV和PCV毒株以及對照用的毒株的核酸進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果本方法只擴(kuò)增出PRRSV和PCV毒株，參試的對照毒株CSFV C、FMDV O型、PPV、JEV、PRV、BS2、SS2 沒有呈現(xiàn)任何顏色，即對照毒株沒有擴(kuò)增。PRRSV與PCV毒株間沒有交叉顏色變化，具有良好的特異性，結(jié)果見圖3。圖3中A為520 nm熒光通道下，含有PRRSV CH1R樣品的1管和3管呈綠色，含有PCV2 BH5、CSFV C株、FMDV O型、PPV、JEV、PRV、BS2、SS2的2管、4管至10管呈無顏色。B為690 nm熒光通道下，含有PCV2 BH5樣品的2管和3管呈紅色，含有PRRSV CH1R、CSFV C株、FMDV O型、PPV、JEV、PRV、BS2、SS2的1管、4管至10管呈無顏色。C為520 nm和690 nm共同熒光通道下，含有PRRSV CH1R樣品的1管呈綠色，含有PCV2 BH5樣品的2管呈紅色，同時含有PRRSV CH1R和PCV2 BH5樣品的3管呈黃色，含有CSFV C株、FMDV O型、PPV、JEV、PRV、BS2、SS2的4管至10管呈無顏色。

2.3 敏感性測試結(jié)果 用本方法對制備的標(biāo)準(zhǔn)模板濃度分別為1×107～100拷貝/μL進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示本方法最低能檢測出100個拷貝的PRRSV和PCV混合模板濃度，結(jié)果見圖4。圖4中A為520 nm熒光通道下，1管至6管分別為107～102拷貝/μL的PRRSV和PCV2混合模板標(biāo)準(zhǔn)品，呈綠色，7管和8管為101～100拷貝/μL的PRRSV和PCV2混合模板標(biāo)準(zhǔn)品，呈無色。B為690 nm熒光通道下，1管至6管分別為107～102拷貝/μL的PRRSV和PCV2混合模板標(biāo)準(zhǔn)品，呈紅色，7管和8管為101～100拷貝/μL的PRRSV和PCV2混合模板標(biāo)準(zhǔn)品，呈無色。C為520 nm和690 nm共同熒光通道下，1管至6管分別為107～102拷貝/μL的PRRSV和PCV2混合模板標(biāo)準(zhǔn)品，呈黃色，7管和8管為101～100拷貝/μL的PRRSV和PCV2混合模板標(biāo)準(zhǔn)品，呈無色。

2.4 干擾性測試結(jié)果 將PRRSV CH-1R和PCV2 BH5 標(biāo)準(zhǔn)模板按不同濃度進(jìn)行組合，制備不同模板濃度的混合樣品，用建立的方法進(jìn)行檢測，不同模板濃度的混合樣品如下：樣品1(107PRRSV+101PCV)，樣品2(106PRRSV+102PCV)，樣品3(105PRRSV+103PCV)，樣品4(104PRRSV+104PCV)，樣品5(103PRRSV+105PCV)，樣品6(102PRRSV+106PCV)，樣品7(101PRRSV+107PCV)。結(jié)果當(dāng)兩個模板濃度不同時，尤其是一個模板濃度高，另一個模板濃度低時，本方法仍然可鑒別檢測到不同的兩個模板，即不同的模板濃度對本方法干擾性小，結(jié)果見圖5。圖5中A為520 nm熒光通道下，1管至6管的樣品1、樣品2、樣品3、樣品4、樣品5、樣品6呈綠色，7管的樣品7呈無色。B為690 nm熒光通道下，2管至7管的樣品2、樣品3、樣品4、樣品5、樣品6、樣品7呈紅色，1管的樣品1呈無色。C為520 nm和690 nm共同熒光通道下，1管的樣品1呈綠色，7管的樣品7呈紅色，2管至6管的樣品2、樣品3、樣品4、樣品5、樣品6呈黃色。

(1.PRRSV CH1R;2.PCV2 BH5;3.PRRSV CH1R和PCV2 BH5;4.對照水;5.CSFV C株,A為520 nm熒光通道圖；B為690 nm熒光通道圖；C為520 nm和690 nm熒光雙通道圖)

(1～8.107～100拷貝/μL(PRRSV和PCV2混合模板標(biāo)準(zhǔn)品，A為520 nm熒光通道圖；B為690 nm熒光通道圖；C為520 nm和690 nm熒光雙通道圖)

(樣品1(107PRRSV+101PCV)，樣品2(106PRRSV+102PCV)，樣品3(105PRRSV+103PCV)，樣品4(104PRRSV+104PCV)，樣品5(103PRRSV+105PCV)，樣品6(102PRRSV+106PCV)，樣品7(101PRRSV+107PCV)。A為520 nm熒光通道圖；B為690 nm熒光通道圖；C為520 nm和690 nm熒光雙通道圖)

2.5 臨床樣品驗(yàn)證 用本實(shí)驗(yàn)建立的二重?zé)晒釲AMP方法對臨床樣品93份進(jìn)行檢測，檢測結(jié)果PRRSV陽性樣品12份，檢測陽性率為10.7%，PCV陽性樣品8份，檢測陽性率為7.14%。同時為PRRSV和PCV陽性樣品5份，即為混合感染樣品，混合感染率為 5.38%，這一結(jié)果與熒光定量PCR方法檢測結(jié)果一致。檢測的所有陽性樣品產(chǎn)物送生物公司測序，測序結(jié)果經(jīng)序列比對分析全為對應(yīng)病毒。

3 討論與結(jié)論

新型LAMP檢測方法是Notomi等于2000年首先建立，該方法是采用恒溫進(jìn)行擴(kuò)增，操作較簡便，成本低，隨后被應(yīng)用于各類疫病的檢測中[28-29]。隨著技術(shù)研究的進(jìn)步，已成功建立了基于多種顏色的二重LAMP方法，一次擴(kuò)增能有效區(qū)分鑒別二種病原體[30]。本研究根據(jù)二重LAMP的特點(diǎn)，在FIP與BIP引物之間設(shè)計插入了一條Taqman 探針，在探針的5’端標(biāo)志不同的熒光基團(tuán)，在3’標(biāo)志有淬滅基因。探針本身并不會發(fā)光，當(dāng)加入 LAMP反應(yīng)中，探針序列結(jié)合到模板序列上，隨著內(nèi)外引物特異性結(jié)合延伸，迫使與模板結(jié)合的探針斷裂，熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)斷開，熒光基團(tuán)成為游離基團(tuán)，這樣游離的熒光基團(tuán)在沒有淬滅基團(tuán)淬滅的情況下發(fā)出熒光。本研究采用的FAM熒光基團(tuán)，在波長520 nm熒光通道下，游離的FAM熒光基團(tuán)激發(fā)綠色，在波長690 nm熒光通道下，游離的CY5.5熒光基團(tuán)激發(fā)紅色。本研究通過反應(yīng)后顏色的不同來區(qū)分不同的病毒，并獲得成功。

本方法的成功建立，還與反應(yīng)中引物濃度、探針濃度及反應(yīng)試劑、程序的優(yōu)化分不開。為了獲得穩(wěn)定的最佳的擴(kuò)增效果，本研究對反應(yīng)的引物濃度、探針濃度及反應(yīng)試劑、程序進(jìn)行了優(yōu)化。在引物濃度和探針濃度的優(yōu)化中，發(fā)現(xiàn)內(nèi)引物濃度用量最高，其次為外引物濃度，探針濃度用量最低，它們之間的濃度應(yīng)用比約為80 ∶10 ∶1。最佳反應(yīng)程序?yàn)椋和嘶鹧由鞙囟?2 ℃，反應(yīng)時間90 min，85 ℃ 5 min結(jié)束反應(yīng)。應(yīng)用優(yōu)化后的引物濃度、探針濃度、反應(yīng)試劑及程序，獲得了最佳的LAMP擴(kuò)增效率。

本研究中采用Bst 3.0 DNA/RNA 聚合酶進(jìn)行二重?zé)晒釲AMP擴(kuò)增，該酶與Bst 2.0 DNA 聚合酶和Bst DNA 大片段聚合酶相比，具有更佳的延伸能力活性、更強(qiáng)的逆轉(zhuǎn)錄活性以及強(qiáng)烈的鏈置換活性，不需要預(yù)先對RNA模板單獨(dú)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)為cDNA。應(yīng)用該酶、LAMP試劑及本研究的引物組進(jìn)行擴(kuò)增，一次加模板就能完成LAMP擴(kuò)增，簡化檢測工序，縮短時間，大大降低因操作而引起的污染。

由于LAMP擴(kuò)增比較敏感，很容易受空氣中氣溶膠的污染。本研究中反應(yīng)結(jié)束后直接通過儀器讀取或憑肉眼對反應(yīng)結(jié)果進(jìn)行判定，不需要通過電泳或打開反應(yīng)蓋添加染料，這樣極大地降低了LAMP的污染，確保樣品檢測的準(zhǔn)確性。另外，本研究建立的方法，在沒有相關(guān)儀器的情況下，也可以簡單通過一個恒溫水浴鍋就可以完成，簡單方便實(shí)用。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證本研究建立的方法的實(shí)用性，本研究用優(yōu)化后建立的方法對保存的臨床樣品進(jìn)行檢測，同時采用比較成熟敏感的熒光定量PCR方法進(jìn)行對比，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，本研究獲得的結(jié)果與熒光定量PCR方法獲得的結(jié)果一致。為了進(jìn)一步確定監(jiān)測的準(zhǔn)確性，陽性樣品產(chǎn)物送測序公司進(jìn)行序列測定，分析比對結(jié)果均為對應(yīng)病毒序列，說明本研究建立的方法準(zhǔn)確，適合于臨床樣品的檢測。

本研究成功建立了一種PRRSV和PCV二重?zé)晒釲AMP檢測方法，該方法檢測特異性好，敏感性較高，方便快捷，在熒光下直接通過反應(yīng)產(chǎn)物顏色判斷結(jié)果，結(jié)果準(zhǔn)確直觀，可用于臨床樣品的檢測，為臨床快速檢測區(qū)分PRRSV和PCV多提供了一種選擇方法。