廣西壯藥材牛大力外源性有害物質(zhì)檢測分析

蔣珍藕 梁 冰 黃島平

1.廣西中醫(yī)藥研究院，廣西 南寧 530022；2.廣西中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究重點實驗室，廣西 南寧 530022；3.廣西分析測試研究中心，廣西 南寧 530022

外源性有害物質(zhì)是指中藥材在生長過程中從自然環(huán)境中吸附或蓄積導(dǎo)致的污染，或是種植、采收加工、儲運等環(huán)節(jié)不規(guī)范操作引入的污染，或是不法商販?zhǔn)芾骝?qū)使對中藥材(尤其是貴重藥、緊俏貨和飲片)采用造假、摻偽、增重、染色、漂白、熏硫磺等手段引入的污染。主要包括重金屬與有害元素、農(nóng)藥殘留、真菌毒素殘留、二氧化硫殘留等[1]。

重金屬與有害元素(鉛、鎘、砷、汞、銅)進(jìn)入體內(nèi)后可與蛋白質(zhì)、核酸等形成配合物或金屬螯合物，使酶活性減弱或者喪失，影響細(xì)胞生長，進(jìn)而致畸或致癌[2-3]。有機氯類農(nóng)藥為高殘留性農(nóng)藥，性質(zhì)穩(wěn)定，毒性強，代謝緩慢，體內(nèi)蓄積明顯，造成慢性中毒[4-6]。黃曲霉毒素會降低機體免疫力、導(dǎo)致不孕、發(fā)生急性中毒等，其急性毒性甚至是氰化鉀的10 倍[7]；二氧化硫?qū)θ梭w各臟器均有毒性，甚至致癌[8]?？梢姡兴幫庠葱杂泻ξ镔|(zhì)嚴(yán)重影響中藥材質(zhì)量和臨床用藥安全。

現(xiàn)行藥典[9]和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)[10]已初步建立了中藥外源性有害物質(zhì)的控制標(biāo)準(zhǔn)體系，但與國外標(biāo)準(zhǔn)相比，檢測和檢查項目較少，限度要求較寬，限量標(biāo)準(zhǔn)制訂進(jìn)程緩慢，大部分品種仍未要求和控制，總體理念保守和滯后，造成中藥外源性有害物質(zhì)的控制仍處于落后水平[11]，嚴(yán)重阻礙中藥走向世界，成為制約中藥國際化的技術(shù)壁壘和瓶頸。

鑒于外源性有害物質(zhì)嚴(yán)重影響中藥質(zhì)量安全、成為制約中藥國際化的瓶頸，必須采取積極的措施嚴(yán)格控制。牛大力為廣西壯藥材[12-13]，既是兩廣地區(qū)廣泛應(yīng)用的著名藥食兩用原料，也是壯腰健腎丸[14]等近二十種中成藥的主要原料；其原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)不完善，只有簡單的性狀描述，本課題組為了提高牛大力藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，之前已對牛大力藥材的顯微鑒別、薄層鑒別、水分、總灰分、酸不溶性灰分、浸出物、含量測定等內(nèi)容進(jìn)行了較系統(tǒng)的研究[15]，但對嚴(yán)重影響臨床療效和用藥安全的外源性有害物質(zhì)尚未進(jìn)行考察，為此，本實驗對牛大力樣品中重金屬及有害元素、農(nóng)藥殘留進(jìn)行檢測分析，為提高完善牛大力質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供實驗依據(jù)，并可用于指導(dǎo)牛大力無公害化種植生產(chǎn)。

1 儀器和材料

iCAP-Q型電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(美國賽默飛公司)，Multiwave3000型微波消解儀(奧地利安東帕公司)，DS-360型石墨消解儀(廣州格丹納公司)；SCION 456-GC/TQ型氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀(德國布魯克公司)。

As、Cd、Cu、Pb、Hg單元素標(biāo)準(zhǔn)液均購于中國計量科學(xué)研究院，濃度為 1000 μg/mL；Li、Co、Y、Ce、Tl調(diào)諧液濃度為1 μg/L；內(nèi)標(biāo)為Ge、In、Bi、Li6、Sc、Tb、Y混合標(biāo)準(zhǔn)液的濃度為 10 μg/mL；有機氯對照品(α-BHC、β-BHC、γ-BHC、δ-BHC、PCNB、PP′-DDE、PP′-DDD、OP′-DDT、PP′-DDT )含量均為100 μg/mL，中國藥品生物制品檢定所提供。

牛大力樣品的采集和購買信息見表1，均經(jīng)廣西中醫(yī)藥研究院賴茂祥研究員鑒定為豆科崖豆藤屬植物美麗崖豆藤(MillettiaspeciosaChamp.)的干燥根。

表1 牛大力藥材樣品來源

2 實驗方法和結(jié)果

2.1 重金屬總量 按照《中國藥典》2015年版四部通則0821重金屬檢查法測定。

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)鉛溶液的制備 準(zhǔn)確稱取在105 ℃干燥至恒重的硝酸鉛0.1599 g，置1000 mL量瓶中，加硝酸5 mL與水50 mL溶解后，用水稀釋至刻度，搖勻，作為貯備液。精密量取貯備液10 mL，置100 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，即得(每l mL相當(dāng)于10 μg的Pb) 。

2.1.2 供試品溶液的制備 取供試品1.0 g，按熾灼殘渣檢查法進(jìn)行熾灼處理，然后取遺留的殘渣，加硝酸0.5 mL蒸干，至氧化氮蒸氣除盡后，加鹽酸2.0 mL，置水浴上蒸干后加水25 mL，滴加氨試液至對酚酞指示液顯中性，再加醋酸鹽緩沖液(pH3.5)2.0 mL，微熱溶解后，移置比色管中，加水稀釋成25 mL，即得。

2.1.3 樣品測定 取25 mL納氏比色管三支，甲管中加標(biāo)準(zhǔn)鉛溶液2 mL與醋酸鹽緩沖液(pH 3.5)2 mL后，加水稀釋成25 mL，乙管中加入供試品溶液25 mL，丙管中加入與乙管相同重量的供試品，加配制供試品溶液的溶劑適量使溶解，再加與甲管相同量的標(biāo)準(zhǔn)鉛溶液與醋酸鹽緩沖液(pH 3.5)2 mL后，用溶劑稀釋成25 mL；在甲、乙、丙三管中分別加硫代乙酰胺試液各2 mL，搖勻，放置2 min，同置白紙上，自上向下透視。10批牛大力樣品同法測定，丙管顯出的顏色不淺于甲管，10批牛大力供試液顯示的顏色均不比甲管深。表明10批牛大力樣品中重金屬總量均小于20 mg/kg。

2.2 有害元素 按照《中國藥典》2015年版四部通則2321 鉛、鎘、砷、汞、銅測定法中的電感耦合等離子體質(zhì)譜法測定。

2.2.1 儀器條件 射頻功率1550 W，采樣深度8 mm，冷卻溫度2 ℃，載氣流量：1.03 L/min， 碰撞氣為He氣，積分時間：0.3 s，測定，數(shù)據(jù)采集重復(fù)次數(shù)3次。

2.2.2 微波消解條件 見表2。

表2 微波消解條件

2.2.3 溶液制備

2.2.3.1 調(diào)諧液的制備 直接吸取進(jìn)樣調(diào)諧。

2.2.3.2 內(nèi)標(biāo)溶液的制備 精密量取Ge、In、Bi、Li6、Sc、Tb、Y混合標(biāo)準(zhǔn)液適量，用2%硝酸稀釋成200 ng/mL的混合溶液，既得。

2.2.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液的制備 精密量取上述標(biāo)準(zhǔn)溶液，用5%硝酸溶液稀釋制成每l mL含鉛2 ng、4 ng、10 ng、20 ng、40 ng、100 ng，每l mL含鎘0.1 ng、0.2 ng、0.5 ng、1 ng、2 ng、5 ng，每l mL含砷1 ng、2 ng、5 ng、10 ng、20 ng、50 ng，每1 mL含汞0.1 ng、0.2 ng、0.5 ng、1 ng、2 ng、5 ng，每l mL含銅10 ng、20 ng、50 ng、100 ng、200 ng、500 ng的系列標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液。

2.2.3.4 供試品溶液的制備 取供試品粗粉于60 ℃干燥2 h，取約0.5 g，精密稱定，置耐壓耐高溫微波消解罐中，加硝酸10 mL。按上述消解條件進(jìn)行消解。消解完全后，消解液冷卻至60 ℃以下，取出消解罐，放冷，將消解液轉(zhuǎn)入50 mL量瓶中，用少量水洗滌消解罐3次，洗液合并于量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，即得，同法制備試劑空白溶液。

2.2.4 線性回歸方程 銅、砷以鍺作為內(nèi)標(biāo)，鎘以銦作為內(nèi)標(biāo)，鉛、汞以鉍作為內(nèi)標(biāo)，取標(biāo)準(zhǔn)系列混合溶液，進(jìn)樣測定，以各元素與內(nèi)標(biāo)計數(shù)值的比值為縱坐標(biāo)，各元素質(zhì)量濃度(ng/mL) 為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性回歸方程見表3。表明各元素線性關(guān)系良好。

表3 分析元素的線性關(guān)系和檢出限

2.2.5 檢出限 重復(fù)測定空白溶液11次，各元素信號響應(yīng)的3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差對應(yīng)的元素的濃度值即為檢出限，見表3。

2.2.6 方法精密度 取牛大力藥材(編號1)，用本法平行測定6次，結(jié)果各元素含量的RSD在2.3%～6.5%范圍內(nèi)。

2.2.7 回收率試驗 取牛大力藥材(編號1)約0.5 g，6份，分別加入鉛500 ng、鎘40 ng、砷40 ng、汞5 ng、銅2000 ng，照2.2.3.4項下制得加樣回收溶液，進(jìn)樣測定，計算回收率，結(jié)果見表4。

表4 加樣回收試驗結(jié)果

2.2.8 樣品測定 10批牛大力樣品依法測定，計算含量。結(jié)果見表5。

表5 牛大力藥材中鉛、鎘、砷、汞、銅測定結(jié)果 (mg/kg)

2.3 有機氯農(nóng)藥 按照《中國藥典》2015年版四部通則2341 農(nóng)藥殘留量測定法測定。

2.3.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗 DB-1701 色譜柱(30 m×0.32 mm×0.25 μm)。程序升溫：初始100 ℃，每分鐘10 ℃升至220 ℃，每分鐘8 ℃升至250 ℃，保持10 min。進(jìn)樣口溫度為230 ℃。檢測器溫度為300 ℃。進(jìn)樣量1 μL。載氣為高純He氣。不分流進(jìn)樣。在上述色譜條件下，理論板數(shù)以α-BHC峰計算應(yīng)不低于1×106，兩個相鄰色譜峰的分離度大于1.5。

2.3.2 混合對照品儲備液的制備 精密量取有機氯農(nóng)藥對照品溶液(100 μg/mL)各1 mL于250 mL容量瓶中，用石油醚(60～90 ℃)稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.3.3 混合對照品溶液的制備 精密量取上述混合對照品儲備液1 mL置10 mL容量瓶中，用石油醚(60～90 ℃)稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.3.4 供試品溶液的制備 取牛大力樣品細(xì)粉約2 g，精密稱定，置100 mL具塞錐形瓶中，加水20 mL浸泡過夜，精密加丙酮40 mL，稱定重量，超聲處理 30 min，放冷，用丙酮補足減失的重量，再加氯化鈉約6 g，精密加二氯甲烷30 mL，稱定重量，超聲處理15 min，用二氯甲烷補足減失的重量，靜置使分層，將有機相迅速移入裝有適量無水硫酸鈉的100 mL具塞錐形瓶中，放置4 h。精密量取35 mL，于 40 ℃ 水浴上減壓濃縮至近干，加少量石油醚(60～90 ℃)如前反復(fù)操作至二氯甲烷及丙酮除凈，用石油醚(60～90 ℃)溶解并轉(zhuǎn)移至10 mL具塞刻度的離心管中，加石油醚(60～90 ℃)稀釋至5 mL，小心加入濃硫酸1 mL，振搖1分鐘，離心(3000轉(zhuǎn)/min)10 min，精密量取上清液2 mL，40 ℃下將溶液濃縮至適量，精密稀釋至1 mL，即得。

2.3.5 線性關(guān)系和檢出限考察 分別精密量取混合對照品儲備液 0.5 mL、1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL置10 mL容量瓶中，用石油醚(60～90 ℃)分別制成系列濃度的混合對照品溶液；分別進(jìn)樣 1.0 μL，以進(jìn)樣量(ng)為橫坐標(biāo)，以相應(yīng)峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算回歸方程，并根據(jù)信噪比3∶1的比例,計算各有機氯農(nóng)藥的檢出限。結(jié)果見表6。

表6 9個有機氯農(nóng)藥成分的線性關(guān)系、定量限和檢出限

2.3.6 精密度實驗 取混合對照品溶液連續(xù)測定6次，結(jié)果9個有機氯農(nóng)藥成分峰面積的RSD在1.9%～3.2%范圍內(nèi)，說明儀器精密度良好。

2.3.7 穩(wěn)定性實驗 取混合對照品溶液，在0 h、2 h、6 h、8 h、10 h、12 h時進(jìn)樣測定，結(jié)果9個有機氯農(nóng)藥成分峰面積的RSD在1.7%～3.4%范圍內(nèi)，表明穩(wěn)定性良好。

2.3.8 重復(fù)性實驗 取同一批牛大力樣品6份，按擬訂的方法分別制備成供試品溶液，進(jìn)樣測定，結(jié)果均未檢出9個有機氯農(nóng)藥成分。

2.3.9 加樣回收實驗 取重復(fù)性試驗項下的牛大力樣品6份，每份約2 g，精密稱定，分別精密加入混合對照品貯備液2 mL，按擬訂的方法測定。結(jié)果9個有機氯農(nóng)藥成分回收率在95.7%～106.4%范圍內(nèi)，RSD在2.1%～3.6%之間(n=6)。

2.3.10 樣品測定 按擬訂的方法測定10批牛大力樣品中有機氯農(nóng)藥殘留量，結(jié)果各批樣品均未檢出9個有機氯農(nóng)藥成分。

3 分析和討論

10批牛大力樣品中重金屬總量均不超過20.0 mg/kg，符合《藥用植物及制劑進(jìn)出口綠色行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)》[10]中重金屬總量不超過20.0 mg/kg的限量規(guī)定。

10批牛大力樣品中鉛、鎘、砷、汞、銅測定結(jié)果見表5，均符合《藥用植物及制劑進(jìn)出口綠色行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)》[10]中鉛含量不超過5.0 mg/kg、鎘含量不超過0.3 mg/kg、砷含量不超過2.0 mg/kg、汞含量不超過0.2 mg/kg、銅含量不超過20.0 mg/kg的限量規(guī)定。

本實驗農(nóng)藥的檢出限：六六六0.01 mg/kg、滴滴涕0.02 mg/kg、五氯硝基苯0.003 mg/kg，10批牛大力樣品均未檢出，說明含量低或幾乎不含，符合《藥用植物及制劑進(jìn)出口綠色行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)》[10]中農(nóng)藥六六六殘留量不超過0.1 mg/kg、滴滴涕殘留量不超過0.1 mg/kg、五氯硝基苯殘留量不超過0.1 mg/kg的限量規(guī)定。

上述所檢測的牛大力樣品中重金屬、有害元素、有機氯農(nóng)藥含量均較低并符合相關(guān)規(guī)定，但要制定嚴(yán)謹(jǐn)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)還要不斷監(jiān)測和積累數(shù)據(jù)。中藥的外源性有害物質(zhì)除了種植過程中農(nóng)藥使用外，更多是從污染的土壤、灌溉水源及環(huán)境空氣中吸收，重金屬和農(nóng)藥在土壤中的殘留時間長達(dá)數(shù)年甚至數(shù)十年。隨著人工栽培藥材的不斷增長、種植和加工技術(shù)不斷發(fā)展變化以及環(huán)境污染加重，中藥材外源性有害物質(zhì)的種類將會增多或變化、程度加重，因此，對中藥材外源性有害物質(zhì)的監(jiān)測和限定標(biāo)準(zhǔn)的制定應(yīng)與時俱進(jìn)。

嚴(yán)格控制外源性有害物質(zhì)勢在必行。即將出版的《中國藥典》2020 年版擬對植物類藥材全面進(jìn)行檢查重金屬及有害元素(鉛、鎘、砷、汞、銅)限度以及33種農(nóng)藥殘留。國家中醫(yī)藥管理局近日發(fā)布“《中共中央國務(wù)院關(guān)于促進(jìn)中醫(yī)藥傳承創(chuàng)新發(fā)展的意見》重點任務(wù)分工方案”中強調(diào)：嚴(yán)格農(nóng)藥、化肥、植物生長調(diào)節(jié)劑等使用管理，分區(qū)域、分品種完善中藥材農(nóng)藥殘留、重金屬限量標(biāo)準(zhǔn)。因此，①首先應(yīng)完善過程控制、推動源頭監(jiān)管，嚴(yán)格控制和杜絕外源性有害物質(zhì)的污染途徑；②應(yīng)強化技術(shù)儲備、提高檢測水平，提高檢測方法的靈敏度、專屬性、通用性、實用性及普及性；③應(yīng)加強相關(guān)基礎(chǔ)研究，充分考慮中藥的使用特點、給藥途徑、實際監(jiān)測水平等因素，科學(xué)合理地制定中藥外源性污染物的限量標(biāo)準(zhǔn)。提升中藥質(zhì)量控制技術(shù)和安全性保障技術(shù)水平，逐步完善中藥安全控制標(biāo)準(zhǔn)體系，保障中藥質(zhì)量和臨床用藥安全，突破中藥國際化的瓶頸，使中藥真正走向世界。