金匱腎氣丸對(duì)伊馬替尼所致小鼠生殖毒性及其在血、睪中含量影響研究

朱思晗 王玲玲 陳曉霞* 常曉慧

1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)研究生學(xué)院，遼寧 大連 110066；2.解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第967醫(yī)院，遼寧 大連 110000

慢性粒細(xì)胞白血病(Chronic Myelogenous Leukemia，CML)是一種較為常見(jiàn)的，由于骨髓造血干細(xì)胞異常克隆所產(chǎn)生的血液性疾病。由于t(9；22)(q32；q21)易位(Ph′染色體)，形成 Bcr-Abl 融合基因，繼而編碼融合蛋白p210 Bcr-Abl，其酪氨酸激酶活性被異常激活，產(chǎn)生持續(xù)的細(xì)胞增殖信號(hào)致白血病發(fā)生[1-2]。隨著現(xiàn)代醫(yī)療技術(shù)的不斷發(fā)展，各種新型的治療藥物相繼產(chǎn)生，對(duì)于治療慢性粒細(xì)胞白血病起著重要作用[3]。其中，伊馬替尼可以和Abl酪氨酸激酶ATP的結(jié)合位點(diǎn)特異性結(jié)合，進(jìn)而隔絕ATP與Abl結(jié)合，避免Abl誘導(dǎo)細(xì)胞增生所需能量[4]，成為了臨床治療慢粒的主要藥物之一。而隨著CML的發(fā)病年齡要比以往流行病學(xué)調(diào)查的平均發(fā)病年齡略低趨勢(shì)，患有CML的年輕人數(shù)量正逐漸增多。有大宗病例報(bào)道顯示，女性患者服用酪氨酸激酶抑制劑(TKI)期間意外妊娠者絕大部分在發(fā)現(xiàn)懷孕后停藥后，有近10%的畸胎率[5]。因此，伊馬替尼對(duì)CML患者生育和生殖的影響，成為臨床醫(yī)生及CML患者共同關(guān)注的問(wèn)題。課題組前期研究表明，伊馬替尼可對(duì)男性產(chǎn)生生殖毒性，本課題組在前期研究基礎(chǔ)上[6]，對(duì)伊馬替尼所致的男性生殖毒性進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)臨床有些病例出現(xiàn)了水鈉潴留、陽(yáng)虛畏冷癥狀，故在中醫(yī)藏象學(xué)說(shuō)“腎主生殖 ”理論指導(dǎo)下，選擇了經(jīng)典方劑中具有補(bǔ)腎陽(yáng)，化氣行水的金匱腎氣丸，與伊馬替尼共同口服給予小鼠，來(lái)研究其對(duì)伊馬替尼引起雄性小鼠生殖毒性拮抗作用，為臨床上符合陽(yáng)虛癥狀服用伊馬替尼的慢粒男性患者采用中成藥金匱腎氣丸降低副作用，提高患者生活及生育質(zhì)量提供理論支持。

金匱腎氣丸出自《金匱要略》，該方配伍嚴(yán)謹(jǐn)，療效顯著，被稱為“補(bǔ)腎諸方之祖”，深受歷代醫(yī)家推崇，至今仍在臨床上廣泛應(yīng)用[7]。此方由附子、肉桂、熟地黃、山藥、山茱萸、牡丹皮、茯苓、澤瀉等組成，臨床觀察報(bào)道，金匱腎氣丸治療腎陽(yáng)虛不育有效，并且能顯著改善氧化應(yīng)激損傷，提高精液量、精子活動(dòng)率及精子濃度等指標(biāo)[8]。本研究通過(guò)實(shí)驗(yàn)，觀察金匱腎氣丸拮抗伊馬替尼引起雄性小鼠生殖毒性的療效，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 甲磺酸伊馬替尼(Novartis Pharma Schweiz AG，Switzerland H20100263)、金匱腎氣丸(北京同仁堂Z11021115)、伊馬替尼對(duì)照品(純度為 99.7%，中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)分別為20140213)；乙腈(TEDIA，色譜純大連銘揚(yáng)實(shí)驗(yàn)試劑有限公司)、去離子水(娃哈哈有限公司)、其他試劑均為分析純；電子精密天平(上海貴虎實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司)、光學(xué)顯微鏡(上海光學(xué)儀器廠)、細(xì)胞計(jì)數(shù)板(海德生物有限公司)、低溫離心機(jī)(鹽城市凱特實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)、島津UFLC液相色譜儀(日本島津公司)、ABSCIEXQTRAP 4500質(zhì)譜檢測(cè)器(美國(guó)AB公司)。

1.2 方法

1.2.1 染毒方法 由遼寧長(zhǎng)生生物制劑有限公司提供6～8周齡健康雄性昆明小鼠70只，合格證號(hào)：SCXK(遼)2010-001，體量(20±2)g，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為對(duì)照組(Cont)，伊馬替尼低(L-IM)、中(M-IM)、高(H-IM)劑量染毒組，金匱腎氣丸低(L-IM+JIN)、中(M-IM+JIN)、高(H-IM+JIN)劑量拮抗組，每組10只；染毒組和拮抗組小鼠分別給予66.70、100.00、133.33 mg/(kg·d)0.3%CMC-Na伊馬替尼溶液，1次/d，每周6 d，連續(xù)8周；拮抗組小鼠給予0.3%CMC-Na伊馬替尼的同時(shí)，分別給予660.00、1330.00、2670.00 mg/(kg·d)金匱腎氣丸水溶液，1次/d，每周6 d，連續(xù)8周，給藥期間所有小鼠均自由飲食飲水。

1.2.2 樣品采集及臟器系數(shù) 小鼠末次給藥結(jié)束后1h，摘眼球取血，斷頸法處死，迅速摘取雙側(cè)睪丸，兩側(cè)睪丸稱重，計(jì)算臟器系數(shù)。臟器系數(shù)=睪丸重量(g)/小鼠體質(zhì)量(g)×100%，左側(cè)睪丸迅速凍存于-20 ℃冰箱，用于含量測(cè)定，右側(cè)睪丸用于精子數(shù)量測(cè)定。

1.2.3 精子數(shù)量 取右側(cè)睪丸少許，加1 mL 0.9%生理鹽水稀釋?zhuān)芪?.1 mL，放入血細(xì)胞計(jì)數(shù)板中，使精液自然流入計(jì)數(shù)板，計(jì)數(shù)中間5個(gè)方格的精子數(shù)，計(jì)數(shù)時(shí)每份精子用3個(gè)計(jì)數(shù)板重復(fù)計(jì)數(shù)3次，取3次均值。

1.2.4 各組小鼠血液及睪丸中伊馬替尼濃度檢測(cè)

1.2.4.1 質(zhì)譜條件 為了提高方法的最佳靈敏度，優(yōu)化離子源為ESI源；源噴射電壓為3.5kV；加熱毛細(xì)管溫度為250℃；鞘氣(N2)壓力為80psi；輔助氣(N2)壓力為100psi；碰撞氣(Ar)壓力為20psi；正離子方式檢測(cè)；碰撞誘導(dǎo)解離(CID)電壓均為25eV；掃描方式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)；用于定量分析的離子反應(yīng)分別為m/z 494.1→393.9(伊馬替尼)和m/z 447.2→397.0(內(nèi)標(biāo)，氘4伊馬替尼)。

1.2.4.2 色譜條件 色譜柱為CAPCELLPAK- C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)；流動(dòng)相由含有2 mM乙酸銨和0.05 %三氟乙酸( TFA )的去離子水(溶劑A )和0.05 % TFA的MeOH /乙腈( 1∶1，V / V ) (溶劑B )組成，流速為0.1 mL/min；柱溫為45 ℃；進(jìn)樣量：5 μL。

1.2.4.3 儲(chǔ)備液及工作溶液配制 精確稱取伊馬替尼對(duì)照品適量(相當(dāng)于伊馬替尼20.0 mg)，置于20 mL量瓶中，用甲醇溶解定容至刻度，得1.0 mg/mL的伊馬替尼儲(chǔ)備液，儲(chǔ)存于4 ℃冰箱避光保存?zhèn)溆谩Ｈ缓缶芰咳?.0 mg/mL的伊馬替尼儲(chǔ)備液50 μL，加入950 μL流動(dòng)相，配成質(zhì)量濃度為50 μg/mL的工作液。另配制質(zhì)量濃度為1 μg/mL的內(nèi)標(biāo)甲醇溶液，備用。

1.2.4.4 血漿樣品的處理 取血漿50 μL置事先預(yù)備的加肝素抗凝EP管中，后加10 μL內(nèi)標(biāo)溶液(1 μg·mL-1)及200 μL甲醇溶液，漩渦振蕩2 min充分混合，4 ℃，12000 r/min條件下離心10 min，然后取上清液5 μL用于LC-MS/MS分析。

1.2.4.5 精液樣品的處理 取小鼠的一側(cè)睪丸用于伊馬替尼濃度測(cè)定，分離睪丸中的睪丸液，37°水浴30 min液化，3000 rpm離心15 min，取上清。后加10 μL內(nèi)標(biāo)溶液(1 μg·mL-1)及200 μL甲醇溶液，漩渦振蕩2 min充分混合，4 ℃，12000 r/min條件下離心10 min，然后取上清液5 μL用于LC-MS/MS分析。

1.2.4.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線 取正常組血樣、睪丸液若干份，分別加入不同濃度的伊馬替尼標(biāo)準(zhǔn)溶液和內(nèi)標(biāo)溶液，制得濃度分別為1、12.5、25、50、100、250、500、1000 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2.5 方法學(xué)考察

1.2.5.1 專(zhuān)屬性 按“1.2.4”項(xiàng)下試驗(yàn)條件，分別測(cè)定6只不同小鼠空白血樣、空白血樣+伊馬替尼/內(nèi)標(biāo)物和給藥干預(yù)組小鼠血樣，結(jié)果表明，小鼠血樣組織中的內(nèi)源性物質(zhì)不干擾伊馬替尼和氘代伊馬替尼的測(cè)定，小鼠血樣中伊馬替尼和氘代伊馬替尼的保留時(shí)間分別為6.90 min和6.94 min，睪丸組織中伊馬替尼和氘代伊馬替尼的保留時(shí)間分別為6.63 min和6.61 min，方法具有較高的特異性。

1.2.5.2 線性關(guān)系考察 按“1.2.4”項(xiàng)處理后作LC-MS/MS分析，以空白血清或睪丸中伊馬替尼與內(nèi)標(biāo)物峰面積之比(Y)對(duì)藥物濃度(C，ng/mL)線性回歸(加權(quán)系數(shù)為1/C2)，擬合得標(biāo)準(zhǔn)曲線。得血清中測(cè)定曲線回歸方程為：Y=0.0059X+0.0879,r=0.9969。 睪丸液中曲線回歸方程為：Y=0.0016X+0.0294，r=0.9936。線性范圍為1.0～2000.0 ng·mL-1，定量限(LLOQ)為1.0 ng·mL-1。

1.2.5.3 回收率 按“1.2.4”項(xiàng)下試驗(yàn)條件制備伊馬替尼低、中、高3種質(zhì)量濃度(5.0、25.0和250.0 ng·mL-1)的血樣和睪丸組織質(zhì)量控本(每種濃度6個(gè)重復(fù))，以每一種濃度常規(guī)質(zhì)控樣本中伊馬替尼峰面積平均值除以同濃度參比樣本中伊馬替尼峰面積平均值來(lái)計(jì)算提取回收率。在本文條件下，血樣質(zhì)量控本中伊馬替尼低、中、高3種質(zhì)量濃度回收率分別為(83.4±3.2)%、(87.0± 1.5)%、(85.2±1.1)%，RSD 分別為 3.0%、2.7%、1.3%；內(nèi)標(biāo)氘代伊馬替尼分別為(94.9±1.8)%、(91.0±2.8)%、(94.1±2.7)%，RSD分別為1.4%、3.2%、1.7%。睪丸組織質(zhì)量控本中伊馬替尼低、中、高3種質(zhì)量濃度回收率分別為(93.4±2.2)%、(84.2± 1.7)%、(80.9±2.1)%，RSD 分別為1.0%、1.9%、2.3%；內(nèi)標(biāo)氘代伊馬替尼分別為(92.1±2.8)%、(89.0±2.7)%、(84.9±1.7)%，RSD 分別為 2.4%、1.8%、2.4%。

1.2.5.4 精密度與準(zhǔn)確度 按“1.2.4”項(xiàng)下試驗(yàn)條件制備25.0、50.0、100.0 ng·mL-13個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)血樣與睪丸組織樣品作為質(zhì)控樣品，每一濃度各15份，每天分別取3個(gè)濃度各5份，連續(xù)測(cè)定3 d，伊馬替尼血樣與睪丸組織樣品的精密度與準(zhǔn)確度RSD均小于15%，符合生物樣品測(cè)定要求。

1.2.5.5穩(wěn)定性 按“1.2.4”項(xiàng)下試驗(yàn)條件制備5.0、25.0、50.0、100.0、250.0、500.0 ng·mL-16個(gè)濃度的空白血樣與睪丸組織質(zhì)控樣品，每一濃度數(shù)份，分別考察于室溫放置2 h，樣品處理后4 ℃放置24 h，-70 ℃凍存30 d和-70 ℃凍融循環(huán)3次的穩(wěn)定性，上述條件下RSD均小于10%，空白血樣與睪丸組織質(zhì)控樣品在上述條件下穩(wěn)定性良好，符合生物樣品測(cè)定要求。

2 結(jié)果

2.1 體重及外觀 分別稱量各組小鼠第1周、第4周、第8周的體重，僅第四周時(shí)，L-IM+JIN組與Cont組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。另外8周時(shí)間中，Cont組體重持續(xù)平穩(wěn)，染毒組隨著伊馬替尼給藥劑量增加、給藥時(shí)間延長(zhǎng)，小鼠體重逐漸增加。拮抗組經(jīng)金匱腎氣丸給藥后，小鼠體重有不同程度減輕。如圖1所示。

圖1 各組小鼠第1周、第4周、第8周體重注：與Cont組比較，☆P<0.05。

2.2 臟器系數(shù) 與Cont組比較，各組小鼠睪丸系數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，H-IM組睪丸系數(shù)有下降趨勢(shì)，而經(jīng)金匱腎氣丸治療后，拮抗組睪丸指數(shù)均有上升趨勢(shì)。如圖2所示。

2.3 精子數(shù)量 H-IM+JIN組與Cont組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，染毒低、中、高組小鼠精子數(shù)量均有下降趨勢(shì)，同劑量金匱腎氣丸與伊馬替尼聯(lián)合用藥組與伊馬替尼組相比，均能顯著性增加精子數(shù)量，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。如圖3所示。

圖2 各組小鼠臟器指數(shù) 圖3 各組小鼠精子數(shù)量注：與Cont組比較，☆☆P<0.01；同劑量金匱腎氣丸與伊馬替尼聯(lián)合用藥組、伊馬替尼組比較，**P<0.01。

2.4 血漿及睪丸組織中伊馬替尼藥物濃度的檢測(cè) 采用LC-MS/MS檢測(cè)各組血液及精液中伊馬替尼藥物濃度。血液中，M-IM組與M-IM+JIN組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，小鼠血液中藥物含量最高，在經(jīng)金匱腎氣丸給藥后，各組小鼠血液中伊馬替尼濃度均有所增加。精液中，M-IM組與M-IM+JIN組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，在經(jīng)金匱腎氣丸給藥后，中劑量組小鼠精液中伊馬替尼濃度有所降低。如圖4、5、6所示。

A.血樣對(duì)照品；B.血樣樣品；C.睪丸組織對(duì)照品；D.睪丸組織樣品圖4 伊馬替尼藥物濃度測(cè)定及內(nèi)標(biāo)測(cè)定質(zhì)譜圖

圖5 血清中伊馬替尼藥物濃度 圖6 睪丸中伊馬替尼藥物濃度 注：M-IM組與M-IM+JIN組比較，*P<0.05。 注：M-IM組與M-IM+JIN組比較，**P<0.05。

4 討論

伊馬替尼是治療慢性粒細(xì)胞性白血病和惡性胃腸道間質(zhì)腫瘤的一線藥物，其生殖毒性也是公認(rèn)的，長(zhǎng)時(shí)間服用可導(dǎo)致不可逆的少弱精子癥，少弱精子癥屬于中醫(yī)“精冷”“精少”范疇，人體生殖器官的發(fā)育、生殖功能的成熟與維持均與腎藏精和腎氣溫煦的功能相關(guān)。腎精化腎氣，腎精充足和腎氣旺盛，則生殖功能正常，反之則弱。因此，在少弱精子癥的治療上，始終離不開(kāi)補(bǔ)腎法[9]。

金匱腎氣丸為傳統(tǒng)補(bǔ)腎名方，具有滋補(bǔ)腎陰、填補(bǔ)腎精、溫補(bǔ)腎氣的功效。大量臨床及試驗(yàn)研究顯示，補(bǔ)腎中藥具有修復(fù)生殖損傷的作用。王秋萍、肖惠英等[10-11]指出腎氣丸能明顯改善少弱精子癥動(dòng)物精子活力，改善精子密度，提高精子質(zhì)量。祖國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為: 精子質(zhì)量低下，表明腎陽(yáng)虧虛。所以，中醫(yī)治療弱精子癥，多采用溫補(bǔ)腎陽(yáng)為治療大法。目前市面上售金匱腎氣丸實(shí)為《濟(jì)生方》中濟(jì)生圣氣丸，較《金匱要略》組中金匱腎氣丸多了兩味牛膝、車(chē)前，這兩味藥的加入增加了化氣利水消腫的作用，對(duì)于腎陽(yáng)不足、水濕內(nèi)停所致的腎虛水腫、小便不利更為適宜[12-13]。

本研究中結(jié)果顯示，伊馬替尼染毒組子數(shù)量有所下降，說(shuō)明伊馬尼染毒雄性小鼠的生殖損傷模型建立成功?，F(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道診斷腎陽(yáng)虛證動(dòng)物模型的客觀指標(biāo)[14-15]主要有反映下丘腦-垂體-靶腺軸功能低下、睪丸出現(xiàn)組織學(xué)改變等，據(jù)200余篇有關(guān)腎陽(yáng)虛動(dòng)物模型文獻(xiàn)中癥狀體征描述顯示：其表現(xiàn)主要有體重下降, 體溫下降, 畏寒蜷縮, 反應(yīng)遲鈍, 精神委靡, 體毛枯疏, 失去光澤, 飲水?dāng)z食減少, 尿量增多等, 個(gè)別有性功能低下。伊馬替尼染毒的小鼠符合腎陽(yáng)虛證的動(dòng)物模型，可用于金匱腎氣丸治療腎陽(yáng)虛證的藥理評(píng)價(jià)[16]。在雄性生殖系統(tǒng)中[17]，睪丸具有精子的發(fā)生和雄性激素合成兩大功能，染毒組小鼠精子數(shù)量下降趨勢(shì)明顯，伊馬替尼可能在形成精子過(guò)程中產(chǎn)生毒性作用而導(dǎo)致精子數(shù)量減少[18]。此外，染毒組血漿與睪丸組織藥物濃度，M-IM組藥物濃度達(dá)到最高，可能原因是，伊馬替尼致雄性小鼠生殖系統(tǒng)產(chǎn)生毒性作用有最高劑量，而經(jīng)金匱腎氣丸拮抗后，伊馬替尼在血液中的濃度有所增加，在睪丸組織中，M-IM組藥物濃度有所下降，這一結(jié)果說(shuō)明，金匱腎氣丸能夠增加伊馬替尼在血液中的濃度，提高伊馬替尼治療CML的靶向性作用，減少伊馬替尼在睪丸組織中的濃度，降低伊馬替尼對(duì)雄性小鼠的生殖毒性。

雖然目前此類(lèi)研究尚少見(jiàn)報(bào)告，但課題組正在研究應(yīng)用補(bǔ)腎中醫(yī)干預(yù)接受伊馬替尼治療的慢性粒細(xì)胞性白血病白血病患者，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明能夠較好改善應(yīng)藥物導(dǎo)致的精子數(shù)目減少、活動(dòng)力減低，改善精液治療，保護(hù)生殖力。