四君子湯對(duì)人小腸上皮細(xì)胞輻射損傷的保護(hù)作用

王成芳，邵 帥，曲功霖，齊雪松，茍 巧

(中國(guó)疾病預(yù)防控制中心輻射防護(hù)與核安全醫(yī)學(xué)所，輻射防護(hù)與核應(yīng)急中國(guó)疾病預(yù)防控制中心重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100088)

腹盆腔惡性腫瘤的種類很多，主要有消化系統(tǒng)腫瘤如肝癌、胃癌和直腸癌；婦科腫瘤如宮頸癌、卵巢癌和子宮內(nèi)膜癌等。發(fā)病率逐年升高，胃癌、結(jié)直腸癌和肝癌更是除肺癌以外的我國(guó)發(fā)病率和死亡率較高的常見(jiàn)腫瘤。為防止病灶轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)，通常要進(jìn)行放射治療。放射性腸損傷，是腹盆腔惡性腫瘤放射治療引起的常見(jiàn)并發(fā)癥，小腸上皮細(xì)胞對(duì)放射線高度敏感，射線能夠使小腸絨毛縮短，上皮細(xì)胞脫落，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，最終導(dǎo)致腸黏膜功能被破壞，從而出現(xiàn)嘔吐、腹瀉、細(xì)菌感染等癥狀，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[1]。目前，針對(duì)放射性腸道損傷仍舊缺少防治藥物。中草藥及其天然成分不僅具有藥源廣泛、毒性小等特點(diǎn)，而且可以通過(guò)多種途徑、多靶點(diǎn)治療疾病，其中許多具有免疫調(diào)節(jié)、抗氧化和清除自由基等作用[2-4]。中藥注重整體調(diào)理，且有與化學(xué)合成藥物相互補(bǔ)充的作用，可用于癌癥的放療過(guò)程中的輻射防護(hù)。

本課題組已有研究顯示，四君子湯對(duì)淋巴母細(xì)胞AHH-1及BALB/c小鼠的電離輻射損傷具有較好的防護(hù)作用[5-7]。為進(jìn)一步探討其在腸道輻射損傷中的作用，本文以人小腸上皮細(xì)胞HIEC-6為受試對(duì)象，研究四君子湯水提物對(duì)其輻射損傷的影響，旨在為臨床應(yīng)用四君子湯治療急性放射病及腫瘤放療過(guò)程中腸道損傷的防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器、材料與主要試劑

Thermo CO2恒溫培養(yǎng)箱、Multiskan GO型連續(xù)波長(zhǎng)酶標(biāo)儀，購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；FACS Calibur流式細(xì)胞儀，購(gòu)自美國(guó)BD公司；Axiocam ERC5S型倒置顯微鏡，購(gòu)自德國(guó)ZEISS公司；5810R型離心機(jī)，購(gòu)自德國(guó)Eppendorf 公司；TP-214型分析天平，購(gòu)自丹佛儀器(北京)有限公司；Milli-Q A10型純水儀，購(gòu)自美國(guó)Millipore公司；電泳儀、化學(xué)發(fā)光檢測(cè)系統(tǒng)，購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad 公司；Image J 公共圖像處理軟件(美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院)。四君子湯水提取物(黃色粉末)為本所毒理室提取噴霧干燥所得，用時(shí)用細(xì)胞培養(yǎng)液(含5%胎牛血清的Opti-MEM)溶解配制。胎牛血清和細(xì)胞培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司)；CCK-8 試劑盒(日本同仁化學(xué)研究所)；Annexin V-PE/7AAD細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(南京凱基生物有限公司)；細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒(美國(guó)Thermo 公司)；辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記山羊抗兔和山羊抗小鼠抗體(北京中杉金橋公司)；兔抗人γH2AX(美國(guó)Cell Signaling Technology 公司)；小鼠抗人Bcl-2、β-tublin 抗體(美國(guó)Abcam 公司)；總蛋白提取、蛋白定量及ECL 發(fā)光檢測(cè)試劑盒(北京普利萊公司)；標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker(美國(guó)Thermo 公司)。

1.2 藥物配制

稱取四君子湯水提物粉末(四君子湯粉末提取率為35.5%)，加培養(yǎng)液溶解，配制成1.90 mg/mL藥液，實(shí)驗(yàn)中倍比稀釋，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3 照射條件

北京師范大學(xué)化學(xué)學(xué)院鈷源60Co γ射線照射，源強(qiáng)5 000 Ci，照射距離為79 cm，劑量率為1.0 Gy/min。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)

人小腸上皮細(xì)胞HIEC-6購(gòu)自上海紀(jì)寧實(shí)業(yè)有限公司。用含4%胎牛血清的Opti-MEM培養(yǎng)液于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。每3天換1次培養(yǎng)基，每周傳代1次。

1.5 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞存活率

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HIEC-6細(xì)胞接種于96孔板，5×103個(gè)/孔，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，接種后24小時(shí)經(jīng)不同劑量(0、2、4、6、8、10 Gy)的60Co γ射線照射或照射前1小時(shí)用含不同濃度(1.90、0.95、0.48、0.24、0.12、0.06 mg/mL)四君子湯水提物的培養(yǎng)基作用細(xì)胞，給予4.0 Gy γ射線照射(設(shè)立對(duì)照組和空白對(duì)照組)。照射后繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72、96 h，按照CCK-8試劑盒說(shuō)明書操作。全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀測(cè)定各孔450 nm波長(zhǎng)下吸光度(OD)，計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率=(OD處理組-OD培養(yǎng)液對(duì)照組)/(OD空白對(duì)照組-OD培養(yǎng)液對(duì)照組)×100%。

1.6 細(xì)胞凋亡與周期檢測(cè)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HIEC-6細(xì)胞接種于6 孔板中，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24 h后，照射前1 h分別經(jīng)0.95、0.24和0.06 mg/mL藥物作用，設(shè)立空白對(duì)照組和照射對(duì)照組，給予4.0 Gy的照射劑量后繼續(xù)培養(yǎng)3 d，按照細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期試劑盒說(shuō)明書操作。經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)，計(jì)算細(xì)胞凋亡率和死亡率；細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果經(jīng)ModFit LT(Verity Software House, Topsham, ME, USA)軟件分析。

1.7 γH2AX、Bcl-2蛋白的表達(dá)

細(xì)胞接種和實(shí)驗(yàn)分組同細(xì)胞周期檢測(cè)，照射3 d后收獲細(xì)胞。提取細(xì)胞總蛋白30 μg 進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳及轉(zhuǎn)膜。一抗采用兔抗人γH2AX和小鼠抗人Bcl-2抗體(1∶1 000稀釋)4 ℃孵育過(guò)夜；二抗采用HRP 標(biāo)記山羊抗兔抗體(1∶3 000 稀釋)常溫孵育1 h。用小鼠抗人β-tublin 抗體(1∶2 000稀釋)再進(jìn)行雜交作為內(nèi)參照。經(jīng)化學(xué)發(fā)光液孵育，Bio-Rad ChemiDoc XRS+ 化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)顯影拍照(Bcl-2 蛋白分子量為26 kDa，γH2AX 蛋白分子量為17 kDa，β-tublin蛋白分子量為55 kDa)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有計(jì)量資料均采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有數(shù)據(jù)均進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)：方差齊，多組數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，兩組數(shù)據(jù)比較采用q檢驗(yàn)；方差不齊，采用秩和檢驗(yàn)。p<0.05時(shí)認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HIEC-6細(xì)胞對(duì)γ射線的敏感性

CCK-8 試劑盒檢測(cè)不同劑量(0、2、4、6、8、10 Gy)γ射線照射后HIEC-6細(xì)胞在24～96 h的存活率，結(jié)果示于圖1。由圖1可見(jiàn)，照射后的24～72 h，細(xì)胞的存活率與照射劑量、受照時(shí)間的依賴關(guān)系并不明顯，即細(xì)胞的存活率不是逐漸降低的，這可能與輻射誘導(dǎo)細(xì)胞周期調(diào)控、凋亡以及修復(fù)程度不同有關(guān)。而在照射后96 h，隨著照射劑量的增加，細(xì)胞的存活率則顯著降低。因此，在后面藥物輻射損傷保護(hù)作用實(shí)驗(yàn)中，選擇4.0 Gy的照射劑量。

圖1 人小腸上皮細(xì)胞HIEC-6不同劑量照射后24～96 h的細(xì)胞存活率

2.2 四君子湯對(duì)60Co γ射線照射后HIEC-6細(xì)胞增殖的影響

圖2為四君子湯對(duì)不同劑量60Co γ射線照射后人小腸上皮細(xì)胞HIEC-6增殖的影響。由圖2可見(jiàn)，4.0 Gy γ射線照射后96 h的人小腸上皮細(xì)胞HIEC-6存活率為55%，而照射前經(jīng)四君子湯水提物處理后，細(xì)胞存活率明顯升高(p<0.01)，說(shuō)明藥物對(duì)細(xì)胞具有顯著的保護(hù)作用，且與藥物濃度呈正相關(guān)，即隨著濃度升高，細(xì)胞存活率顯著增加，在0.95 mg/mL時(shí)，細(xì)胞的存活率達(dá)到84%，較之照射對(duì)照組增加了29%，而升高藥物濃度2倍后(1.90 mg/mL)，細(xì)胞存活率并無(wú)明顯變化。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)的藥物濃度最高使用0.95 mg/mL。

*與空白對(duì)照組比較差異非常顯著，p<0.01；△與照射對(duì)照組比較差異顯著，p<0.05；△△與照射對(duì)照組比較差異非常顯著，p<0.01。

2.3 四君子湯對(duì)60Co γ射線照射后HIEC-6細(xì)胞凋亡的影響

表1和圖3為四君子湯對(duì)4.0 Gy60Co γ射線照射后人小腸上皮細(xì)胞HIEC-6凋亡的影響。由表1和圖3可見(jiàn)，人小腸上皮細(xì)胞HIEC-6經(jīng)4.0 Gy照射后72 h，細(xì)胞凋亡率12.14%，死亡率2.21%，顯著高于空白對(duì)照組(p<0.05)。照射前1 h給予不同濃度四君子湯水提物(0.95、0.24、0.06 mg/mL)處理后，細(xì)胞凋亡率和死亡率顯著降低(p<0.01)。表明藥物干預(yù)使細(xì)胞凋亡減少并具有保護(hù)作用。

圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同處理組的HIEC-6細(xì)胞凋亡圖

表1 四君子湯對(duì)照射后HIEC-6細(xì)胞的凋亡率和死亡率的影響(n=3)

2.4 四君子湯對(duì)60Co γ射線照射后HIEC-6細(xì)胞周期的影響

表2為四君子湯對(duì)4.0 Gy60Co γ射線照射后人小腸上皮細(xì)胞HIEC-6細(xì)胞周期的影響。由表2可見(jiàn)，HIEC-6細(xì)胞照射后72 h，細(xì)胞周期在S、G2/M期均有阻滯，與空白對(duì)照組相比，G1期的細(xì)胞比例顯著降低，S、G2/M期比例升高。照射前給予四君子湯水提物0.95 mg/mL處理后，與照射組相比，S期細(xì)胞比例顯著降低(p<0.01)，G1期的細(xì)胞比例顯著增加(p<0.05)，表明藥物干預(yù)后，細(xì)胞周期S期阻滯得到緩解。

表2 四君子湯對(duì)照射后HIEC-6 細(xì)胞周期分布比例的影響(%)(n=3)

2.5 四君子湯對(duì)HIEC-6細(xì)胞照射后Bcl-2和γH2AX蛋白表達(dá)的影響

圖4為四君子湯對(duì)4.0 Gy60Co γ射線照射后人小腸上皮細(xì)胞Bcl-2和γH2AX蛋白表達(dá)的影響。圖4的蛋白免疫印跡結(jié)果顯示，同空白對(duì)照組(C)相比，照射對(duì)照組(IR)Bcl-2蛋白表達(dá)明顯降低，而γH2AX蛋白表達(dá)明顯升高，經(jīng)0.95 mg/mL的四君子湯水提物處理后(0.95+IR)，減緩了這一變化，Bcl-2蛋白表達(dá)升高，γH2AX蛋白表達(dá)降低，提示四君子湯水提物可能通過(guò)調(diào)控Bcl-2和γH2AX的表達(dá)來(lái)減緩人小腸上皮細(xì)胞HIEC-6的輻射損傷。

圖4 HIEC-6細(xì)胞的Bcl-2和γH2AX蛋白表達(dá)情況

3 討論

輻射引起的細(xì)胞損傷常常表現(xiàn)為細(xì)胞增殖受到抑制，細(xì)胞周期進(jìn)程產(chǎn)生變化，細(xì)胞發(fā)生凋亡和壞死等等。腸黏膜上皮是機(jī)體更新活躍的組織之一，對(duì)射線高度敏感[8]。本文首先通過(guò)CCK-8法檢測(cè)不同照射劑量下的人小腸上皮細(xì)胞HIEC-6在24～96 h的增殖情況，結(jié)果表明，細(xì)胞在照射后96 h增殖受到顯著抑制，而經(jīng)過(guò)藥物預(yù)處理后照射(4.0 Gy)，細(xì)胞增殖抑制情況得到緩解，凋亡和壞死大大降低，且細(xì)胞的存活率隨著藥物濃度的升高而增加，促進(jìn)HIEC-6的增殖。

腸細(xì)胞凋亡是腸黏膜屏障受損的主要原因[9-10]。本研究通過(guò)Annexin V-PE/7AAD雙染標(biāo)記法檢測(cè)對(duì)于受照后HIEC-6細(xì)胞凋亡及壞死，結(jié)果顯示，在4.0 Gy的照射條件下細(xì)胞表現(xiàn)為明顯的凋亡和壞死比例升高。通過(guò)預(yù)先給藥，四君子湯水提物顯示出對(duì)HIEC-6細(xì)胞的保護(hù)作用，較為明顯地降低了細(xì)胞損傷程度，并且這種作用可能持續(xù)至照后72 h。此外，射線可使凋亡抑制基因Bcl-2的蛋白表達(dá)降低或Bcl-2蛋白穩(wěn)定性下降，使凋亡的發(fā)生率明顯增加。細(xì)胞在受到電離輻射后，DNA發(fā)生雙鏈斷裂損傷(double strands breaks，DSBs)，組蛋白H2AX快速發(fā)生磷酸化(即γH2AX)，一旦γH2AX介導(dǎo)的DNA損傷修復(fù)完成后，γH2AX會(huì)被Pph3等脫磷酸化，形成H2AX在其他DNA損傷修復(fù)中被重新利用，從而使γH2AX在損傷位點(diǎn)被有效的去除。本文檢測(cè)了照射后72 h細(xì)胞的γH2AX蛋白表達(dá)，發(fā)現(xiàn)其仍有表達(dá)，而經(jīng)過(guò)四君子湯作用后的細(xì)胞γH2AX表達(dá)有所下降，其可能通過(guò)某種細(xì)胞內(nèi)外信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，使輻照后HIEC-6細(xì)胞Bcl-2基因的蛋白表達(dá)量增加，增強(qiáng)細(xì)胞DNA損傷修復(fù)能力，激活存在的DNA修復(fù)酶，促進(jìn)DNA復(fù)制，抑制細(xì)胞發(fā)生凋亡，從而起到保護(hù)小腸上皮細(xì)胞的作用。細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果顯示，照射后的細(xì)胞S、G2/M期比例升高，表明輻射誘導(dǎo)的DNA損傷阻礙了基因組的復(fù)制進(jìn)程[11]，四君子湯則降低了細(xì)胞S期、提高了G1期的比例，促進(jìn)細(xì)胞的修復(fù)，起到保護(hù)作用。

四君子湯作為我國(guó)傳統(tǒng)的中藥補(bǔ)益劑，臨床常用于治療慢性胃炎、消化性潰瘍等屬脾胃氣虛者。中醫(yī)認(rèn)為脾胃為后天之本，與機(jī)體免疫能力息息相關(guān)，因而四君子湯在臨床上也用于腫瘤患者放化療后的輔助用藥，目的是提高患者的免疫能力抵抗放化療的毒副作用[12-13]。本文的研究結(jié)果表明，四君子湯在人小腸上皮細(xì)胞輻射損傷中具有修復(fù)作用，其作用機(jī)制與調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)程、減少細(xì)胞凋亡、促進(jìn)DNA損傷修復(fù)相關(guān)，為腹盆腔腫瘤放療過(guò)程中腸道損傷的防治提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。