循環(huán)腫瘤細胞在評估傳統(tǒng)及胸腔鏡輔助肺癌切除術(shù)治療早期非小細胞肺癌效果的應(yīng)用

屈志剛，李金波，胡亞鋒，伍 光，田 彥

肺癌是嚴重威脅人類健康的疾病，其病死率居所有惡性腫瘤之首[1-2]。早期手術(shù)切除是肺癌最重要的治療方法之一，但部分患者仍存在腫瘤復(fù)發(fā)或遠處轉(zhuǎn)移。研究發(fā)現(xiàn)循環(huán)腫瘤細胞(circulating tumor cells， CTCs)與肺癌分期、發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移，甚至與肺癌術(shù)后長期生存率密切相關(guān)[3]；CTCs不僅可有效判斷肺癌患者預(yù)后，還能預(yù)測和監(jiān)測輔助治療效果[4-5]。隨著微創(chuàng)技術(shù)的進步，除傳統(tǒng)開胸腫瘤切除外，肺癌外科治療還包括電視胸腔鏡腫瘤切除(video-assisted thoracoscopic surgery， VATS)，可通過三孔法和單孔法實施[6]。本研究旨在檢測非小細胞肺癌(non-small cell lung carcinoma, NSCLC)患者圍術(shù)期行傳統(tǒng)開胸手術(shù)及單孔、三孔VATS過程中CTCs水平變化，明確不同手術(shù)方式與患者臨床預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1臨床資料 收集2014年8月—2018年2月于河北省涿州市醫(yī)院行肺癌切除術(shù)的NSCLC 61例，其中傳統(tǒng)手術(shù)組24例，單孔VATS組16例，三孔VATS組21例。納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡18～80歲；術(shù)前或術(shù)后病理證實為NSCLC；術(shù)前未經(jīng)放、化療治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：有其他惡性腫瘤病史；術(shù)前已接受放、化療治療。VATS手術(shù)操作步驟：患者采用全麻，雙腔氣管插管、健側(cè)單肺通氣，健側(cè)臥位，單孔法采用腋前線第4或5肋間切口(約4 cm)作為操作口，腋后線第7肋間切口(1.5 cm)作為觀察口；三孔法在肩胛下角線第7肋間增加1個切口(約2 cm)作輔助操作孔，VATS均為同一術(shù)者完成。為避免CTCs播散，操作時先結(jié)扎肺靜脈，后結(jié)扎肺動脈；先清除肺門及葉尖淋巴結(jié)，后清掃肺內(nèi)淋巴結(jié)。此外，研究招募10例良性肺疾病患者及15名健康志愿者作為CTCs檢測的陰性對照組。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，所有患者均簽署知情同意書。

1.2圍術(shù)期CTCs檢測 分別于術(shù)前2 d，術(shù)中肺葉切除、淋巴結(jié)清掃后，術(shù)后2 d采集上述3組肘正中靜脈外周血標(biāo)本，其中前2 ml用于檢測腫瘤標(biāo)記物，后7.5 ml用于CTCs檢測。血標(biāo)本采集后置于檸檬酸抗凝管，4℃保存，18 h內(nèi)進行CTCs檢測。

1.2.1采用免疫磁珠法富集CTCs：7.5 ml抗凝全血與等比例PBS充分混勻，加7.5 ml人淋巴細胞分離液，室溫800×g離心20 min，棄上清、收集第二層細胞，加5 ml PBS，室溫800×g離心20 min，將細胞沉淀重懸于80 μl磁珠緩沖液，加20 μl CD45抗體(Miltenyi Biotec，德國)，混勻后4℃孵育15 min，加2 ml磁珠緩沖液，800×g室溫離心10 min，棄上清，加入500 μl磁珠緩沖液混勻并重懸；將細胞重懸液過磁珠MS分流柱，重復(fù)2次，收集從分流柱下流出的液體，800×g室溫離心10 min。

1.2.2采用Envision法檢測CTCs：將細胞懸液均勻涂于載玻片,室溫下風(fēng)干，用4%多聚甲醛固定10 min，PBS清洗，擦去多余水分，滴加小鼠抗人Pan-CK抗體(1∶100，Cell Signaling，美國)，4℃冰箱過夜；PBS清洗后用濾紙擦去多余水分，加Envision二抗(中杉金橋，中國)，37℃恒溫孵育20 min；DAB顯色，蘇木素復(fù)染，酸乙醇分化、脫水，中性樹膠封片；光學(xué)顯微鏡下觀察、照相。

1.2.3CTCs細胞形態(tài)學(xué)判定標(biāo)準(zhǔn)：細胞呈圓形、橢圓形或長形，長徑>10 μm；光鏡下可見完整細胞形態(tài)及細胞核。CTCs細胞光鏡學(xué)標(biāo)準(zhǔn)：有完整細胞膜，Pan-CK染色陽性，胞漿呈藍黑色或褐色；細胞長徑>10 μm；核漿比失常。結(jié)果判定：由兩位經(jīng)培訓(xùn)實驗員在光鏡下獨立觀察細胞并采集相關(guān)圖像，有分歧時由兩人共同判定結(jié)果[7]。

2 結(jié)果

2.1NSCLC臨床病理特征及CTCs檢查 本研究共納入61例患者，傳統(tǒng)手術(shù)組包括腺鱗癌、大細胞癌各1例，單孔VATS組包括腺鱗癌1例，三孔VATS組包括肺泡細胞癌1例。3組年齡、性別、腫瘤組織類型、吸煙史及臨床分期比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。61例NSCLC共有44例血標(biāo)本檢測出2個以上CTCs(圖1)，檢測陽性率為72.1%，良性肺疾病患者及健康志愿者未檢測出存在CTCs。

圖1 NSCLC及健康志愿者外周血CTCs檢測(Pan-CK×400)A.NSCLC患者，B.健康志愿者；*代表CTCs，NSCLC為非小細胞肺癌，CTCs為循環(huán)腫瘤細胞

表1 3組NSCLC臨床病理特點

2.2圍術(shù)期CTCs變化 術(shù)前2 d、手術(shù)當(dāng)日3組CTCs數(shù)量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；傳統(tǒng)手術(shù)組術(shù)后2 d CTCs數(shù)量顯著多于單孔和三孔VATS組(P<0.05)。見表2，圖2。

表2 3組NSCLC圍術(shù)期CTCs數(shù)量比較個/5 ml)

圖2 不同術(shù)式對NSCLC圍術(shù)期CTCs數(shù)量的影響NSCLC為非小細胞肺癌，CTCs為循環(huán)腫瘤細胞，VATS為電視胸腔鏡腫瘤切除；與單孔VATS組比較，aP<0.05;與三孔VATS組比較，cP<0.05

2.3不同肺癌切除術(shù)式對圍術(shù)期CTCs增高情況的影響 3組術(shù)前2 d至手術(shù)當(dāng)日所測CTCs數(shù)量增高情況不明顯(P>0.05)；傳統(tǒng)手術(shù)組術(shù)前2 d至術(shù)后2 d CTCs數(shù)量增高情況高于單孔及三孔VATS組(P<0.05)，而三孔VATS組CTCs數(shù)量增高最少。見表3。

表3 3組NSCLC圍術(shù)期CTCs數(shù)量增高情況比較個/5 ml)

3 討論

原發(fā)性支氣管肺癌是我國最常見、病死率最高的惡性腫瘤之一，對早期NSCLC進行外科手術(shù)切除是治療的重要手段，然而患者5年復(fù)發(fā)率仍高達30%。初診時的常規(guī)檢查方法無法探測出的隱匿轉(zhuǎn)移灶是早期肺癌切除術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)的重要原因[8]。通過淋巴結(jié)或循環(huán)系統(tǒng)的轉(zhuǎn)移途徑進入血液循環(huán)成為CTCs是肺癌全身轉(zhuǎn)移的重要環(huán)節(jié)。近年來CTCs作為液體活檢標(biāo)本，其定量、動態(tài)測量逐漸作為監(jiān)測腫瘤細胞復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移及評估療效和預(yù)后的重要手段[9-10]。

微創(chuàng)手術(shù)已成為治療早期肺癌的有效手段，隨著手術(shù)技術(shù)的不斷完善，由三孔法逐漸改進為可以通過單孔進行VATS。臨床研究報道，VATS相比傳統(tǒng)開胸手術(shù)存在創(chuàng)傷小、并發(fā)癥發(fā)生率低、住院時間短、恢復(fù)快等優(yōu)點。然而手術(shù)帶來的圍術(shù)期CTCs的變化尚未可知。本研究通過免疫磁珠法和免疫細胞化學(xué)染色法(Envision法)對傳統(tǒng)手術(shù)、單孔和三孔法VATS NSCLC患者圍術(shù)期CTCs進行檢測發(fā)現(xiàn)，傳統(tǒng)手術(shù)組術(shù)后2 d CTCs數(shù)量顯著多于單孔和三孔VATS組。提示外科手術(shù)不可避免地帶來圍術(shù)期CTCs數(shù)量增加，然而微創(chuàng)VATS手術(shù)比傳統(tǒng)開胸手術(shù)較少引起CTCs的增加。

CTCs在血液循環(huán)中存在數(shù)量極少，每106～107白細胞中僅能發(fā)現(xiàn)1個CTCs，為了增加其檢出率，我們通過免疫磁珠法對其進行富集。通過制備CD45抗體的免疫磁珠，與CTCs表面上皮細胞黏附分子(EpCAM)抗原結(jié)合成為CTCs-抗原/抗體-磁珠復(fù)合物，于外在磁場作用下向一定方向移動，從而富集CTCs，再通過Envision法對CTCs進行檢測[11]。本研究中72.1%患者檢測出CTCs，接近既往研究中CTCs的檢測陽性率[12-13]。

盡管手術(shù)先結(jié)扎肺靜脈，外科機械性操作均不可避免地釋放部分CTCs入外周血，形成CTCs。本研究結(jié)果顯示，傳統(tǒng)手術(shù)組術(shù)前2 d至術(shù)后2 d CTCs數(shù)量增高情況高于單孔及三孔VATS組。提示胸腔鏡下更好的手術(shù)視野、較輕微的機械性操作可能對CTCs變化影響不大；此外，VATS較少刺激免疫系統(tǒng)、進而較少刺激腫瘤細胞增殖可能是CTCs變化較少的原因。其中，三孔VATS操作引起的變化最少[12]。

盡管CTCs的數(shù)量與患者遠期復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的關(guān)系尚無明確結(jié)論，避免圍術(shù)期CTCs的波動仍是手術(shù)的目標(biāo)之一[14]，本研究明確了VATS在較少干擾CTCs方面的優(yōu)勢，尤其三孔法不僅可保證淋巴結(jié)清掃效果、減輕圍術(shù)期并發(fā)癥，還顯著減少了CTCs的增加，具有較大優(yōu)勢。