LncRNA NEAT1和LncRNA-MIAT在老年急性心肌梗死外周血中的表達及臨床意義

郭 俊，徐 利，郭 淼，鐘 慧，吳 敏

急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)是冠狀動脈急性、持續(xù)性缺血缺氧所引起的心肌壞死[1-2]。AMI高發(fā)于老年人，每年新發(fā)至少50萬例，近年來隨著我國老齡化人口加劇，AMI發(fā)病率呈上升趨勢，且病死率、致殘率極高，嚴重威脅老年人生命健康[3-5]。早期正確診斷AMI對提高患者生存率和改善預后非常重要，目前心肌肌鈣蛋白I(cardiac troponin I， cTnI)是臨床廣泛應用于診斷AMI的血清標志物，但其易受心力衰竭、心房顫動及其他嚴重慢性心臟病等影響，造成AMI診斷假陽性[6-7]。因此尋找早期診斷AMI敏感特異的新型標志物是目前臨床研究的方向。多種長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA， LncRNA)在心肌組織中特異性表達，與心肌重構、心功能等密切相關，有可能成為心臟發(fā)育和疾病相關的新型靶向標志物[8-9]。研究報道，LncRNA NEAT1、LncRNA-MIAT與多種癌癥發(fā)生發(fā)展有關[10-11]，且均在炎性因子介導的炎癥反應中發(fā)揮促炎作用[12-14]，但關于LncRNA NEAT1、LncRNA-MIAT在AMI中的作用尚鮮有研究。因此本研究擬檢測老年AMI患者血清LncRNA NEAT1、LncRNA-MIAT表達水平，以探究其對AMI的預測價值。現報告如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取我院2017年10月—2019年9月本院收治的老年AMI患者75例為AMI組，另取同期門診體檢健康老年人75例為對照組。AMI組男42例，女33例；年齡60～81(71.32±9.67)歲；高血壓43例，糖尿病41例，吸煙35例。對照組男39例，女36例；年齡60～81(70.84±9.51)歲。2組年齡、性別比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經我院倫理委員會批準通過，所有樣品采集及資料調查均取得患者及其家屬知情同意并簽字確認，符合《世界醫(yī)學協(xié)會赫爾辛基宣言》。

1.2納入與排除標準 ①納入標準：患者均符合AMI診斷標準[15]；年齡≥60周歲； 發(fā)病12 h內住院并已完成采血；住院前未接受任何相關治療；臨床資料完整。②排除標準：合并肝、腎等重要臟器功能障礙者；合并惡性腫瘤、其他慢性疾病、神經運動系統(tǒng)疾病或心源性休克者；心臟病史、嚴重心律失?；蜓簜魅拘约膊≌撸蛔≡浩陂g合并嚴重并發(fā)癥者。

1.3主要試劑及儀器 Trizol試劑(貨號：R0016)購自上海碧云天生物技術研究所；第一鏈cDNA合成試劑盒(PrimeScriptTMⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit，貨號：6210A)、TB Green? Premix Ex TaqTMⅡ (Tli RNaseH Plus)試劑盒(貨號：RR820A)購自大連TaKaRa生物公司；人cTnI ELISA試劑盒(貨號：MA1-20117)購自美國Invitrogen公司；引物由上海生工生物科技有限公司合成；紫外分光光度計購自美國Thermo公司；7500型RT-qPCR儀購自美國Bio-Rad公司等；DXC600全自動生化儀購自美國貝克曼庫爾特公司。

1.4方法

1.4.1血清LncRNA NEAT1、LncRNA-MIAT水平檢測：發(fā)病12 h內采集AMI組及對照組納入者肘靜脈外周血2份，每份3 ml，3500 r/min，有效離心半徑10 cm，離心10 min，分離血清置于-80℃冰箱待檢。采用Trizol提取血清總RNA，用紫外分光光度計檢測總RNA 濃度及純度，A260/A280為1.8～2.0可用于下游試驗。反轉錄獲得模板cDNA，置于-20℃保存?zhèn)溆谩２捎肦T-qPCR檢測LncRNA NEAT1、LncRNA-MIAT表達水平。RT-qPCR采用20 μl反應體系：TB Green Premix Ex Taq Ⅱ(Tli RNaseH Plus)(2×) 10 μl，ROX Reference Dye or Dye Ⅱ(50×)0.4 μl，cDNA(50 ng/μl)2 μl，上下游引物(10 μmol/L)各0.8 μl，ddH2O 6.0 μl。反應條件：95℃，30 s；95℃，5 s；60℃，34 s，40個循環(huán)；添加溶解曲線。LncRNA NEAT1上游引物序列5′-CAATGACTTGGGGATGATGCAAACAATTACTG-3′，下游引物序列5′-GTACTCCCCACCTACACACCCAC-3′；LncRNA-MIAT上游引物序列5′-TACAGTACTGTGAUAACTGAA-3′，下游引物序列5′-CAGTTATCAGTACT-3′；GTATT及內參GAPDH上游引物序列5′-GTCGATGGCTAGTCGTAGCATCGAT-3′，下游引物序列5′-TGCTAGCTGGCATGCCCGATCGATC-3′。采用2-ΔΔCt法對血清LncRNA NEAT1、LncRNA-MIAT相對表達水平進行定量分析。

1.4.2血清心肌酶譜水平檢測：采用ELISA檢測納入者血清cTnI水平，具體操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。采用DXC600全自動生化儀檢測血清肌酸激酶(CK)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)水平，其正常參考范圍分別為血清cTnI：0～0.2 μg/L；CK：24～170 U/L；CK-MB：0～25 U/L。

2 結果

2.1血清LncRNA NEAT1、LncRNA-MIAT水平比較 AMI組血清LncRNA NEAT1、LncRNA-MIAT水平均顯著高于對照組(P<0.01)。見表1。

表1 2組血清LncRNA NEAT1、LncRNA-MIAT水平比較

2.2血清cTnI、CK、CK-MB水平比較 與對照組比較，AMI組血清cTnI、CK-MB水平顯著升高(P<0.01)，但2組CK水平比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 2組血清心肌酶譜cTnI、CK、CK-MB水平比較

2.3AMI患者血清LncRNA NEAT1、LncRNA-MIAT與CK-MB、cTnI相關性分析 AMI患者血清LncRNA NEAT1與LncRNA-MIAT水平呈正相關(P<0.01)，且LncRNA NEAT1和LncRNA-MIAT均與CK-MB、cTnI水平呈正相關(P<0.01)。見表3。

表3 AMI患者血清LncRNA NEAT1、LncRNA-MIAT與CK-MB、cTnI相關性

2.4血清LncRNA NEAT1、LncRNA-MIAT水平對AMI發(fā)生的預測價值分析 以血清LncRNA NEAT1、LncRNA-MIAT水平及二者聯合檢測為檢驗變量，繪制ROC曲線，AUC間比較采用DeLong等[16]提出的方法。血清LncRNA NEAT1、LncRNA-MIAT單獨預測AMI發(fā)生的AUC分別為0.884、0.801，LncRNA NEAT1≥2.00預測AMI發(fā)生的靈敏度為77.30%，特異度為92.00%；LncRNA-MIAT≥1.40預測AMI發(fā)生的靈敏度為77.30%，特異度為86.70%。二者聯合檢測時AUC、靈敏度、特異度均顯著提高(P<0.01)。見圖1、表4。

圖1 血清LncRNA NEAT1、LncRNA-MIAT水平預測AMI發(fā)生的ROC曲線AMI為急性心肌梗死,LncRNA為長鏈非編碼RNA，ROC為受試者工作特征曲線

表4 血清LncRNA NEAT1、LncRNA-MIAT水平對AMI發(fā)生的預測價值分析

3 討論

冠狀動脈粥樣硬化是AMI的發(fā)病基礎，冠狀動脈內不穩(wěn)定性斑塊破裂后，血小板發(fā)生活化，激發(fā)凝血級聯反應使血液處于高凝狀態(tài)，形成栓塞造成心肌缺血、心肌損傷壞死,亦可誘發(fā)機體炎癥和免疫反應，造成心肌細胞免疫損傷[16]。尋找與心肌細胞凋亡相關的生物標志分子有助于AMI的臨床診斷。CK-MB主要分布在心肌，血清CK-MB水平在心肌損傷后2～12 h急劇上升，一般持續(xù)2～3 d，是臨床常用診斷心肌損傷的指標之一。cTnI是肌鈣蛋白的一個亞型，特異存在于心肌細胞的細肌絲上，心肌損傷后釋放入血且存在時間長，是臨床診斷AMI常用的特異生物學標志物[8,17]。本研究結果顯示，與對照組比較，AMI組血清CK-MB、cTnI水平顯著升高，提示AMI患者存在CK-MB、cTnI水平升高，可能發(fā)生心肌損傷或壞死。但CK-MB、cTnI升高還見于其他任何導致心肌細胞損傷或通透性改變的疾病和病理狀態(tài)，因此僅檢測血清CK-MB、cTnI水平易使AMI診斷的假陽性率增加。

LncRNA是一類長度超多200個核苷酸的非編碼RNA，具有多種生物學功能，與基因的表達、轉錄、翻譯關系密切，在人體生長、代謝、疾病及細胞周期、凋亡中亦發(fā)揮重要作用[18-19]。研究證實，多種LncRNA可在心肌組織中特異性表達，成為心臟發(fā)育及疾病相關獨特的檢測分子[20-21]。韓虎魁等[17]研究報道，與對照組比較，AMI患者血清中LncRNA AK057321水平在AMI發(fā)作2 h內開始升高，6 h到達高峰后呈下降趨勢，但2～4 d內依然高于正常對照組，且與CK-MB及cTnI呈正相關。關于血清LncRNA NEAT1、LncRNA-MIAT與AMI直接相關的研究尚鮮有報道。黃舒穎等[22]報道，與空白RAW264.7巨噬細胞比較，結核分枝桿菌H37Rv感染的RAW264.7巨噬細胞中LncRNA NEAT1及白介素(IL)-6水平顯著升高，沉默LncRNA NEAT1后，IL-6水平下降。Shui等[13]認為，LncRNA NEAT1可調節(jié)poly(I∶C)誘導的IL-8表達，還可選擇性調控Toll樣受體2(TLR2)信號通路下游細胞因子IL-6、CCL2等表達，但對腫瘤壞死因子(TNF)-α水平無顯著影響。Tan等[23]報道，與對照組比較，冠心病患者血清LncRNA-MIAT水平顯著升高，且與血清IL-6、TNF-α水平呈正相關。任成龍等[12]研究報道，血管內皮細胞中LncRNA-MIAT水平隨TNF-α刺激時間及濃度增加而升高，LncRNA-MIAT可能參與血管內皮細胞炎癥反應。Li等[24]研究報道，LncRNA-MIAT可通過靶向miR-93調控TLR4進而激活PI3K/Akt/mTOR 通路導致心肌肥厚。本研究結果顯示，與對照組比較，AMI組血清LncRNA NEAT1、LncRNA-MIAT水平顯著升高，提示LncRNA NEAT1、LncRNA-MIAT可能通過介導炎癥反應，與AMI發(fā)生有關。本研究結果還顯示，血清LncRNA NEAT1、LncRNA-MIAT水平與CK-MB、 cTnI均呈正相關，提示血清LncRNA NEAT1、LncRNA-MIAT可能通過介導炎癥反應促進AMI心肌損傷。

本研究結果顯示，血清LncRNA NEAT1、LncRNA-MIAT單獨預測AMI發(fā)生的AUC分別為0.884、0.801，LncRNA NEAT1≥2.00預測AMI發(fā)生的靈敏度為77.30%，特異度為92.00%；LncRNA-MIAT≥1.40預測AMI發(fā)生的的靈敏度為77.30%，特異度為86.70%。二者聯合檢測時AUC、靈敏度、特異度均顯著提高。提示聯合檢測血清LncRNA NEAT1、LncRNA-MIAT水平可能對AMI早期診斷有一定預測價值。

綜上所述，LncRNA NEAT1、LncRNA-MIAT在AMI患者血清中高表達，可能與AMI患者心肌損傷有關，二者聯合檢測對AMI發(fā)生有一定預測價值。但由于本研究樣本量少，存在不足；另外關于LncRNA NEAT1、LncRNA-MIAT參與AMI具體機制及相關通路尚不清楚，后期有待進一步大樣本量深入探究。