葛根素激活Sirt1抑制炎癥和纖維化減輕壓力負(fù)荷誘導(dǎo)小鼠心肌肥厚的研究

王子寬，李菁華，李 煒，楊競霄

心肌肥厚是心臟在遭受慢性機械或容量超負(fù)荷和神經(jīng)體液因素激活等心血管疾病如高血壓、心肌梗死和瓣膜功能障礙等做出的適應(yīng)性反應(yīng)，心肌負(fù)荷增大會引起心室壁代償性肥厚以維持穩(wěn)定的心輸出量[1-4]。而這種病理性的心肌重塑常伴有心肌纖維化并會導(dǎo)致心臟功能障礙和心肌細(xì)胞凋亡，最終演變?yōu)樾牧λソ遊5-7]。因此，有效防治病理性心肌肥厚對于降低或延緩心力衰竭的發(fā)生、發(fā)展非常重要。然而，臨床還未見能有效抑制心肌肥厚的藥物，因此，探討心肌肥厚的發(fā)生機制并尋找安全、可靠、有效的治療藥物成為臨床和基礎(chǔ)研究中亟待解決的問題。葛根素(puerarin, Pue)是傳統(tǒng)中藥葛根和粉葛的主要有效成分，是從豆科植物野葛、甘葛藤的干燥根中提取的黃酮苷[8-9]，化學(xué)名為8-β-D葡萄吡喃糖-4',7-二羥基異黃酮。由于其具有明顯的雌激素樣作用，可在心血管疾病中發(fā)揮重要保護(hù)作用[10-13]。然而，Pue發(fā)揮心血管保護(hù)作用機制不清楚，且受限于臨床試驗的設(shè)計和樣本量偏少的局限性，成為其在心血管疾病臨床治療中面臨的巨大挑戰(zhàn)。有研究表明，Pue在心肌肥厚中發(fā)揮保護(hù)作用，但是否能通過抑制炎癥反應(yīng)和心肌纖維化減輕壓力負(fù)荷誘導(dǎo)的心肌肥厚還不清楚。本實驗采用C57/bl小鼠胸主動脈弓縮窄術(shù)(TAC)制備心肌肥厚模型，探討Pue在壓力負(fù)荷誘導(dǎo)的心肌肥厚中的保護(hù)作用和機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物與試劑 于空軍軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心購買48只8周齡成年雄性C57/bl小鼠；Pue和EX527購于美國Sigma公司；RNA提取試劑盒和反轉(zhuǎn)錄試劑盒購于天根生化科技(北京)有限公司；腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白介素-1β(IL-1β)含量檢測試劑盒購于南京建成生物公司；Collagen Ⅰ、α-SMA、沉默信息轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子1(Sirt1)和Ac-FOXO1抗體購自Cell Siginal Technology公司，β-actin、辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠和山羊抗兔二抗購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2實驗分組及心肌肥厚模型的制備 48只小鼠隨機分成假手術(shù)組(Sham組)、TAC組、Pue干預(yù)TAC組(Pue+TAC組)、Pue聯(lián)合EX527干預(yù)TAC組(Pue+EX527+TAC組)，每組12只。根據(jù)文獻(xiàn)[14]方法，采用常規(guī)的TAC制備心肌肥厚模型，用異氟烷將雄性C57/bl小鼠麻醉，將小鼠固定于操作臺上，行氣管插管并連接呼吸機，由第二肋間行開胸術(shù)，鈍性分離胸腺和脂肪組織，暴露主動脈弓并游離，在左側(cè)頸總動脈和無名動脈之間墊27G針并用7-0絲線結(jié)扎主動脈弓，然后取下針頭，形成縮窄區(qū)，手術(shù)結(jié)束后，逐層關(guān)胸縫皮。Sham組小鼠手術(shù)操作與模型組相同，但不結(jié)扎主動脈弓。

1.3干預(yù)方法 Pue+TAC組術(shù)后給予65 mg/kg Pue飲用，Pue+EX527+TAC組在Pue+TAC組基礎(chǔ)上給予腹腔注射2 mg/kg EX527，持續(xù)4周。Sham組和TAC組術(shù)后正常飲水，同時腹腔注射相同體積的生理鹽水，持續(xù)4周。

1.4觀察指標(biāo)

1.4.1超聲檢測心臟功能：術(shù)后4周，用脫毛膏去除小鼠胸前被毛，用VEVO 770小動物超聲儀檢測左心室射血分?jǐn)?shù)(left ventricular ejection fraction， LVEF)與左心室短軸縮短率(left ventricular fractional shortening, LVFS)。

1.4.2血清中TNF-α和IL-1β含量測定：術(shù)后4周，根據(jù)南京建成生物公司提供的ELISA試劑盒說明書采用酶標(biāo)儀檢測4組小鼠血清中TNF-α和IL-1β的含量，并按照說明書中的方法將測量的TNF-α或IL-1β吸光值轉(zhuǎn)換為含量來表示。

1.4.3實時熒光定量PCR檢測鈉尿肽(ANP)、腦鈉肽(BNP)和β-肌球蛋白重鏈(β-MHC)mRNA水平：按照RNA提取試劑盒操作方法提取4組心臟組織總RNA，分光光度儀定量RNA濃度，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA；配制20 μl總體積的PCR反應(yīng)體系，其成分包括：cDNA 2 μl、超純水7.4 μl、引物0.8 μl和SYBR Green Mix 9 μl。擴增反應(yīng)按照：95℃預(yù)變性10 min，95℃變性10 s，60℃退火15 s，72℃延伸10 s，共40個循環(huán)。計算Ct值、2-ΔΔCt值。以GAPDH作為內(nèi)參，引物序列見表1。

表1 ANP、BNP、β-MHC實時熒光定量PCR擴增引物序列

1.4.4心肌肥厚程度檢測：心臟功能檢測結(jié)束后，稱重并記錄每只小鼠體質(zhì)量(body weight, BW)，然后將小鼠過量麻醉處死，快速取下心臟并稱重(heart weight, HW)，計算心臟質(zhì)量/體質(zhì)量比值(HW/BW)，評估心肌肥厚程度。

1.4.5HE染色和Masson三色染色：用4%多聚甲醛將4組心臟固定，行常規(guī)脫水和石蠟包埋，并切成3 μm的切片。分別按照常規(guī)HE染色和Masson三色染色的方法操作，染好后用中性樹脂封片。

1.4.6Western blot測定蛋白表達(dá)情況：用RIPA裂解液提取組織蛋白，采用BCA法測定各組蛋白濃度，蛋白樣品用沸水浴煮10 min；配制10%或12% SDS-PAGE分離膠，控制每孔蛋白樣品上樣量為35 μg，恒壓80 V在電泳緩沖液中電泳，恒流240 mA轉(zhuǎn)膜120 min，將目的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，將脫脂奶粉洗去，然后將目的條帶切下分別放入Collage I、α-SMA、Sirt1、Ac-FOXO1(1∶1000)和β-actin(1∶5000)抗體管中4℃靜置過夜；第2天，TBST洗膜，3次，每次10 min，用辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔和山羊抗鼠二抗(1∶5000)室溫?fù)u床孵育2 h，TBST洗膜，3次，每次10 min，ECL顯色，用Image J圖像分析軟件進(jìn)行灰度值分析，以β-actin作為內(nèi)參。

2 結(jié)果

2.1小鼠存活情況 Sham組小鼠全部存活，行TAC的小鼠術(shù)后有2只死亡。

2.2心肌肥厚程度比較 與Sham組比較，術(shù)后4周，TAC組HW/BW均顯著增加，心肌細(xì)胞橫截面積明顯增大(P<0.01)；與TAC組比較，Pue+TAC組HW/BW明顯降低，心肌細(xì)胞橫截面積明顯減小(P<0.01)；而與Pue+TAC組比較，Pue+EX527+TAC組HW/BW顯著增加，心肌細(xì)胞橫截面積明顯增大(P<0.01)。見圖1、2。

圖1 4組小鼠術(shù)后4周心肌組織病理學(xué)表現(xiàn)(HE×400)Sham組為假手術(shù)組，TAC為主動脈弓縮窄術(shù)，Pue為葛根素

圖2 4組小鼠術(shù)后4周心臟心肌肥厚程度比較Sham組為假手術(shù)組，TAC為主動脈弓縮窄術(shù)，Pue為葛根素；與Sham組比較，bP<0.01；與TAC組比較，dP<0.01；與Pue+TAC組比較，fP<0.01

2.3心臟纖維化比較 與Sham組比較，術(shù)后4周，TAC組心肌組織膠原纖維含量、Collagen Ⅰ和α-SMA蛋白表達(dá)水平顯著增加(P<0.01)；與TAC組比較，Pue+TAC組膠原纖維含量、Collagen Ⅰ和α-SMA蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.01)；與Pue+TAC組比較，Pue+EX527+TAC組膠原纖維含量、Collagen Ⅰ和α-SMA蛋白表達(dá)水平明顯增加(P<0.01)。見圖3、4。

圖3 4組小鼠術(shù)后4周心臟纖維化病理學(xué)表現(xiàn)(Masson×400)Sham組為假手術(shù)組，TAC為主動脈弓縮窄術(shù)，Pue為葛根素

圖4 4組小鼠術(shù)后4周心肌組織膠原纖維含量、Collagen Ⅰ和α-SMA蛋白表達(dá)水平Sham組為假手術(shù)組，TAC為主動脈弓縮窄術(shù)，Pue為葛根素；與Sham組比較，bP<0.01；與TAC組比較，dP<0.01；與Pue+TAC組比較，fP<0.01

2.4心臟功能比較 與Sham組比較，術(shù)后4周，TAC組LVEF和LVFS均明顯降低(P<0.01)；與TAC組比較，Pue+TAC組LVEF和LVFS顯著增加(P<0.01)；而與Pue+TAC組比較，Pue+EX527+TAC組LVEF和LVFS顯著降低(P<0.01)。見圖5。

圖5 4組小鼠術(shù)后4周心臟LVEF和LVFS值比較Sham組為假手術(shù)組，TAC為主動脈弓縮窄術(shù)，Pue為葛根素，LVEF為左心室射血分?jǐn)?shù)，LVFS為左心室短軸縮短率；與Sham組比較，bP<0.01；與TAC組比較，dP<0.01；與Pue+TAC組比較，fP<0.01

2.5心肌肥厚相關(guān)基因表達(dá)情況 與Sham組比較，術(shù)后4周，TAC組ANP、BNP和β-MHC mRNA水平均明顯增加(P<0.01)；與TAC組比較，Pue+TAC組ANP、BNP和β-MHC mRNA水平顯著降低(P<0.01)；而與Pue+TAC組比較，Pue+EX527+TAC組ANP、BNP和β-MHC mRNA水平均明顯增加(P<0.01)。見圖6。

圖6 4組小鼠術(shù)后4周心臟肥厚相關(guān)基因表達(dá)情況Sham組為假手術(shù)組，TAC為主動脈弓縮窄術(shù)，Pue為葛根素，ANP為鈉尿肽，BNP為腦鈉肽，β-MHC為β-肌球蛋白重鏈；與Sham組比較，bP<0.01；與TAC組比較，dP<0.01；與Pue+TAC組比較，fP<0.01

2.6血清中TNF-α和IL-1β含量比較 與Sham組比較，術(shù)后4周，TAC組血清中TNF-α和IL-1β含量顯著增加(P<0.01)；與TAC組比較，Pue+TAC組血清中TNF-α和IL-1β含量明顯降低(P<0.01)；而與Pue+TAC組比較，Pue+EX527+TAC組血清中TNF-α和IL-1β含量顯著增加(P<0.01)。見圖7。

圖7 4組小鼠血清中TNF-α和IL-1β含量比較Sham組為假手術(shù)組，TAC為主動脈弓縮窄術(shù)，Pue為葛根素，TNF-α為腫瘤壞死因子-α，IL-1β為白介素-1β；與Sham組比較，bP<0.01；與TAC組比較，dP<0.01；與Pue+TAC組比較，fP<0.01

2.7心臟Sirt1信號的變化 與Sham組比較，TAC組Sirt1蛋白表達(dá)量明顯降低，Ac-FOXO1的蛋白表達(dá)量顯著增加(P<0.01)；與TAC組比較，Pue+TAC組Sirt1蛋白表達(dá)量增加，Ac-FOXO1的蛋白表達(dá)量降低(P<0.01)；與Pue+TAC組比較，Pue+EX527+TAC組Sirt1蛋白表達(dá)量明顯降低，Ac-FOXO1的蛋白表達(dá)量顯著增加(P<0.01)。見圖8。

圖8 4組小鼠心臟Sirt1信號變化情況Sham組為假手術(shù)組，TAC為主動脈弓縮窄術(shù)，Pue為葛根素，Sirt1為沉默信息轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子1；與Sham組比較，bP<0.01；與TAC組比較，dP<0.01；與Pue+TAC組比較，fP<0.01

3 討論

心肌肥厚是心肌缺血、心律失常和心源性猝死的獨立危險因素，參與多種心血管疾病的病理進(jìn)程[15]。除了少部分基因突變或生長因子異常因素外，心肌肥厚主要是由于心肌長時間負(fù)荷過重，導(dǎo)致心室壁增厚，心肌收縮力增強，以維持心臟的正常收縮功能所形成的一種代償性反應(yīng)。長期慢性刺激所導(dǎo)致的病理性肥厚在失代償期會出現(xiàn)心臟收縮功能障礙、心室擴張，最后演變?yōu)樾牧λソ?。目前，臨床常用治療心力衰竭的藥物有鈣離子通道阻滯劑、血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑和血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(ACEI)[16]，然而，這三種藥物在減輕心肌肥厚的同時會產(chǎn)生較大的不良反應(yīng)，限制了其臨床應(yīng)用。

Pue作為傳統(tǒng)中藥成分，具有雌激素樣作用，在抗心肌缺血、抗炎、抗氧化、抗動脈粥樣硬化等方面均具有較好的治療效果，已被廣泛用于治療心血管疾病、肝臟疾病和糖尿病等，其作用機制與抗細(xì)胞凋亡和抗氧化應(yīng)激有關(guān)[17-18]。然而Pue在壓力導(dǎo)致的心肌肥厚中的作用及其機制還不十分清楚。眾所周知，心肌肥厚時會出現(xiàn)心肌細(xì)胞肥大，肥厚相關(guān)基因表達(dá)的增加，并伴有心臟功能降低。本研究發(fā)現(xiàn)，與Sham組比較，TAC組HW/BW、心肌細(xì)胞橫截面積、Collagen Ⅰ和α-SMA蛋白表達(dá)均明顯增加，并出現(xiàn)ANP、BNP和β-MHC mRNA水平的增加，而心臟功能明顯降低；Pue處理后可明顯減小HW/BW和心肌細(xì)胞橫截面積，降低Collagen Ⅰ和α-SMA蛋白表達(dá)，改善心臟功能，同時，明顯降低TAC導(dǎo)致的ANP、BNP和β-MHC mRNA水平的增加。值得注意的是，EX527能夠阻斷Pue減小HW/BW和心肌細(xì)胞橫截面積、Collagen Ⅰ和α-SMA蛋白表達(dá)以及改善心臟功能的作用，也能明顯增加ANP、BNP和β-MHC mRNA水平。提示Pue可減輕TAC誘發(fā)的心肌肥厚，而EX527能夠阻斷這一作用。因此，有必要進(jìn)一步闡明Pue減輕TAC誘發(fā)心肌肥厚的機制以及EX527在其中的作用。

Sirt1是一類高度保守的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)依賴性去乙?；福赏ㄟ^使底物FOXO1去乙?；{(diào)節(jié)不同轉(zhuǎn)錄因子的活性[19]。Sirt1參與細(xì)胞內(nèi)多種生理及病理過程，并在多種心血管疾病中發(fā)揮重要作用。研究表明，Sirt1信號可參與調(diào)控細(xì)胞凋亡、增殖、炎癥、氧化應(yīng)激、線粒體功能等過程，在多種疾病模型的預(yù)防和治療中發(fā)揮作用[20-21]。EX527是Sirt1的選擇性抑制劑，在基礎(chǔ)研究中常被用來阻斷Sirt1分子的作用以探討Sirt1的作用。本研究發(fā)現(xiàn)，與Sham組比較，TAC組心肌纖維化程度、TNF-α和IL-1β含量增加，而Pue處理后，可明顯降低心肌纖維化和炎性因子水平；EX527能夠阻斷Pue降低TAC引起的心肌纖維化程度和炎癥反應(yīng)的作用，提示EX527能夠阻斷Pue對心肌肥厚的保護(hù)作用。本研究結(jié)果還顯示，與Sham組比較，TAC組Sirt1蛋白水平降低而其底物FOXO1乙?；矫黠@增加，用EX527干預(yù)后能夠抑制Pue引起的Sirt1蛋白水平的上調(diào)和其底物FOXO1乙?；降慕档?，提示EX527具有阻斷心肌肥厚中Pue激活Sirt1，降低FOXO1乙?；降淖饔?，這也證實在TAC誘導(dǎo)的心肌肥厚中，Pue通過激活Sirt1/FOXO1信號通路降低心肌纖維化和炎癥反應(yīng)而發(fā)揮保護(hù)作用。

綜上所述，本研究證實了Pue具有減輕壓力負(fù)荷導(dǎo)致的心肌肥厚的作用，并闡明其機制是通過增加Sirt1活性，降低FOXO1乙?；剑瑴p輕心肌纖維化和炎癥反應(yīng)，改善心臟功能發(fā)揮保護(hù)作用。本實驗結(jié)果進(jìn)一步完善和闡明了Pue在壓力負(fù)荷誘導(dǎo)的心肌肥厚中的保護(hù)作用及機制，并為臨床應(yīng)用Pue防治心肌肥厚提供了新的實驗依據(jù)和理論支持。