基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對(duì)馬鞭草-青蒿藥干預(yù)新型冠狀病毒肺炎的物質(zhì)基礎(chǔ)與作用機(jī)制研究

蔡孟成，金永生

新型冠狀病毒肺炎對(duì)人類(lèi)健康造成了極大威脅，根據(jù)中國(guó)中藥組分庫(kù)數(shù)據(jù)顯示，馬鞭草對(duì)于冠狀病毒引起的肺部損傷，特別是小氣道損傷、微血栓具有很強(qiáng)的活性；同時(shí)，國(guó)家衛(wèi)健委發(fā)布的《新型冠狀病毒肺炎診療方案》也將青蒿和馬鞭草納入治療普通型濕毒郁肺證的中藥藥方[1-2]。本文旨在通過(guò)對(duì)馬鞭草-青蒿進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析，以期明確其物質(zhì)基礎(chǔ)及可能的作用機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1藥物相關(guān)靶點(diǎn)的篩選 本研究采用生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室的中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)和分析平臺(tái)(TCMSP)(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)檢索中藥馬鞭草、青蒿的活性成分及靶點(diǎn)。根據(jù)化合物口服生物利用度(OB)≥30%與類(lèi)藥性(DL)≥0.18進(jìn)行篩選[3-4]。

1.2構(gòu)建化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò) 以novel coronavirus pneumonia為關(guān)鍵詞檢索GeneCard (https://www.genecards.org/)數(shù)據(jù)庫(kù)收集與新型冠狀病毒肺炎相關(guān)的作用靶點(diǎn)。將“1.1”中成分靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)進(jìn)行交集。為明確疾病相關(guān)靶點(diǎn)與馬鞭草-青蒿藥對(duì)相關(guān)靶點(diǎn)之間的關(guān)系，將上述兩部分靶點(diǎn)進(jìn)行交集，輸入Cytoscape3.6.1軟件構(gòu)建出化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。Cytoscape軟件的核心架構(gòu)是網(wǎng)絡(luò)，每個(gè)節(jié)點(diǎn)是基因、蛋白質(zhì)或分子，節(jié)點(diǎn)與節(jié)點(diǎn)之間的連接代表這些生物分子之間的相互作用，節(jié)點(diǎn)的度值代表網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)與節(jié)點(diǎn)相連的數(shù)目。

1.3構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò) 為更深層次探究靶點(diǎn)蛋白之間的相互作用，將統(tǒng)計(jì)所得的疾病-藥物靶點(diǎn)基因上傳至在線(xiàn)STRING10.5軟件(http://string db.org)，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)模型。物種選擇為人(Homosapiens)，參數(shù)保持默認(rèn)設(shè)置，獲取PPI網(wǎng)絡(luò)。

1.4生物過(guò)程與通路分析 利用R Project中的org.Hs.eg.db程序包(http://www.bioconductor.org /packages/release/data/annotation/html/org.Hs.eg.db.html)將基因symbols轉(zhuǎn)變?yōu)镋ntrez IDs，進(jìn)而利用clusterProfiler程序包(3.6版)(http://bioconductor.org/packages /release/bioc/html/clusterProfiler.html)對(duì)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行基因本體(GO)富集分析和京都基因與基因組百科全書(shū)(KEGG)通路富集分析，保存結(jié)果。設(shè)定閾值P<0.05，并按照涉及的靶點(diǎn)數(shù)目多少進(jìn)行排序，篩選GO富集分析中分子功能、細(xì)胞組成和生物過(guò)程的前10個(gè)條目以及KEGG富集的前20個(gè)信號(hào)通路。

2 結(jié)果

2.1篩選藥物活性成分 通過(guò)TCMSP檢索到馬鞭草、青蒿中化合物共184個(gè)：其中58個(gè)來(lái)自馬鞭草，126個(gè)來(lái)自青蒿。以O(shè)B≥30%且DL≥0.18篩選出化合物34個(gè)：其中12個(gè)來(lái)自馬鞭草，22個(gè)來(lái)自青蒿。其中MOL005229-蒿黃素、MOL000449-豆甾醇、MOL000422-山柰酚、MOL000098-槲皮素、MOL000006-木樨草素為青蒿與馬鞭草的共有成分。部分化合物見(jiàn)表1。

表1 馬鞭草-青蒿部分活性成分

2.2化合物-靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 采用Cytoscape3.6.1軟件構(gòu)建的化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)包含23個(gè)化合物節(jié)點(diǎn)、43個(gè)靶點(diǎn)節(jié)點(diǎn)和135條邊，用紅色節(jié)點(diǎn)表示青蒿與馬鞭草的活性成分，綠色節(jié)點(diǎn)表示疾病靶點(diǎn)，連接化合物與靶點(diǎn)的邊表示他們之間有作用關(guān)系(圖1)。依據(jù)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)性質(zhì)可知，有較多節(jié)點(diǎn)的化合物或藥物靶點(diǎn)在整個(gè)網(wǎng)絡(luò)中可能起到關(guān)鍵的作用，因此本研究篩選節(jié)點(diǎn)度較大的節(jié)點(diǎn)進(jìn)行分析。排名前五位的化合物分別為槲皮素(quercetin)、木樨草素(luteolin)、山柰酚(kaempferol)、β-谷甾醇(beta-sitosterol)、β-胡蘿卜素(beta-carotene)，分別能與38、18、13、7、6個(gè)靶點(diǎn)蛋白發(fā)生作用。從靶點(diǎn)的角度看，度值排名前5位的是前列腺素過(guò)氧化物合酶2(PTGS2)、前列腺素過(guò)氧化物合酶1(PTGS1)、一氧化氮合酶(NOS2)、過(guò)氧化物酶體增生激活受體γ(PPARG)、絲裂原活化蛋白激酶14(MAPK14)，分別能與22、14、14、10和6個(gè)化合物發(fā)生相互作用，體現(xiàn)了中藥多靶點(diǎn)的特性。

圖1 馬鞭草-青蒿主要成分-靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)

2.3馬鞭草-青蒿靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析 應(yīng)用STRING10.5軟件構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，其中包含節(jié)點(diǎn)43個(gè)，1094條邊，同時(shí)得到網(wǎng)絡(luò)中關(guān)鍵靶點(diǎn)的頻次(圖2)。根據(jù)“度值>均值”篩選出關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)25個(gè)，包括：IL6、MAPK8、CASP3、IL10、CXCL8、MAPK1、ALB、CCL2、IL1B、PTGS2、IFNG、IL4、FOS、ICAM1、MAPK14、RELA、IL2、CASP8、EGFR、STAT1、BCL2L1、HMOX1、NOS2、PPARG、CXCL10。度值最高的是IL6和MAPK8，為38；其次為CASP3，度值為37；IL10度值為36。度值大的靶點(diǎn)提示在網(wǎng)絡(luò)調(diào)控中起著關(guān)鍵作用，可能是馬鞭草-青蒿治療新型冠狀病毒肺炎的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

圖2 馬鞭草-青蒿中關(guān)鍵靶點(diǎn)頻次

2.4GO富集與KEGG通路富集分析 GO生物過(guò)程條目主要包括：對(duì)脂多糖的反應(yīng)，脂多糖的細(xì)胞反應(yīng)，外源性凋亡信號(hào)通路以及應(yīng)答氧化壓力等；分子功能包括：細(xì)胞因子結(jié)合、細(xì)胞因子活性、受體配體活性、BH結(jié)構(gòu)域結(jié)合以及死亡結(jié)構(gòu)域結(jié)合；并且參與了膜筏、膜微小結(jié)構(gòu)、空腔等結(jié)構(gòu)的組成。KEGG富集信號(hào)通路主要包括：細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體及結(jié)合信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、NF-κ B信號(hào)通路、凋亡信號(hào)通路等。見(jiàn)圖3。

圖3 馬鞭草-青蒿抗新型冠狀病毒肺炎KEGG富集分析的氣泡圖

3 討論

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為新型冠狀病毒肺炎屬于濕熱疫的范疇，在治療方法上應(yīng)當(dāng)清熱利濕[5-7]。青蒿味苦、辛，性寒，歸肝膽經(jīng)，具有清虛熱、除骨蒸、解暑熱的功效，臨床常用于治療溫邪傷陰、骨蒸癆熱等病癥，主要針對(duì)新型冠狀病毒肺炎中“熱”的特點(diǎn)；馬鞭草味苦，性涼，歸肝脾經(jīng)，具有利水消腫、清利濕熱、活血散瘀的功效，主治濕熱水腫、外感發(fā)熱等病癥，主要針對(duì)新型冠狀病毒肺炎中“濕”的特點(diǎn)。《江蘇驗(yàn)方草藥選編》中記載馬鞭草配伍青蒿與羌活可以治療傷風(fēng)感冒，可見(jiàn)，馬鞭草-青蒿藥基于中醫(yī)理論對(duì)治療新型冠狀病毒肺炎具有一定療效。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為新型冠狀病毒肺炎是由新型冠狀病毒感染導(dǎo)致的，故而抗病毒已成為治療的重要舉措，利巴韋林、洛匹那韋等抗病毒藥物已經(jīng)應(yīng)用于臨床。中藥復(fù)方相對(duì)于西藥而言具有多靶點(diǎn)、低毒性的特點(diǎn)?，F(xiàn)代實(shí)驗(yàn)研究表明，馬鞭草對(duì)雞新城疫病毒有直接的滅活作用，其機(jī)制可能是通過(guò)抑制其生物合成實(shí)現(xiàn)[8]。青蒿中的青蒿揮發(fā)油——羥丙基-β-環(huán)糊精可以抑制呼吸道合胞病毒，柯薩奇病毒A16型的活性[9]；青蒿琥酯能顯著抑制乙型肝炎病毒抗原的表達(dá)[10]；青蒿鞣質(zhì)對(duì)單純皰疹病毒具有明顯的直接殺滅作用，可以阻斷病毒的吸附過(guò)程并抑制病毒在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制[11]；劉桂梅等[12]也探討了青蒿素及其衍生物用于治療新型冠狀病毒肺炎的可行性。可見(jiàn)，馬鞭草-青蒿藥對(duì)通過(guò)有效成分的相互作用可能能夠發(fā)揮新型冠狀病毒的滅活作用。

現(xiàn)代藥物化學(xué)研究表明，馬鞭草中含有山柰酚、芹菜素、槲皮素、木樨草素、異鼠李素、毛蕊花糖苷、馬鞭草苷、β-谷甾醇等化合物[13]；青蒿中含有青蒿素、β-谷甾醇、芹菜素、山柰酚、槲皮素、木樨草素、澤蘭林素等活性成分[14]。本研究表明，馬鞭草-青蒿藥對(duì)抗新型冠狀病毒肺炎的主要活性成分可能是槲皮素、木樨草素、山柰酚、β-谷甾醇、β-胡蘿卜素。槲皮素可以與F蛋白相互作用阻斷病毒的黏附，發(fā)揮抗人呼吸道合胞病毒的作用[15]；木樨草素可通過(guò)干擾外殼蛋白I復(fù)合物的表達(dá)降低甲型流感病毒的含量[16]；β-胡蘿卜素對(duì)腺病毒轉(zhuǎn)化的293細(xì)胞和人類(lèi)皰疹病毒轉(zhuǎn)化的Raji細(xì)胞的增殖具有明顯的抑制作用，對(duì)293細(xì)胞內(nèi)整合的腺病毒早期基因的表達(dá)具有下調(diào)作用[17]。由此可見(jiàn)，槲皮素、木樨草素與β-胡蘿卜素可能是抗病毒的主要活性成分。

基于目前的臨床調(diào)查，新型冠狀病毒肺炎的嚴(yán)重程度與病毒和機(jī)體炎癥反應(yīng)的強(qiáng)度相關(guān)，隨著疾病進(jìn)展，如果患者體內(nèi)出現(xiàn)過(guò)度的炎癥反應(yīng)，即“細(xì)胞因子風(fēng)暴”，將可能導(dǎo)致肺上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞大量凋亡最終引起急性肺損傷與呼吸窘迫綜合征等，故重期與危重期急需抗炎治療[18]。山柰酚可以減輕脂多糖導(dǎo)致的小鼠急性肺損傷，其機(jī)制可能是通過(guò)抑制肺組織促炎因子NF-κB、IL-1β、HO-1、PTGEs、iNOS、TNF-α和COX-2 mRNA的表達(dá)和促進(jìn)抗炎因子HO-1 mRNA的表達(dá)而發(fā)揮保護(hù)作用[19]；β-谷甾醇可調(diào)節(jié)小鼠巨噬細(xì)胞極化并減輕炎癥反應(yīng)，其與阿司匹林合用具有協(xié)同效應(yīng)[20-21]。此外，槲皮素、木樨草素、β-胡蘿卜素也具有抗炎活性[22-23]?？梢?jiàn)馬鞭草-青蒿藥從理論上可以配伍其他藥物應(yīng)用于新型冠狀病毒肺炎的重期與危重期。

PPI網(wǎng)絡(luò)結(jié)果顯示，關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)主要分為炎性介質(zhì)和絲裂原活化蛋白激酶等。其中以炎性介質(zhì)數(shù)量最多。馬鞭草-青蒿藥可能是通過(guò)降低白介素、腫瘤壞死因子等炎性因子的分泌水平，調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的極化，清除自由基等機(jī)制發(fā)揮抗炎作用[24-25]。GO生物過(guò)程富集涉及炎癥應(yīng)答最為關(guān)鍵，此外還涉及氧化還原過(guò)程、蛋白表達(dá)等；其還在細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)發(fā)生蛋白結(jié)合、ATP結(jié)合、酶反應(yīng)等分子反應(yīng)。KEGG分析表明，馬鞭草-青蒿藥作用通路主要與抗炎相關(guān)，如細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體及結(jié)合信號(hào)通路可直接調(diào)控IL-1β、IL-6、IL-10、IFN-γ；HIF-1信號(hào)通路可調(diào)控PTK、ERK、PKC；NF-κB信號(hào)通路可調(diào)控IL-1β、PKCβ發(fā)揮抗炎作用[13-14]。此外，馬鞭草-青蒿藥還涉及抗病毒免疫調(diào)節(jié)通路。

綜上所述，基于目前數(shù)據(jù)庫(kù)中已有的相關(guān)結(jié)果，馬鞭草-青蒿藥對(duì)治療新型冠狀病毒肺炎的有效成分可能是槲皮素、木樨草素、山柰酚、β-谷甾醇和β-胡蘿卜素，這些成分通過(guò)炎癥相關(guān)靶點(diǎn)參與細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體及結(jié)合信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路、NF-κB信號(hào)通路等，發(fā)揮抗病毒、抗炎和免疫調(diào)節(jié)的作用。本研究結(jié)果與現(xiàn)有的COVID-19研究結(jié)果相吻合。但網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的預(yù)測(cè)存在局限性，本研究提出的活性成分、靶點(diǎn)以及通路仍需后期更多的實(shí)驗(yàn)加以驗(yàn)證。