雞、豬組織中甲砜霉素、氟苯尼考、氟苯尼考胺殘留量測定的GC-MS法建立

張麗萍，孟 蕾，張盼盼，吳寧鵬，吳志明*

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院，鄭州 450046；2. 河南省獸藥飼料監(jiān)察所，鄭州450008)

甲砜霉素(Thiamphenicol,TAP)、氟苯尼考(Florfenicol,FF)屬于酰胺醇類藥物，在獸醫(yī)臨床中被廣泛用于治療畜禽副傷寒、黃白痢、敗血癥等疾病[1]。由于養(yǎng)殖業(yè)生產(chǎn)中存在超劑量、超范圍、不遵守休藥期規(guī)定使用獸藥等現(xiàn)象，給生態(tài)環(huán)境、食品安全和公共衛(wèi)生安全帶來了巨大風(fēng)險[2-3]。因此，為規(guī)范養(yǎng)殖業(yè)用藥行為，減少因甲砜霉素、氟苯尼考不規(guī)范使用所帶來的不良影響，我國規(guī)定了甲砜霉素、氟苯尼考在動物性食品中的最大殘留限量，其中氟苯尼考的最大殘留限量以氟苯尼考及其代謝物氟苯尼考胺(Florfenicol amine,FFA)之和計[4]。目前，國內(nèi)外報道的動物組織中酰胺醇類藥物的殘留檢測方法很多，但存在許多局限性，不能滿足當(dāng)前動物性食品中酰胺醇類藥物殘留標(biāo)準(zhǔn)及檢測效率的需要。例如部分方法檢測藥物殘留種類覆蓋不全，缺少對氟苯尼考的重要殘留標(biāo)示物氟苯尼考胺的檢測[5-8]；或者針對的動物組織不全[9-12]，適用范圍有限；現(xiàn)有的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[6，9，12]檢測氟苯尼考胺時，由于氟苯尼考胺極性較強，在C18色譜柱上保留極弱，易受雜質(zhì)干擾，從而影響結(jié)果定量。因此，針對以上方法存在的不足，本研究擬建立普遍適用于雞和豬的肌肉、皮+脂(脂肪)、肝臟、腎臟中甲砜霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺殘留量同時測定的氣相色譜-質(zhì)譜檢測法，以期為全面監(jiān)控雞和豬的各組織中甲砜霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺殘留提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 儀器 氣相色譜-質(zhì)譜儀(TSQ Qunatum，美國Thermo Fisher公司)；分析天平(ES3200，天津德安特公司)；電子分析天平(Y0826，瑞士METTLER TOLEDO公司)；臺式冷凍高速離心機(3-30KS，德國Sigma公司)；氮氣吹干儀 (TTL-DCⅡ，北京同泰聯(lián)科技公司)；渦旋混合器(MS 3 basic，德國IKA公司)；震蕩混合機(VX-Ⅲ，北京踏錦公司)。

1.2 材料、藥品與試劑 甲砜霉素(含量99.7%)、氟苯尼考(含量99.1%)購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，氟苯尼考胺(含量99.8%)購自德國Witega公司，甲砜霉素-D3(含量97.0%)、氟苯尼考-D3(含量98.5%)、氟苯尼考胺-D3(含量98.0%)均購自加拿大TRC公司；衍生試劑：BSTFA∶TMCS(99 ∶1，V∶V)，含量：99%，購自美國Sigma公司；甲苯、正己烷、乙酸乙酯、氨水和氯化鈉，分析純，均購自天津科密歐公司；甲醇、乙腈，色譜純，購自德國Merck公司；Cleanert PEP-2固相萃取柱(200 mg/6 cc)，購自天津博納艾杰爾公司。試驗用水為經(jīng)Milli-Q凈化系統(tǒng)(美國Millipore公司)制備的去離子水。

1.3 色譜條件 色譜柱：HP-5MS(30 mm×0.25 mm，0.25 μm)；載氣：氦氣(純度≥99.999%)；載氣流速：1.0 mL/min；進樣口溫度：220 ℃；柱溫：初始柱溫50 ℃，保持1 min，以30 ℃/min升至280 ℃，保持8 min；進樣方式：無分流進樣；進樣量：1 μL。

1.4 質(zhì)譜條件 接口溫度：280 ℃；離子源：負(fù)化學(xué)源；離子源溫度：150 ℃；反應(yīng)氣：甲烷(純度≥99.99%)；反應(yīng)氣流量：2.0 mL/min；測定方式：選擇離子檢測模式。TAP、FF、FFA及其氘代物的硅烷化衍生物特征離子質(zhì)核比見表1。

表1 TAP、FF、FFA及其氘代物的硅烷化衍生物特征離子質(zhì)核比(m/z)

帶*為定量離子 Quantitative ions are marked with *

1.5 前處理條件 取試料5 g(精確至0.01 g)置于50 mL塑料離心管，加2%氨化乙酸乙酯溶液20 mL，渦旋混勻，渦旋振蕩10 min，8000 r/min離心5 min，取上清液于另一50 mL離心管中。殘渣用2%氨化乙酸乙酯溶液20 mL重復(fù)提取一次，合并乙酸乙酯層。將提取液于50 ℃水浴吹干，向殘渣中加入甲醇0.5 mL，再加入4% NaCl溶液9.5 mL，渦旋混勻。然后加入正己烷15 mL，渦旋混合30 s，8000 r/min離心5 min，棄去正己烷，再加正己烷15 mL重復(fù)脫脂一次，下層水相加入氨水0.5 mL后備用。PEP-2柱依次用甲醇、水各5 mL活化，取備用液全部過柱，依次用水、水-甲醇-氨水(180 ∶19 ∶1,V∶V∶V)各3 mL淋洗后，抽干，用甲醇-氨水(95 ∶5,V∶V)5 mL洗脫，洗脫液于50 ℃水浴氮氣吹干。殘渣于80 ℃下烘干30 min后，加入衍生試劑、乙腈各200 μL，60 ℃衍生30 min，于50 ℃氮吹干，用甲苯0.5 mL溶解殘渣，過0.22 μm有機濾膜后，進氣相色譜-質(zhì)譜儀測定。

1.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備 分別稱取TAP、FF、FFA、TAP-D3、FF-D3、FFA-D3標(biāo)準(zhǔn)品約10 mg(精確至0.01 mg)于10 mL容量瓶中，加乙腈定容并稀釋至刻度，配制成濃度均為1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)和內(nèi)標(biāo)儲備液，置于-20 ℃以下避光冷凍保存。再分別準(zhǔn)確移取適量標(biāo)準(zhǔn)和內(nèi)標(biāo)儲備液，用乙腈稀釋成濃度均為10 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)中間工作液和混合內(nèi)標(biāo)中間工作液。然后準(zhǔn)確量取混合標(biāo)準(zhǔn)中間工作液和混合內(nèi)標(biāo)中間工作液適量，用乙腈稀釋分別配制成TAP、FF、FFA濃度為5、10、50、100、500、1000、5000 μg/L，TAP-D3、FF-D3、FFA-D3濃度均為100 μg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，經(jīng)衍生后，按1.3項和1.4項儀器條件進行測定。以測試藥物和其對應(yīng)的內(nèi)標(biāo)的特征離子質(zhì)量色譜峰面積比為縱坐標(biāo)，測試藥物的濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.7 檢測限與定量限 分別稱取5 g(精確至0.01 g)雞、豬各空白組織，加入已知濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。按1.5項樣品前處理方法處理樣品，再按1.3項和1.4項儀器條件進行測定。依據(jù)信噪比S/N≥3作為檢測限(LOD)，S/N≥10作為定量限(LOQ)。

1.8 精密度與準(zhǔn)確度 采用標(biāo)準(zhǔn)添加法進行加標(biāo)回收實驗。分別在雞、豬各空白組織樣品中添加LOQ、1/2MRL、MRL、2MRL 四個濃度水平的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，添加濃度詳見表2。按1.5項樣品前處理方法處理樣品，再按1.3和1.4項儀器條件進行分析測定。每個濃度進行5個樣品平行試驗，重復(fù)3次。計算平均回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。

2 結(jié)果與分析

2.1 線性范圍 實驗結(jié)果表明，TAP、FF和FFA三種藥物在5～ 5000 μg/L的濃度范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)r均大于0.999。TAP、FF和FFA三種藥物的回歸方程及相關(guān)系數(shù)如表3所示。

2.2 靈敏度 依據(jù)信噪比S/N≥3為檢測限(LOD)，S/N≥10為定量限(LOQ)。確定本方法的LOD為5 μg/kg，LOQ為10 μg/kg。

2.3 精密度與準(zhǔn)確度 結(jié)果顯示，TAP、FF和FFA在雞和豬的肌肉、皮+脂(脂肪)、肝臟和腎臟中的平均回收率在88.1%～106.4%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.5%～10.8%之間。TAP、FF和FFA在雞和豬的各組織中的平均回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別見表4～表5?；旌蠘?biāo)準(zhǔn)溶液、空白雞肝樣品及空白雞肝添加樣品中TAP、FF和FFA及其氘代物的總離子流圖和定量離子質(zhì)量色譜圖分別見圖1～圖3。

表2 雞、豬各空白組織中TAP、FF和FFA的添加濃度值(μg/kg)

表3 回歸方程及相關(guān)系數(shù)

表4 雞肌肉、皮+脂、肝臟、腎臟中TAP、FF和FFA平均回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差

表5 豬肌肉、皮+脂(脂肪)、肝臟、腎臟中TAP、FF和FFA平均回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差

(a) 50 μg/L混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中TAP、FF、FFA及其氘代物的總離子流圖；(a) total ion chromatogram of TAP,FF,FFA and each deuterium substitutes in 50 μg/L mixed standard solution (b) 50 μg/L混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中TAP定量離子質(zhì)量色譜圖； (b) quantitative ion mass chromatogram of TAP in mixed 50 μg/L standard solution (c) 50 μg/L混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中 FF定量離子質(zhì)量色譜圖； (c) quantitative ion mass chromatogram of FF in mixed 50 μg/L standard solution (d) 50 μg/L混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中 FFA定量離子質(zhì)量色譜圖； (d) quantitative ion mass chromatogram of FFA in mixed 50 μg/L standard solution (e) 100 μg/L TAP-D3標(biāo)準(zhǔn)溶液定量離子質(zhì)量色譜圖； (e) quantitative ion mass chromatogram of 100 μg/L TAP-D3 standard solution (f) 100 μg/L FF-D3標(biāo)準(zhǔn)溶液定量離子質(zhì)量色譜圖； (f) quantitative ion mass chromatogram of 100 μg/L FF-D3 standard solution (g) 100 μg/L FFA-D3標(biāo)準(zhǔn)溶液定量離子質(zhì)量色譜圖； (g) quantitative ion mass chromatogram of 100 μg/L FFA-D3 standard solution

(a) 空白雞肝樣品中TAP、FF、FFA及其氘代物總離子流圖； (a) total ion chromatogram of TAP,FF,FFA and each deuterium substitutes in blank chicken liver (b) 空白雞肝樣品中TAP定量離子質(zhì)量色譜圖； (b) quantitativeion mass chromatogram of TAP in blank chicken liver (c) 空白雞肝樣品中FF定量離子質(zhì)量色譜圖； (c) quantitativeion mass chromatogram of FF in blank chicken liver (d) 空白雞肝樣品中FFA定量離子質(zhì)量色譜圖； (d) quantitativeion mass chromatogram of FFA in blank chicken liver (e) 空白雞肝樣品中TAP-D3定量離子質(zhì)量色譜圖； (e) quantitativeion mass chromatogram of TAP-D3in blank chicken liver (f) 空白雞肝樣品中FF-D3定量離子質(zhì)量色譜圖； (f) quantitativeion mass chromatogram of FF-D3 in blank chicken liver (g) 空白雞肝樣品中FFA-D3定量離子質(zhì)量色譜圖； (g) quantitativeion mass chromatogram of FFA-D3 in blank chicken liver

(a) 空白雞肝添加樣品中TAP、FF、FFA及其氘代物總離子流圖； (a) total ion chromatogram of TAP、FF、FFA and each deuterium substitutes in added blank chicken liver (b) 空白雞肝添加樣品中TAP定量離子質(zhì)量色譜圖； (b) quantitativeion mass chromatogram of TAP in added blank chicken liver (c) 空白雞肝添加樣品中 FF定量離子質(zhì)量色譜圖； (c) quantitativeion mass chromatogram of FF in added blank chicken liver (d) 空白雞肝添加樣品中FFA定量離子質(zhì)量色譜圖； (d) quantitativeion mass chromatogram of FFA in added blank chicken liver (e) 空白雞肝添加樣品中TAP-D3定量離子質(zhì)量色譜圖； (e) quantitativeion mass chromatogram of TAP-D3 in added blank chicken liver (f) 空白雞肝添加樣品中FF-D3定量離子質(zhì)量色譜圖； (f) quantitativeion mass chromatogram of FF-D3 in added blank chicken liver (g) 空白雞肝添加樣品中 FFA-D3定量離子質(zhì)量色譜圖； (g) quantitativeion mass chromatogram of FFA-D3 in added blank chicken liver

3 討論與結(jié)論

3.1 提取液的優(yōu)化 為同時提取TAP、FF、FFA三種藥物，大多采用氨水、乙酸乙酯、乙腈作為提取液[11-12]。本實驗分別對乙腈-乙酸乙酯-氨水(25∶4∶1,V∶V∶V)、乙腈-乙酸乙酯-氨水(49∶49∶2,V∶V∶V)、乙酸乙酯-氨水(98∶2,V∶V)三種提取液進行考察。實驗發(fā)現(xiàn)，三種提取液提取效率差別不大，但當(dāng)提取液中含有較大比例的乙腈時，其濃縮效率會大大降低，因此，本研究最終選擇乙酸乙酯-氨水(98∶2,V∶V)作為提取液，不僅毒性較小而且濃縮效率高。

3.2 凈化條件的優(yōu)化 分別比較了C18[7]、MCX[10]和PEP-2柱對TAP、FF、FFA的凈化效果和回收率。實驗發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)FA在C18柱上不保留，MCX柱雖凈化效果最好，但TAP回收率不到70%；PEP-2柱對TAP、FF、FFA三種藥物不僅凈化效果好且目標(biāo)物回收率均在90%左右，因此，本實驗選擇PEP-2柱。同時，通過對不同濃度的洗脫液(2%氨化甲醇、5%氨化甲醇[11]、10%氨化甲醇[10])對目標(biāo)物的洗脫效率進行對比，結(jié)果表明，5%氨化甲醇和10%氨化甲醇洗脫效率均在95%左右，但5%氨化甲醇洗脫吹干耗時更短，故最終選擇5%氨化甲醇作為洗脫液。

3.3 衍生條件優(yōu)化 因BSTFA衍生試劑在水分含量超過1%時會失效[13]，故在衍生前需對樣品進行干燥處理。實驗表明，80 ℃下干燥30 min，目標(biāo)物即可衍生完全。同時實驗對是否加入衍生介質(zhì)[7]以及加入衍生介質(zhì)的種類[8]對衍生效率的影響進行了比較。結(jié)果表明，加入衍生介質(zhì)后可顯著提高衍生效率，而且使用乙腈作為衍生介質(zhì)對FFA色譜峰干擾更少。

本研究建立了普遍適用于雞和豬的肌肉、皮+脂(脂肪)、肝臟和腎臟組織中TAP、FF、FFA多殘留同時測定的氣相色譜-質(zhì)譜法。本方法對TAP、FF、FFA三種藥物在較寬檢測濃度范圍內(nèi)線性良好，而且靈敏度、準(zhǔn)確度和精密度高，在TAP、FF、FFA實際殘留檢測中具有較好的推廣應(yīng)用價值。