多光子吸收、線粒體靶向鋅/銪配合物的設(shè)計(jì)合成

李明昊，李小成，劉丹丹，張 瓊，吳杰穎，田玉鵬

(安徽大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，安徽 合肥 230601)

applications

多光子吸收是一種非線性光學(xué)(NLO)過(guò)程.在這種過(guò)程中，多個(gè)光子被同時(shí)吸收，以達(dá)到激發(fā)態(tài)，然后在一定條件下回落到基態(tài)[1].近20年來(lái)，多光子吸收材料已廣泛應(yīng)用于生物成像、光動(dòng)力學(xué)治療、上轉(zhuǎn)換激光、三維光學(xué)數(shù)據(jù)存儲(chǔ)和光學(xué)極限等領(lǐng)域[2-4].在生物成像應(yīng)用領(lǐng)域，與大多數(shù)常見(jiàn)的單光子熒光探針相比，具有較大斯托克斯位移的多光子熒光探針具有很大的優(yōu)勢(shì)[5]，因?yàn)樵诮t外第二窗口中可以使用1 000～1 700 nm的激發(fā)波長(zhǎng)，這在生物成像中提供了更高的空間分辨率和對(duì)比度，以及較高的光物理穩(wěn)定性和較低的組織損傷[6].

線粒體(mitochondrion)是細(xì)胞的“能量工廠”，它是由兩層膜包裹的細(xì)胞器，是細(xì)胞有氧呼吸的重要場(chǎng)所.線粒體除了為細(xì)胞供能外，還參與細(xì)胞的新陳代謝，擁有調(diào)控細(xì)胞周期和細(xì)胞生長(zhǎng)的能力[7-8].所以通過(guò)對(duì)細(xì)胞線粒體狀態(tài)的檢測(cè)，可以準(zhǔn)確對(duì)機(jī)體進(jìn)行疾病診斷和治療[9-11]，探索高效低毒性的線粒體熒光探針得到了研究者的關(guān)注[12-15].目前研究的線粒體探針主要是小分子熒光探針，并且多是單光子熒光探針，這類(lèi)探針與上述多光子探針的特點(diǎn)相比，存在一定的局限性.因此，開(kāi)發(fā)一種親生物、光穩(wěn)定性好且長(zhǎng)波段激發(fā)的多光子熒光探針尤為必要.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試 劑

N,N-二甲基甲酰胺，N, N-二丁基苯胺，三氯氧磷，2-乙?；拎?，氫氧化鉀，氨水，六水合硝酸鋅，α-噻吩甲?；燃淄?，四氫呋喃，乙腈，二甲基亞砜，以上試劑均為分析純，使用前按標(biāo)準(zhǔn)方法純化.

1.2 儀 器

1H-NMR和13C-NMR分別在Bruker Avance 400 MHz和100 MHz核磁共振光譜儀上記錄；質(zhì)譜數(shù)據(jù)使用Micro-mass GCT-MS記錄(ESI源)；紫外可見(jiàn)吸收光譜使用SPECORD S600分光光度計(jì)測(cè)定；單光子發(fā)射熒光光譜(SPEF)使用日立F-7000熒光分光光度計(jì)進(jìn)行；雙光子熒光光譜(2PEF)使用飛秒激光脈沖鈦寶石系統(tǒng)測(cè)定 (Chameleon Ultra II, 680～1 080 nm, 80 MHz, 140 fs) (熒光素作為參比溶液)；三光子吸收光譜(3PA)使用飛秒激光脈沖鈦寶石光學(xué)參量振蕩器系統(tǒng)測(cè)定(Chameleon Compact OPO, 1 100～1 600 nm, 140 fs)；Hela細(xì)胞的激光共聚焦顯微成像使用Zeiss LSM 710 META正置共聚焦激光掃描顯微鏡獲得；圖像數(shù)據(jù)的采集和處理使用Zeiss LSM Image Browser，Zeiss LSM Image Export和Image J.

1.3 MTT

細(xì)胞毒性運(yùn)用MTT的方法進(jìn)行檢測(cè).將人宮頸癌細(xì)胞(HeLa)種于96孔板中，每個(gè)孔種5×103個(gè)細(xì)胞，待細(xì)胞貼壁后，設(shè)置2個(gè)一樣的實(shí)驗(yàn)組.使用DMSO溶解配合物配置成濃度為1×10-3mol·L-1的母液，測(cè)試時(shí)用DMEM∶DMSO=99∶1比例稀釋成1×10-5mol·L-1,分別加入5，10，15，20 μL的體積梯度，每組設(shè)置6個(gè)平行，每孔加培養(yǎng)基至100 μL，空白組中加入純培養(yǎng)基做對(duì)照，加樣后置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 18 h 后，將其中一組置于紫外燈下進(jìn)行光照，30 s一次，共照5 min，再置于培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4 h，然后用 MTT 比色法進(jìn)行檢測(cè).

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)

將人宮頸癌細(xì)胞(HeLa)放置于含有10%的胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng).當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)增殖至大約鋪滿(mǎn)培養(yǎng)瓶底部時(shí)，去除老舊的培養(yǎng)基，加入2 mL已經(jīng)預(yù)熱至37 ℃的PBS溶液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行清洗，加入1 mL 0.25% 胰蛋白酶溶液浸潤(rùn)細(xì)胞，離心去除胰酶，置于37 ℃下消化50 s，置于光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)變化..最后加入2 mL DMEM 培養(yǎng)液，輕輕吹打細(xì)胞使得其落壁形成單細(xì)胞懸液，分成多份并加入 DMEM 培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞.

1.5 細(xì)胞顯影

將HeLa細(xì)胞以每孔5×104個(gè)細(xì)胞的密度接種在培養(yǎng)皿中，24 h后加入待測(cè)化合物，化合物最終濃度為1×10-5mol·L-1.在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中共培養(yǎng)6 h. 隨后吸除培養(yǎng)基溶液后用PBS洗滌3遍，用共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞顯影效果.

1.6 化合物的合成步驟及表征

化合物合成路線如圖1 所示.

圖1 化合物的合成路線

具體合成步驟如下：

N,N-二丁胺基苯甲醛的合成：在100 mL圓底燒瓶中加入二甲基甲酰胺7.30 g (2 mmol)，攪拌，溶解后置于冰水浴中，在攪拌下用恒壓滴液漏斗緩慢滴加三氯氧磷11 mL (1.5 mmol)，形成凍鹽.用氯仿溶解N, N-二丁基苯胺10.30 g (1 mmol)，再滴加到上述凍鹽中，待滴加完畢，轉(zhuǎn)移至油浴，回流4 h.反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液倒入冰水中，先用氫氧化鉀溶液調(diào)溶液的pH，使溶液pH在7左右.二氯甲烷萃取多次，蒸干溶劑.將粗產(chǎn)物過(guò)硅膠劑柱層析，用石油醚做展開(kāi)劑淋洗，第一組分即為所需產(chǎn)物，產(chǎn)物呈淺黃色油狀.MS (ESI-MS): calc: 233.36, found: 233.12 [M].

L1的合成：稱(chēng)取 N,N-二丁胺基苯甲醛2.30 g (1 mmol)溶于100 mL的乙醇中, 攪拌下分批加入2-乙?；拎?.10 g (2.5 mmol)、氫氧化鉀2.30 g( 4 mmol), 常溫下攪拌30 min，分批加入40 mL氨水，攪拌10 min，然后升溫至78 ℃, 反應(yīng)6 h，冷卻、過(guò)濾并用乙醇重結(jié)晶得亮黃色固體3.00 g，產(chǎn)率68%.1H-NMR (400 MHz, d6-acetone, ppm) δ 8.76 (dd,J=62.4, 45.6 Hz, 4H), 8.08-7.90 (m, 2H), 7.44 (t,J=25.5 Hz, 4H), 7.27 (t,J=16.5 Hz, 1H), 7.17—6.94 (m, 1H), 6.69 (t,J=19.6 Hz, 2H), 3.47—3.23 (m, 4H), 1.58 (t,J=18.5 Hz, 4H), 1.38 (dt,J=27.3, 13.6 Hz, 4H), 1.13—0.80 (m, 6H).13C-NMR (100 MHz, d6-acetone, ppm)δ154.19, 151.80, 148.26, 139.25, 128.79, 124.05, 119.73, 111.53, 53.49, 30.07, 21.77, 13.79. MS (ESI-MS): calc: 436.60, found: 437.27 [M]+H+.

ZnL12(NO3)2的合成: 稱(chēng)取配體L1 0.22 g(2 mmol)和六水合硝酸鋅0.082 g (1.1 mmol)溶于甲醇溶液中，加熱回流3 h，停止反應(yīng)，冷卻至室溫，逐漸有紅色粉末析出.甲醇重結(jié)晶，得紅色固體0.34 g，產(chǎn)率64 %.1H-NMR (400 MHz, d6-acetone, ppm) δ 8.72 (dd,J=32.0, 24.4 Hz, 12H), 8.03-7.88 (m, 4H), 7.82 (d,J=8.3 Hz, 4H), 7.42 (d,J=25.6 Hz, 4H), 6.89 (d,J=8.4 Hz, 4H), 3.43 (t,J=7.4 Hz, 8H), 1.75-1.59 (m, 8H), 1.42 (dd,J=14.7, 7.3 Hz, 8H), 1.08—0.88 (m, 12H).13C-NMR (100 MHz, d6-acetone, ppm)157.21, 151.51, 149.80, 144.90, 136.76, 130.81, 128.55, 125.18, 124.05, 118.47, 112.48, 110.00, 53.72, 30.05, 20.15, 13.56. MS (ESI-MS): calc: 468.23, found: 468.22 [M]+.

ZnL12Eu(TTA)42的合成: 稱(chēng)取配體L1 0.22 g (2 mmol ) 加熱溶于10 mL甲醇中，然后向其加入溶有六水合硝酸鋅0.082 g (1.1 mmol)的甲醇溶液30 mL，加熱回流約3 h，然后將溶有HEu(TTA)4配合物的甲醇溶液滴加上述溶液中，回流3 h，蒸出甲醇，冷卻，得到黃色固體0.81 g，產(chǎn)率53%.ESI-MS m/z in positive ion mode: 468.23, found: 468.22[M]+.

2 結(jié)果與討論

2.1 吸收光譜和單光子熒光性質(zhì)

化合物(L1, ZnL12(NO3)2, ZnL12[Eu(TTA)4]2)在DMSO中的紫外-可見(jiàn)吸收光譜和熒光發(fā)射光譜如圖2所示.配合物在DMSO中的光譜學(xué)數(shù)據(jù)列于表1.

圖2 化合物(L1, ZnL12(NO3)2, ZnL12[Eu(TTA)4]2)在DMSO中的紫外-可見(jiàn)吸收光譜(a)和熒光發(fā)射光譜(b)(化合物濃度：1.0×10-5 mol·L-1)

表1 配合物在DMSO中的光譜學(xué)數(shù)據(jù)

量子產(chǎn)率(配合物濃度：1.0×10-6mol·L-1).

由圖2和表1可知，L1、ZnL12(NO3)2和ZnL12[Eu(TTA)4]2的紫外-可見(jiàn)吸收光譜均位于300～520 nm范圍內(nèi)，L1在350 nm附近的吸收峰可歸屬于整個(gè)分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移(ICT)；ZnL12(NO3)2的吸收峰位置在443 nm處，可歸屬于金屬到配體的電荷轉(zhuǎn)移(MLCT)；ZnL12[Eu(TTA)4]2不僅在340 nm周?chē)憩F(xiàn)出H[Eu(TTA)4]的吸收峰，在420 nm 左右表現(xiàn)出金屬到配體的電荷轉(zhuǎn)移(MLCT)的吸收峰，說(shuō)明[Eu(TTA)4]-影響了Zn(II)到三聯(lián)吡啶配體的電荷轉(zhuǎn)移[16].

2.2 非線性光學(xué)性質(zhì)

為證明ZnL12(NO3)2和ZnL12[Eu(TTA)4]2的多光子吸收效應(yīng)，分別用熒光對(duì)比法和Z-掃描方法測(cè)試其多光子吸收性質(zhì)，并計(jì)算配合物的多光子吸收截面.

2.2.1 雙光子吸收性質(zhì)

配合物(ZnL12(NO3)2, ZnL12[Eu(TTA)4]2)的雙光子熒光光譜如圖3所示.

圖3 配合物(ZnL12(NO3)2, ZnL12[Eu(TTA)4]2)在700～930 nm波長(zhǎng)下的雙光子熒光光譜(配合物濃度：1.0 × 10-3 mol·L-1)

如圖3所示，ZnL12(NO3)2在700～930 nm激發(fā)波長(zhǎng)下的雙光子熒光發(fā)射峰位置為578 nm，同單光子熒光發(fā)射峰(557 nm)相比發(fā)生了約20 nm紅移，這是由于高濃度分子運(yùn)動(dòng)造成的能量損失所致.而ZnL12[Eu(TTA)4]2的雙光子發(fā)射峰位置相對(duì)于單光子熒光發(fā)射峰發(fā)生了藍(lán)移，可能由于長(zhǎng)波長(zhǎng)激發(fā)下沒(méi)有激發(fā)出Eu的特征發(fā)射峰，或者是Eu的發(fā)射峰較弱，被三聯(lián)吡啶合鋅配離子的發(fā)射峰所覆蓋.通過(guò)熒光對(duì)比法計(jì)算出其最大吸收截面分別為161 GM和388 GM，如圖4所示，數(shù)據(jù)列于表2中.由于[Eu(TTA)4]-陰離子影響金屬鋅到三聯(lián)吡啶環(huán)的電荷轉(zhuǎn)移，非輻射躍遷降低，雙光子吸收截面增大.

圖4 配合物(ZnL12(NO3)2, ZnL12[Eu(TTA)4]2)在DMSO溶液中，700～930 nm激發(fā)波長(zhǎng)下的雙光子吸收截面(配合物濃度：1.0×10-3 mol·L-1)

2.2.2 三光子吸收性質(zhì)

為了深入探究ZnL12(NO3)2和ZnL12[Eu(TTA)4]2的三光子吸收性能，在激發(fā)波長(zhǎng)為1 340 nm的條件下通過(guò)開(kāi)孔Z-掃描技術(shù)測(cè)量化合物的三光子吸收性質(zhì),如圖5所示.利用Z-掃描測(cè)試下的三光子截面計(jì)算公式[18]

其中：I0是光功率密度，I是入射光強(qiáng)，L是樣品池厚度，γ是三光子吸收系數(shù)，d0是樣品濃度，λ是波長(zhǎng)，h是普朗克常數(shù)(6.626×10-34J·s)，NA是阿伏伽德羅常數(shù)(6.022×1023mol-1).計(jì)算得到ZnL12(NO3)2和ZnL12[Eu(TTA)4]2的三光子吸收截面的值分別為4.99×10-82cm6·s2·photon-2和8.11×10-82cm6·s2·photon-2，三光子吸收系數(shù)分別為1.44×10-28cm3·W-2和2.60×10-28cm3·W-2,詳細(xì)數(shù)據(jù)列于表2.這些結(jié)果表明ZnL12(NO3)2和ZnL12[Eu(TTA)4]2配合物在近紅外區(qū)都具有良好的雙光子/三光子吸收性質(zhì)，為它們?cè)诙喙庾由锾结樂(lè)矫娴难芯康於嘶A(chǔ).

圖5 配合物(ZnL12(NO3)2, ZnL12[Eu(TTA)4]2)在DMSO溶液中，1 340 nm激發(fā)波長(zhǎng)下的開(kāi)孔Z-掃描(配合物濃度：1.0×10-3 mol·L-1)

表2 配合物在DMSO溶液中的多光子吸收性質(zhì)數(shù)據(jù)

三光子有效吸收截面，配合物濃度為1.0×10-3mol·L-1.

2.3 生物學(xué)應(yīng)用

基于以上對(duì)ZnL12(NO3)2和ZnL12[Eu(TTA)4]2光物理性質(zhì)的研究，它們?cè)诮t外區(qū)有較大的雙光子、三光子吸收截面，筆者進(jìn)一步探索它們?cè)谏飳W(xué)上的應(yīng)用.在探究生物學(xué)測(cè)試前，用MTT比色法對(duì)配合物的細(xì)胞毒性進(jìn)行了檢測(cè)，如圖6所示，當(dāng)加入配合物的體積達(dá)到20 μL時(shí)，Hela細(xì)胞存活率達(dá)到84%，結(jié)果表明配合物的毒性很低，有利于共聚焦生物顯影.

圖6 配合物(ZnL12(NO3)2, ZnL12[Eu(TTA)4]2)在 Hela 細(xì)胞中的生物毒性(溶劑DMEM∶DMSO=99∶1，配合物濃度為1×10-5 mol·L-1)

為了觀察配合物在細(xì)胞中的分布情況，取配合物溶液10 μL加入Hela細(xì)胞培養(yǎng)皿作用30 min后，進(jìn)行雙光子共聚焦顯微成像.如圖7所示，配合物穿過(guò)細(xì)胞膜，著色絲狀線粒體，并在線粒體區(qū)域發(fā)出很強(qiáng)的熒光.為了進(jìn)一步確定其靶向性，用Mito trackerTM(商業(yè)染料，特異性識(shí)別線粒體)進(jìn)行了共定位實(shí)驗(yàn).共定位實(shí)驗(yàn)顯示，配合物ZnL12(NO3)2和ZnL12[Eu(TTA)4]2的細(xì)胞靶向與Mito tracker高度重合，這可能是因?yàn)榕浜衔锏年?yáng)離子部分與負(fù)電位的線粒體相結(jié)合.因此ZnL12(NO3)2和ZnL12[Eu(TTA)4]2可作為一種線粒體雙光子熒光探針.

3 結(jié)束語(yǔ)

筆者合成了ZnL12(NO3)2和ZnL12[Eu(TTA)4]2，系統(tǒng)研究了它們的光學(xué)性質(zhì)，闡明陰離子對(duì)光學(xué)性質(zhì)的影響.利用熒光對(duì)比法測(cè)試了它們的雙光子吸收性質(zhì)，Z-掃描技術(shù)測(cè)試了它們的三光子吸收性質(zhì)，發(fā)現(xiàn)它們?cè)诮t外區(qū)有較大的多光子吸收截面.生物學(xué)測(cè)試表明，它們都具有低毒性和良好的生物相容性，在較短時(shí)間內(nèi)進(jìn)入細(xì)胞靶向絲狀線粒體，發(fā)出很強(qiáng)的熒光，可用作線粒體的雙光子熒光探針.該文的研究結(jié)果為細(xì)胞靶向的多光子熒光探針合理設(shè)計(jì)提供了新思路.