高效解磷菌的篩選及應(yīng)用研究

宋志遠(yuǎn) 聶波

【摘?? 要】 土壤中有效磷的缺乏已成為限制農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的重要因素之一，解磷菌可以將土壤中的無效磷轉(zhuǎn)化為植物可吸收利用的有效磷，對提高農(nóng)作物的產(chǎn)量至關(guān)重要。本文對高效解磷菌的篩選及應(yīng)用進(jìn)行了探討研究，希望能為業(yè)界同行提供參考。

【關(guān)鍵詞】 解磷菌;有效磷;篩選

中圖分類號：Q93?????????????? 文獻(xiàn)識別碼：A?????????????? 文章編號：2096-1073（2020）11-0056-57

[Abstract] The lack of available phosphorus in soil has become one of the important factors limiting agricultural production. Phosphorus release bacteria can convert ineffective phosphorus in soil into available phosphorus that can be absorbed and utilized by plants， which is very important to increase crop yield. In this paper， the screening and application of high efficiency phosphorous bacteria were studied， hoping to provide reference for industry peers.

[Key words] Phosphate-resolving bacteria; available phosphorus; screening

1? 引言

中國的磷礦資源儲量豐富，總量為167.86億噸，但可開發(fā)利用的儲量卻很小，僅占總儲量的1/8左右。中國70%的磷礦開采都用于生產(chǎn)含磷肥料，開發(fā)利用的強度逐年增加。另外，資源的不合理使用加速了國內(nèi)磷礦石資源的枯竭。長期以來，由于化學(xué)肥料的不合理使用，帶來了一系列的土壤問題，導(dǎo)致磷的減少，可以逐年直接在土壤中使用。在中國北方，鈣質(zhì)土壤的總磷含量較高，而在中國南方酸性土壤中的總磷和有效磷含量非常低。大部分磷處于固定狀態(tài)，難以滿足作物生長發(fā)育的需要。微生物是土壤生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分。微生物的種類和數(shù)量對土壤磷的轉(zhuǎn)化和有效性影響很大，其中解磷細(xì)菌的應(yīng)用可以提高不溶磷的利用率，提高解磷效率[1]。

當(dāng)前國內(nèi)外生物有機肥主要有家禽糞便以及污水污泥構(gòu)成。隨著人們對于肉質(zhì)產(chǎn)品的需求量增大，畜牧業(yè)在進(jìn)行養(yǎng)殖的過程中通常會使用含有抗生素與激素的飼料，從而達(dá)到加快動物生長速度的目的。但是由于飼料中含有的重金屬等會隨著動物的排泄排出，將其作為有機肥會導(dǎo)致環(huán)境受到嚴(yán)重破壞。因此，尋求綠色環(huán)保的有機肥料是當(dāng)前農(nóng)業(yè)發(fā)展過程中急需解決的問題之一。中藥渣作為一種重要的有機肥肥源具有價格實惠、產(chǎn)量大、分布廣的優(yōu)點，因此在我國得到了廣泛的應(yīng)用。解磷菌作為藥渣中關(guān)鍵性的微生物種類，能夠?qū)㈦y溶性磷分解為可溶性磷，從而保證作物能夠很好的吸收磷元素。因此，提取出具有高效分解不溶磷能力的解磷菌對我國藥渣利用率的提高具有重要意義。

2? 材料

2.1? 儀器

VD.650桌上式潔凈工作臺購自蘇州凈化設(shè)備有限公司;YxQ-sG46-280sA手提式壓力蒸汽滅菌器購自上海博迅實業(yè)有限公司;THz-103B恒溫培養(yǎng)搖床購自上海一恒科學(xué)儀器有限公司;UV-2100紫外可見分光光度計購自上海尤尼柯儀器有限公司;AA-7000原子吸收分光光度計購自日本島津公司;varioELcube元素分析儀購自德國Elementar公司;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀購自德國IKA公司;FD-1c-50冷凍干燥機購自北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司;CR22冷凍離心機購自日本Hitachi公司。

2.2? 原料

江西某中藥廠室外堆放3年的藥渣。

2.3? 試劑

葡萄糖、蔗糖、H2SO4、K2HPO4、K2SO4、NaCl、CaCO3、MgSO4·7H2O、NaH2PO4、FeCl3·6H2O、（NH4）2SO4、KCl、FeSO4·7H2O、MnSO4.H2O、Ca3（PO4）2、無水乙醇等均為分析純;抗壞血酸、酒石酸銻氫磷、鉬酸銨、硼酸、甲基紅等購自上海麥克林生化科技有限公司;瓊脂粉購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司;磷長石粉購自廣州翔博生物科技有限公司;溴百里香酚藍(lán)購自天津市天新精細(xì)化工開發(fā)中心;溴甲酚綠購自上海展云化工有限公司。利用鉬藍(lán)比色法檢測發(fā)酵液中可溶性磷含量。

2.4? 培養(yǎng)基的配制

2.4.1? Ashby無磷培養(yǎng)基??? 在450mL ddH2O中依次加入0.1g K2HPO4、2.5gCaCO3、0.5g CaSO4.2H2O、0.1g NaCl、0.1g MgSO4.7H2O、5g甘露醇，添加ddH2O使總體積達(dá)到500mL，將培養(yǎng)基放置在磁力加熱攪拌器上充分混勻，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH為7.0，放入高壓滅菌鍋中12l℃ 20min滅菌后取出待用（固體培養(yǎng)基中需加入10g瓊脂糖后再滅菌）。

2.4.2蒙金娜培養(yǎng)基（無機磷培養(yǎng)基）：在450mL ddH2O中依次加入5g葡萄糖、12.5g Ca3（P04）2、0.25g （NH4）2SO4、0.15g MgSO4.7H2O、0.15g NaCl、0.15g KCl、0.015g FeSO4以及0.015g MnSO4.H2O，添加ddH2O使總體積達(dá)到500mL，將培養(yǎng)基放置在磁力加熱攪拌器上充分混勻，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH為7.0，放入高壓滅菌鍋中12l℃ 20min滅菌后取出待用（固體培養(yǎng)基中需加入10g瓊脂糖后再滅菌）。

2.4.3? 有機磷培養(yǎng)基??? 在450mL ddH2O中依次加入5g葡萄糖、0.25g （NH4）2SO4、0.15g NaCl、0.15g KCl、0.15g MgSO4.7H2O、0.015g FeSO4.7H2O、0.015g MnSO4.H2O，添加ddH2O使總體積達(dá)到500mL，將培養(yǎng)基放置在磁力加熱攪拌器上充分混勻，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH為7.0，放入高壓滅菌鍋中12l℃ 20min滅菌后取出待用，當(dāng)溫度降至60℃時，在培養(yǎng)基中加入5mL蛋黃液（生理鹽水與蛋黃液等體積混合配制）（固體培養(yǎng)基中需加入10g瓊脂糖后再滅菌）。

2.4.4? 解磷培養(yǎng)基??? 在450mL ddH2O中依次加入0.0025g FeCl3、0.25g MgSO4.7H2O、0.05g CaCO3、0.25g蔗糖、0.05g溴百里香酚藍(lán)以及使用ddH2O清洗5次后的0.5g磷長石粉，添加ddH2O使總體積達(dá)到500mL，將培養(yǎng)基放置在磁力加熱攪拌器上充分混勻，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH為7.0，放入高壓滅菌鍋中12l℃ 20min滅菌后取出待用（固體培養(yǎng)基中需加入10g瓊脂糖后再滅菌）。

3? 方法

3.1? 解磷菌篩選

3.1.1? 分離解磷菌??? 在20mL的ddH2O水中加入10g藥渣，放置于搖床中混合5min。取出混勻的液體后，使用移液槍分別將混合液稀釋為1×10-1、1×10-6，從每個梯度的混合液分別中吸取200uL液體至Ashby無磷固體培養(yǎng)基中，用滅過菌的涂布棒將培養(yǎng)基上的混合液涂抹均勻，晾干后于28℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)2天。從生長好的Ashby無磷固體培養(yǎng)基中挑選長勢良好的單菌落，通過平板劃線法對選取的單菌落進(jìn)行分離純化，將最終得到的單菌株移至斜面，放入4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

3.1.2? 固磷能力測定??? 將3.1.1中得到的解磷菌使用滅菌后的接種環(huán)移至Ashby無磷固體培養(yǎng)基中，放置在28℃培養(yǎng)箱中復(fù)蘇3天。從培養(yǎng)基上選取長勢良好的單菌落移至100mL無磷液體培養(yǎng)基中，放置于28℃搖床中以180rpm生長3天得到種子液。將生長好的菌液于離心機中6000rpm離心10min，將得到的菌液沉淀取一部分干燥至粉末后稱重，并以中藥菌體.1的方式對其進(jìn)行命名。將剩余菌液沉淀分為3份，分別移至250mL532的Ashby無磷液體培養(yǎng)基中，放入28℃搖床中180rpm生長7天。取出培養(yǎng)好的菌液，放入離心機中離心處理，上清液旋蒸后冷凍干燥獲得粉末，對獲得的粉末稱重后以中藥發(fā)酵液-1的方式命名;離心得到的沉淀放入50℃烘箱中干燥處理后進(jìn)行稱重，得到的粉末以中藥菌體-2的方式命名。利用元素分析儀對得到的三份粉末中磷的比例進(jìn)行檢測。

3.2? 解磷菌篩選二

3.2.1? 解磷菌分離??? 菌懸液按照3.1.1中的方式獲得，并稀釋為1x10-1、1×10-6，從每個梯度的混合液分別中吸取200uL液體至有機磷固體培養(yǎng)基中，用滅過菌的涂布棒將培養(yǎng)基上的混合液涂抹均勻，晾干后于30℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)2天。取出培養(yǎng)基后，選擇菌體周圍有溶磷圈的單菌落，用滅菌后的接種環(huán)移至蒙金娜固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，隨后選擇菌體周圍有溶磷圈的單菌落進(jìn)行劃線分離，最終選取長勢良好的單菌落移至菌體保藏培養(yǎng)基上，置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

3.2.2? 解磷能力測定??? 將3.2.1中得到的解磷菌用滅菌后的接種環(huán)移至活化培養(yǎng)基上，隨后從生長好的培養(yǎng)基上各選擇一環(huán)解磷菌移至液體種子培養(yǎng)基，放入搖床中培養(yǎng)。分別吸取2mL生長好的菌懸液移至蒙金娜液體培養(yǎng)基中，在液體培養(yǎng)基中加入2mL ddH2O當(dāng)作對照組，放入30℃搖床中180rpm生長7天。利用鉬藍(lán)比色法對溶性磷的含量進(jìn)行檢測。依次量取2mL各個菌懸液移至解磷培養(yǎng)基中，在液體培養(yǎng)基中加入2mL ddH2O當(dāng)作對照組，放入30℃搖床中180rpm生長7天，利用分光光度法對菌體的解磷能力進(jìn)行測定。

4? 高效解磷菌的應(yīng)用

4.1? 基肥增施20kg/畝高效解磷菌肥的施肥方式在確保產(chǎn)量、實現(xiàn)增產(chǎn)的方面具有優(yōu)秀的表現(xiàn)

基肥增施15kg/畝高效解磷菌、基肥減量20%，增施高效解磷菌肥40kg/畝、基肥增施20kg/畝高效解磷菌的施肥方式三種施肥方式相對于常規(guī)施肥分別實現(xiàn)了畝增產(chǎn)32.4kg/畝、38kg/畝、102.1kg/畝，增產(chǎn)率分別為4.6%、5.5%、14.6%。由經(jīng)濟效益而言，采用基肥減量20%，增施高效解磷菌肥40kg/畝的施肥方式，可以有效降低肥料投入成本，提高農(nóng)民收入。

4.2? 藥渣中含有多種養(yǎng)分物質(zhì)，包括纖維、多糖、蛋白質(zhì)以及微量元素等

由于藥渣的透氣性良好，因此可用于園林植物與農(nóng)作物生長的堆肥原料。在中成藥的生產(chǎn)、中藥材加工以及原料藥的生產(chǎn)過程中均會產(chǎn)生藥渣，其中在中成藥的制造過程中藥渣的產(chǎn)量最高，能夠達(dá)到總藥渣量的七成。當(dāng)前我國制藥企業(yè)主要通過焚燒、填埋以及堆放的形式進(jìn)行藥渣的處置。這些處置方式不但會浪費大量的藥渣資源，而且會對生態(tài)環(huán)境造成嚴(yán)重的破壞，因此如何科學(xué)合理的提高藥渣利用率是當(dāng)前制藥企業(yè)的核心工作之一。

4.3? 在油菜的盆栽試驗中，郝靜和其他研究表明，解決磷酸鹽問題的不同細(xì)菌可以使農(nóng)作物的地上鮮重增加7.0%至44.4%

在邢方芳等人的研究中，應(yīng)用分解磷酸鹽的細(xì)菌后，蝴蝶蘭的鮮重增加了32.94%。何國強等人的研究表明，接種可分解磷酸鹽的復(fù)合細(xì)菌可以提高小麥根際土壤的細(xì)菌多樣性指數(shù)和豐富度指數(shù)。方華洲等的研究表明，用復(fù)合殺真菌劑處理水稻土可使土壤有效磷含量提高32.17%。何國強等的研究表明，分解磷酸鹽的復(fù)合細(xì)菌可以使小麥的最大產(chǎn)量提高14.49%。相反，在本研究中施用復(fù)合接種物后，油菜鮮重增加了57.77%，顯示出非常好的施用效果。

參考文獻(xiàn)：

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（編輯：赫亮）