利用SSR標(biāo)記分析江蘇水稻聯(lián)合體試驗品系遺傳多樣性

吳錦泉 張小強(qiáng) 胡忠磊

摘 要：選育和推廣優(yōu)良水稻品種對于保障我國糧食安全具有深遠(yuǎn)影響，研究水稻種質(zhì)資源遺傳多樣性對水稻的選育和利用具有重要的指導(dǎo)價值。本研究采用“江蘇省水稻品系真實性SSR標(biāo)記方法”中60個對江蘇水稻品種具有良好特異性的SSR分子標(biāo)記，對2019年江蘇省水稻聯(lián)合體試驗中共計256個品系進(jìn)行了遺傳多樣性分析。結(jié)果表明，在256個試驗品系中共檢測到271個等位基因，每個標(biāo)記的多態(tài)性片段的均值為4.52個，其變異范圍在1～8，PIC值為0.41;256個品系遺傳相似系數(shù)在0.32～1，平均相似系數(shù)為0.59，其中40.4%的遺傳相似系數(shù)>0.6，說明這些供試品系親緣關(guān)系較近。研究結(jié)果將為水稻品種遺傳多樣性的鑒定以及水稻育種的遺傳改良提供科學(xué)依據(jù)。

關(guān)鍵詞：水稻品系;遺傳多樣性;SSR標(biāo)記;聚類分析

中圖分類號：S-3 ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

DOI：10.19754/j.nyyjs.20201030009

農(nóng)作物種質(zhì)資源是保障農(nóng)業(yè)生產(chǎn)穩(wěn)定的基礎(chǔ)，也是人類未來生存和發(fā)展的先決條件，其在農(nóng)業(yè)科學(xué)和生命科學(xué)研究領(lǐng)域中占有極為重要的地位[1]。在生物體的長期進(jìn)化中，基因突變和重組導(dǎo)致了自然有性生殖的2個個體后代產(chǎn)生與親本不相同的基因型，如何鑒別后代在外觀與親本類似的情況下是否產(chǎn)生這種遺傳變異是值得研究的問題。物種的種質(zhì)資源遺傳多樣性可以用來發(fā)現(xiàn)和用于改良現(xiàn)有品種以及創(chuàng)新新種質(zhì)。水稻、小麥和玉米是中國3種主要糧食作物，我國超過1/2的人口以大米為主食，江蘇省的氣候、地理環(huán)境適宜水稻生長，也是我國水稻主要分布地區(qū)之一，江蘇省水稻品種遺傳多樣性的調(diào)查和了解對于優(yōu)質(zhì)水稻品種選育具有積極作用。

對植物品種特異性、一致性和穩(wěn)定性測試是保護(hù)新品種的技術(shù)基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)[2，3]，該測試主要在于田間種植鑒定，根據(jù)品種田間表型差異來判定新品種是否有別于親代[4]，但周期長、容易受到環(huán)境影響、工作量大等。隨著新品種數(shù)量的增多，該測試技術(shù)已經(jīng)難以在實踐中進(jìn)行，鑒定結(jié)果嚴(yán)重滯后，甚至?xí)?zhí)法效率產(chǎn)生嚴(yán)重影響[5]。而DNA指紋圖譜技術(shù)的出現(xiàn)解決了這一難題，指紋圖譜技術(shù)是基于DNA分子標(biāo)記鑒別生物個體差異的DNA電泳圖譜，主要包括基于AFLP、RFLP、RAPD、SSR、SNP等標(biāo)記的指紋技術(shù)[6]，具有多態(tài)性高、特異性強(qiáng)并且能夠穩(wěn)定遺傳等特點，其中SSR和SNP標(biāo)記最為常用。SSR標(biāo)記是由Tautz等[7]提出，技術(shù)優(yōu)點有操作簡單、重復(fù)性好、共顯性[8];在短時期內(nèi)，農(nóng)作物進(jìn)行品種鑒定的主要方法就是采用SSR標(biāo)記法。研究結(jié)果可以了解DNA水平上種質(zhì)之間的遺傳關(guān)系并表現(xiàn)出基因型差異。將DNA指紋檢測技術(shù)應(yīng)用于作物DUS測試實踐，有助于規(guī)范種業(yè)市場，對保護(hù)我國豐富的種質(zhì)和基因資源、保障我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)及糧食安全具有重要意義。

遺傳多樣性研究是種質(zhì)資源工作的基礎(chǔ)，也是遺傳演化研究和育種的理論基礎(chǔ)，對于發(fā)掘控制重要農(nóng)藝性狀相關(guān)基因以及育種實踐均具有較強(qiáng)的參考價值和指導(dǎo)意義[9]。本研究采用60個對江蘇水稻品種具有良好特異性的SSR分子標(biāo)記，分析了2019年江蘇省水稻聯(lián)合體供試的269份品系的遺傳多樣性。研究結(jié)果對江蘇省水稻參試品系之間的遺傳多樣性得以更深入地了解，為以后水稻育種中的親本材料的選配提供參考依據(jù)。

1 試驗材料和方法

1.1 材料

試驗材料是2019年江蘇省水稻聯(lián)合體試驗參試品系，來自11個聯(lián)合體19組試驗，根據(jù)試驗生態(tài)類型劃分，可分為以下試驗組：早熟晚粳組49份，中熟中粳組103份，遲熟中粳組117份，共計269份。其中，10個品系區(qū)試生試同步（同名品系2個樣品），3個品系有食味品嘗樣品（同名品系參試）。分子標(biāo)記用《江蘇水稻品種真實性鑒定SSR標(biāo)記法》中對江蘇水稻品種特異性較好的60個SSR標(biāo)記。

1.2 方法

1.2.1 秧苗栽插管理

試驗在揚(yáng)州大學(xué)實驗農(nóng)牧場進(jìn)行，2019年5月5日播種，1個月后將培育好的水稻秧苗移栽至大田，單株栽插，每個品系栽插4行，每行12株，共48株。秧苗成長期間田間正常進(jìn)行病蟲害的防治及肥水管理。

1.2.2 DNA的提取

水稻秧苗移栽大田14d后，用CTAB法提取葉片基因組DNA。剪取各品種隨機(jī)種植的幼嫩葉片提取總DNA。

1.2.3 PCR擴(kuò)增與聚丙烯酰胺凝膠電泳

PCR是用于放大擴(kuò)增特定DNA片段的分子技術(shù)，PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為DNA（20ng·μL-1）2μL，10×PCRbuffer2μL，25mmol·L-1MgCl22μL，10μmol·L-1前引物0.4μL，10μmol·L-1后引0.4μL，10mmol·L-1dNTPs0.4μL，5U·μL-1Taq酶0.2μL。PCR擴(kuò)增程序為94℃預(yù)變性5min，94℃變性30～45s，50～60℃退火45s，72℃延伸30s，72℃延伸8min，10℃保溫30min，35個循環(huán)。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物采用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行分離檢測（150V、200A），電泳結(jié)束后采用硝酸銀染色7min，蒸餾水漂洗2次，顯影液顯色至帶型清晰，用雙蒸水沖洗2遍，瀝干，封膠，拍攝成像，最后讀膠并進(jìn)行賦值。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

按照“0、1”賦值法[10]將膠進(jìn)行賦值，供試品系的標(biāo)記對比標(biāo)準(zhǔn)帶型在相同位置上有帶的記為“1”，無帶的記為“0”，并做好數(shù)據(jù)記錄工作，計算生物多態(tài)信息含量[11]：

PICi=1∑ni=1p2ij

式中，pij表示標(biāo)記i的第j個等位基因在群體中的分布頻率，標(biāo)記i的總等位基因數(shù)從j=1～n。運(yùn)用R語言計算269個參試品系兩兩間的遺傳相似系數(shù)，利用遺傳相似系數(shù)矩陣，用最小離差平方和法進(jìn)行聚類分析并作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 269份參試品系在60對SSR引物下的多態(tài)性分析

用60對SSR引物對269份參試品系進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后用聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，圖1所示為以RM1195引物擴(kuò)增的部分參試品系的電泳檢測結(jié)果，參試品系前是一個Marker作為標(biāo)記，以方便對比片段大小，并且加入了引物所對應(yīng)的標(biāo)樣（參照品種）以檢測參試品系和標(biāo)樣之間是否有差別。

采用上述方式，用60對SSR引物分別對269個參試品系進(jìn)行檢測，269個參試樣品中，13個同名品系DNA指紋相同，農(nóng)藝性狀考察表型也一致，說明本試驗檢測結(jié)果準(zhǔn)確。整理好數(shù)據(jù)后，將檢測出的等位基因數(shù)與多態(tài)性信息含量（PIC）進(jìn)行計算和統(tǒng)計（見表1）（由于269個檢測樣品中有13個是同名品系，后續(xù)計算、表述均基于256個樣品）。在256份參試品系中共檢測到271個等位基因，每個標(biāo)記多態(tài)性片段的均值是4.52個，其變異范圍在1～8個，其中2～7個的多態(tài)性片段占據(jù)比例為91.7%，表明60對SSR引物在參試品系中有較好多態(tài)性。

多態(tài)性信息含量是反映被測品系之間SSR標(biāo)記變異程度和SSR標(biāo)記效率的指標(biāo)，檢測到等位基因數(shù)量越多，PIC值越大，或等位基因頻率越高，PIC值越大;反之，PIC值越小。PIC值>0.5，多態(tài)性較高;0.25≤PIC值≤0.5，多態(tài)性適中;PIC值<0.25，多態(tài)性較低[12]。對60對引物的PIC值進(jìn)行了計算和統(tǒng)計（見表1）。結(jié)果表明，參試的256個品系的平均PIC值為0.41，變化范圍在0～0.76。引物RM274僅檢測到1個等位基因，PIC為0;引物RM21檢測到9個等位基因，PIC為0.76。有45個SSR標(biāo)記的PIC值≥0.25，占75%;有25個SSR標(biāo)記的PIC值>0.50，占42%。進(jìn)一步說明這60個SSR標(biāo)記在參試品系中具有良好多態(tài)性。

2.2 遺傳相似性分析

遺傳相似性系數(shù)用來表示2個品種間的親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近，數(shù)值越高，親緣關(guān)系越近;反之，則越遠(yuǎn)。利用60對SSR標(biāo)記位點上256個品系的分配信息，使用R語言進(jìn)一步估算了256個品系之間的相互遺傳相似性系數(shù)，256個參試品系相互遺傳相似性系數(shù)介于0.32～1，平均0.59，相互遺傳相似性系數(shù)在0.6以上的占比40.4%，說明這些品系總體來說親緣關(guān)系較近。其中有3組品系，遺傳相似系數(shù)為1，說明其盡管名稱不同，實質(zhì)是同一個品系;親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的2個品系是“保豐805”和“鎮(zhèn)稻9503”，之間的遺傳相似系數(shù)僅0.32。部分參試品系間的遺傳相似系數(shù)見表2。

利用遺傳相似系數(shù)矩陣進(jìn)行聚類分析（見圖2），發(fā)現(xiàn)以生育期為主劃分的同一生態(tài)類型品種（根據(jù)試驗組別確定）并沒有被更多聚在一起的跡象，說明品系之間的親緣關(guān)系與生育期并不密切，更多的可能還是與品系育成單位的親本選配有關(guān)。

3 小結(jié)與討論

利用在江蘇水稻品種特異性較好的60個SSR標(biāo)記對2019年江蘇的256份水稻品系進(jìn)行遺傳多樣性分析，結(jié)果表明，參試的256個品系的平均PIC值為0.41;有45個SSR標(biāo)記的PIC值≥0.25，占比75%;有25個SSR標(biāo)記的PIC值>0.50，占比42%;進(jìn)一步說明這60個SSR標(biāo)記在參試品系中多態(tài)性良好。參試品系的平均遺傳相似性系數(shù)為0.59，遺傳相似性系數(shù)在0.6以上的占比40.4%，說明這些品系總體來說親緣關(guān)系較近。其中也發(fā)現(xiàn)極端類型的3組品系，遺傳相似系數(shù)為1，實質(zhì)是同質(zhì)不同名品系參試。

從對256份材料研究結(jié)果表明，江蘇省水稻新品系間的遺傳多樣性可能并不豐富，遠(yuǎn)距離地區(qū)之間的基因交流和優(yōu)良基因的挖掘仍然有待提高。因此，在未來育種工作中，育種工作者仍需多多收集其它水稻品種豐富地區(qū)的優(yōu)良種質(zhì)資源，增加引進(jìn)外來品種，掌握所選親本的遺傳多樣性，創(chuàng)新育種方法，培育優(yōu)質(zhì)水稻品種。

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（責(zé)任編輯 周康）