新型冠狀病毒N蛋白原核可溶性表達與血清學評價

侯江厚，孫衛(wèi)國，黃國紅，詹曉燕，楊奕梅

1.昆明市婦幼保健院，云南 昆明 650013；2.解放軍總醫(yī)院 第八醫(yī)學中心，北京 100091

新型冠狀病毒肺炎（coronavirus disease 19，COVID-19）是新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）感染引起的以肺部病變?yōu)橹鞯男掳l(fā)傳染病，可引起消化系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)損傷，嚴重者可導致死亡[1]。目前針對COVID-19還沒有特效治療藥物，疫苗也處于臨床試驗階段，患者的早診斷、及時收治和隔離對有效控制疫情至關重要[2]。新冠病毒感染的大量排查主要采用核酸檢測，因其敏感性強而成為疑似病例確診的金標準[3]。但該技術對實驗場所及人員要求高，操作繁瑣，受環(huán)境條件影響較大，容易受氣溶膠的污染而出現(xiàn)假陽性[4]。傳統(tǒng)的抗原抗體反應是臨床實驗室檢測的重要補充，利用抗原檢測感染者血清中的抗體是快速篩查和核酸輔助診斷的重要手段。目前很多公司已開發(fā)出用于COVID-19臨床診斷的血清學檢測試劑盒，如膠體金法和傳統(tǒng)ELISA法，篩選出SARS-CoV-2中保守的具有優(yōu)勢表位的抗原或聯(lián)合抗原是血清學診斷成功的關鍵。SARS-CoV-2基因大小約為29.8 kb，基因組含有14個開放讀框（ORF），共編碼 27～28個蛋白質[5]。N 蛋白是SARS-CoV-2的核衣殼蛋白，位于病毒內(nèi)部，是干擾素（IFN）的拮抗劑和病毒編碼的RNA干擾抑制因子，與病毒復制有關[6]。β屬冠狀病毒的N蛋白相對比較保守，合成數(shù)量眾多，具有很強的抗原性，在誘導宿主免疫應答甚至發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用，常被用作冠狀病毒診斷的抗原位點[7]。蛋白質中二硫鍵的形成是原核生物和真核生物蛋白合成的重要過程，重組蛋白的可溶性表達往往代表著蛋白正確的空間折疊方式，保持了蛋白的天然空間結構。為了保證新冠病毒N蛋白重組純化過程的天然構象，我們將N蛋白與DsbC蛋白融合表達[8]，充分利用DsbC蛋白二硫鍵異構酶和分子伴侶的生物特性，促使融合蛋白在重組表達過程中以可溶性的形式存在于上清中，提高SARS-CoV-2感染者的檢出率，為以N蛋白為檢測抗原開發(fā)血清學檢測試劑盒打下基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

大腸桿菌 BL21（DE3）、質粒 pET-DsbC 由本室保存；SARS-CoV-2 N蛋白表達序列核酸載體pUC18-SARS-CoV-2 N由北京萬域美瀾科技公司沈春奇老師惠贈；質粒提取試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒購于天根生物科技公司；限制性核酸內(nèi)切酶、T4DNA連接酶購自NEB公司；KAPA高保真DNA聚合酶、dNTP購自北京閱微基因公司；親和樹脂購自友誼中聯(lián)生物科技公司；羊抗人IgG、TMB顯色液購自索萊寶生物公司；新型冠狀病毒IgG抗體檢測試劑盒（酶聯(lián)免疫法）購自北京華大吉比愛生物技術公司，酶標板條上包被有SARSCoV-2全病毒裂解液；30例臨床確診COVID-19患者血清、50例健康人血清由生物公司收集，ELISA實驗委托公司完成，嚴格按照生物安全有關規(guī)定操作，遵循實驗室操作的常規(guī)規(guī)定。

1.2 SARS-CoV-2 N蛋白核酸擴增引物的設計與合成

根據(jù)GenBank中的SARS-CoV-2 N蛋白核酸序列（MN908947.3），參照載體pET-DsbC多克隆位點，設計合成針對N蛋白核酸的特異引物，在下游引物的5'端引入大腸桿菌偏性的終止密碼子TAA。上游引物為P1（5'-ACGCGTCGACTCTG ATAATGGACC-3'），下游引物為 P2（5'-CTAGCT AGCTTAGGCCTGAGTTGAGTCAGC-3'），上、下游引物末端分別引入SalⅠ和NheⅠ酶切位點（下劃線序列）。

1.3 重組pET-DsbC-N融合表達質粒的構建

以載體pUC18-SARS-CoV-2 N核酸為模板，在熱激TaqDNA聚合酶作用下，采用引物P1和P2，常規(guī)PCR擴增SARS-CoV-2 N核酸序列（擴增條件：94℃預變性5 min；98℃變性20 s，68℃退火 20 s，72℃延伸 80 s，30個循環(huán)；72℃延伸 5 min）。1%瓊脂糖電泳驗證擴增產(chǎn)物的大小，膠回收PCR產(chǎn)物，回收的產(chǎn)物和表達載體pET-DsbC均經(jīng)SalⅠ和NheⅠ雙酶切，1%瓊脂糖電泳切膠回收酶切后的產(chǎn)物，在T4DNA連接酶的作用下把回收片段克隆到表達質粒pET-DsbC中，連接產(chǎn)物轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞BL21（DE3），篩選陽性克隆進行測序。

1.4 DsbC-N融合蛋白的原核可溶性表達

將經(jīng)公司測序正確的DsbC-N融合蛋白工程菌接種于含50 ng/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，置于搖床內(nèi)37℃振蕩培養(yǎng)激活，次日按1∶50的比例轉接到同樣體系的LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至菌液D600nm達0.4，加入終濃度為0.3 mmol/L的IPTG，37℃繼續(xù)振蕩培養(yǎng)誘導5 h。誘導后的菌液于4℃、5000 r/min離心收集菌體，沉淀菌體加入1×PBS緩沖液混勻后，冰浴狀態(tài)下超聲波破碎，4℃、12 000 r/min離心30 min，收集上清和沉淀，12%SDS-PAGE鑒定融合蛋白DsbC-N在原核系統(tǒng)內(nèi)的表達形式。

1.5 DsbC-N融合蛋白的親和純化

融合蛋白DsbC-N的N端帶有6×His標簽，可利用親和層析對上清蛋白進行純化。4℃條件下取離心后的上清，按2 mL/min的速度過鎳離子親和柱，以1×PBS平衡4個柱體積后，用100 mmol/L咪唑洗脫雜蛋白3個柱體積，再用200 mmol/L咪唑洗脫目的融合蛋白，收集目的蛋白，以15%SDS-PAGE對純化后的融合蛋白進行純度測定。

1.6 DsbC-N融合蛋白的血清抗體ELISA實驗

純化的DsbC-N融合蛋白經(jīng)水充分透析后，采用BCA方法進行濃度測定，以包被液將重組蛋白稀釋為 15 μg/mL，酶標板每孔包被 100 μL，室溫放置2 h，PBST緩沖液洗板4次；用10%小牛血清在4℃冰箱內(nèi)封閉過夜，次日用PBST洗板5次，待測樣本血清和健康人血清均以1∶50稀釋，每孔加入100 μL，于 37℃溫箱內(nèi)孵育 1 h，洗板5次，拍干，以1∶1000稀釋的HRP標記的羊抗人IgG于37℃孵育1 h，PBST洗板5次，TMB顯色，酶標儀檢測D450nm值。待測的30份經(jīng)核酸檢測陽性血清和50份健康者血清以新型冠狀病毒IgG抗體檢測試劑盒進行對比檢測，實驗嚴格按照試劑盒說明書進行。分析結果。

2 結果

2.1 SARS-CoV-2 N核酸序列PCR擴增與表達載體構建

以載體pUC18-SARS-CoV-2 N為模板，PCR擴增獲得SARS-CoV-2 N核酸序列，1%瓊脂糖電泳驗證產(chǎn)物，結果如圖1，在約1260 bp處存在清晰單一的條帶。SARS-CoV-2 N蛋白全長420個氨基酸殘基，對應基因大小為1260 bp，實驗結果符合理論值。

對PCR產(chǎn)物進行膠回收，通過基因克隆技術，將SARS-CoV-2 N核酸連接到表達載體pETDsbC上，轉化大腸桿菌BL21（DE3），篩選陽性克隆并測序保存。

2.2 DsbC-N融合蛋白的原核表達形式分析

將測序正確的pET-DsbC-N載體工程菌接種于含卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，在37℃條件下進行擴增培養(yǎng)和誘導表達，表達的菌體經(jīng)超聲波破碎后，分別取上清和沉淀用12%SDS-PAGE鑒定融合蛋白DsbC-N在原核系統(tǒng)內(nèi)表達形式，結果如圖2。DsbC-N融合蛋白在原核系統(tǒng)內(nèi)獲得較高表達，融合蛋白占菌體總蛋白的30%以上。超聲波破碎后，發(fā)現(xiàn)融合蛋白主要以包涵體的形式存在于菌體沉淀中，但有約30%的融合蛋白存在于上清中。上清中的蛋白通常為天然狀態(tài)，因此收集超聲波破碎后的上清準備親和純化。

2.3 DsbC-N融合蛋白的親和純化

用100 mmol/L咪唑洗脫雜蛋白，200 mmol/L咪唑洗脫目的融合蛋白，收集目的蛋白，15%SDS-PAGE分析純化后蛋白的純度，結果如圖3。融合蛋白經(jīng)親和純化后，純度可達92%以上，高純度的重組蛋白是后續(xù)開展血清學實驗獲得高特異性的保證。

2.4 DsbC-N融合蛋白的血清抗體ELISA實驗

圖1 SARS-CoV-2 N蛋白核酸PCR序列凝膠電泳鑒定

圖2 DsbC-N原核系統(tǒng)內(nèi)表達形式分析

用新型冠狀病毒IgG抗體檢測試劑盒對待測的30份陽性血清和50份健康者血清進行初檢，結果出現(xiàn)1例假陰性，檢出率為96%；出現(xiàn)假陽性2例，特異性為96%。重組DsbC-N融合蛋白抗原經(jīng)稀釋后包被過夜，最佳原始包被濃度為15 μg/mL，待測血清最佳稀釋度為1∶50。常規(guī)操作進行血清學ELISA分析，結果見圖4，SARS-CoV-2感染者陽性血清相對健康人血清而言，ELISA實驗中D450nm值具有顯著性差異。其中30例明確新冠肺炎血清陽性檢出例數(shù)為29例，檢出率為96%；50例健康人對照血清檢出1例，檢出率為2%，特異性為98%。本實驗設定cut-off值為健康人血清檢測平均D450nm值+3倍標準差。

3 討論

截至2020年8月20日，全球感染SARS-CoV-2的人數(shù)超過2000萬。在早期檢測中，核酸檢測發(fā)揮了巨大作用，達到了早診斷、早隔離的目的。隨著新冠病毒基因組序列的解析，各結構蛋白的表達序列被測序，重組診斷抗原開始發(fā)揮作用。病毒感染機體時，機體血清抗體中IgM出現(xiàn)最早，是急性期感染的診斷指標，但IgM濃度低，維持時間只有1周左右，并且親和力低；IgG抗體產(chǎn)生較晚，能提示感染中后期或存在既往感染，并且IgG濃度高，維持時間長，親和力高[9]。已有多家生物公司研發(fā)出檢測SARS-CoV-2 IgM和IgG抗體的方法，為新型冠狀病毒感染的輔助診斷和流行病調(diào)查提供了極好的檢測手段?？贵w檢測的特異性與抗原位點的保守性密切相關，SARS-CoV-2的N蛋白是COVID-19檢測的主要抗原位點[10]，目前臨床新冠病毒檢測試劑盒大多采用N蛋白抗原或刺突蛋白（S蛋白）抗原，或者二者聯(lián)用的方法檢測血清抗體。為了提高N蛋白抗原在血清學診斷中的敏感性和特異性，同時提高N蛋白在原核重組中表達量，在本課題中我們將N蛋白與DsbC融合表達。在原核重組表達系統(tǒng)中，可溶性表達往往代表重組蛋白具有正確的空間折疊，保證了檢測抗原的空間表位。利用DsbC蛋白分子伴侶和二硫鍵異構酶的生物學特性，獲得了SARS-CoV-2 N蛋白的可溶性表達，很好地保證了在血清學診斷中的檢出率。

圖3 DsbC-N融合蛋白親和純化SDS-PAGE分析

圖4 DsbC-N融合蛋白的血清學ELISA分析

ELISA通常用于進展期和恢復期患者血清病毒的抗體檢測[11]，是一種傳統(tǒng)的實驗室檢測技術，操作要求相對較低，可以明確患者是否近期或既往感染過SARS-CoV-2，有助于核酸檢測陰性但臨床上疑似患者的確診。本課題中，我們利用融合重組N蛋白，采用ELISA方法檢測明確感染者的血清抗體，在30例陽性樣本中檢出29例，陽性率可達96%，與現(xiàn)有IgG檢測試劑盒的符合率為100%；在50例陰性樣本中檢出1例，特異性為98%。漏檢1例，推測樣本來源患者可能處于“窗口期”，雖然核酸檢測為陽性，但患者血液內(nèi)還無法檢測到抗體，或者是血清在長時間保存過程中出現(xiàn)抗體聚集或降解，沒有被抗原捕捉。本課題獲得的可溶型重組SARS-CoV-2 N蛋白的融合蛋白用于血清學診斷的敏感性強，特異性高。當然，由于受國內(nèi)患者樣本來源枯竭的影響，沒有通過大樣本量進行驗證。后續(xù)將與公司合作，明確該融合蛋白在血清學診斷上的可行性，開發(fā)臨床檢測試劑盒，以控制SARS-CoV-2傳染，做到早診斷、早隔離、早控制。