長(zhǎng)鏈非編碼RNA SNHG16的表達(dá)對(duì)肺癌細(xì)胞增殖和化療耐藥影響的作用機(jī)制

姜翠紅，趙志正，劉睿，修俊青，譚鑫，王佳

中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院 廣安門醫(yī)院南區(qū)腫瘤科，北京 102618

肺癌是威脅人類健康的主要癌癥之一，患病率和死亡率較高，隨著城市環(huán)境污染、人們生活方式的改變，其患病率依然逐年上升[1-2]。肺癌患者被確診時(shí)往往已是晚期，并且其轉(zhuǎn)移迅速，患者預(yù)后很差[2]。目前治療肺癌主要有手術(shù)、化療、放療、靶向治療和免疫治療等方法[2-4]，其中手術(shù)、化療和放療為癌癥的傳統(tǒng)治療手段，化療由于會(huì)使腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性，治療效果不佳，亟待尋找抑制肺癌細(xì)胞化療耐藥的治療手段[5]。

長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是一類長(zhǎng)度大于200 nt不編碼蛋白的RNA。研究表明，lncRNA在腫瘤發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮作用[5-6]。lncRNA SNHG16被稱為小核仁RNA宿主基因16，最早在神經(jīng)母細(xì)胞瘤中發(fā)現(xiàn)，已被證明在結(jié)直腸癌、胃癌及膀胱癌中具有致癌作用，但在肺癌中還罕見研究報(bào)道[7-9]。在此，我們主要探討SNHG16的表達(dá)對(duì)肺癌細(xì)胞增殖和吉西他濱化療耐藥影響的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

肺癌患者組織及癌旁組織樣本來自中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院；肺癌細(xì)胞系HCC827、A549、NCI-H1395、NCI-H1975及肺上皮細(xì)胞系BEAS-2B購自中國(guó)科學(xué)院上海生科院細(xì)胞資源中心；胎牛血清、RPMI-1640培養(yǎng)基及DMEM培養(yǎng)基購自Gibco公司；F12K培養(yǎng)基購自Sigma公司；谷氨酰胺、丙酮酸鈉購自Invitrogen公司；sh-SNHG16-1、sh-SNHG16-2、miR-520a-3p-inhibitor及 miR-520a-3p mimic購自蘇州吉瑪基因股份有限公司；RNA提取試劑盒及cDNA合成試劑盒購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；SYBR GreenⅠ核酸染料購自ThermoFisher公司；SNHG16引物由北京博邁德基因技術(shù)有限公司合成；CCK-8細(xì)胞存活率檢測(cè)試劑盒購自日本東仁化學(xué)公司；雙螢光素酶報(bào)告基因試劑盒購自Promega公司；MRP1、MRP2、ABCG2轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白一抗購自Abcam公司。

1.2 cDNA合成和qRT-PCR實(shí)驗(yàn)

提取細(xì)胞總RNA，Nanodrop檢測(cè)RNA濃度，合成cDNA，合成樣品于-20℃保存?zhèn)溆谩２捎脽晒馊玖戏ㄟM(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)。SNHG16上游引物為5'-CAGAATGCCATGGTTTCCCC-3'，下游引物為5'-TGGCAAGAGACTTCCTGAGG-3'；GAPDH上游引物為5'-ACGGGAAGCTCACTGGC ATGG-3'，下游引物為5'-GGTCCACCACCCTGTT GCTGTA-3'；miR-520a-3p 上游引物為 5'-GCAG AAAGTGCTTCCCTTTG-3'，下游引物為5'-GGTC CAGTTTTTTTTTTTTTTTACAGT-3'；U6上游引物為5'-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3'，下 游 引物為5'-GGAACGCTTCACGAATTTG-3'。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞轉(zhuǎn)染

肺癌細(xì)胞系HCC827、A549、NCI-H1395、NCIH1975及肺上皮細(xì)胞系BEAS-2B分別采用RPMI-1640、F12K、RPMI-1640和DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，HCC827、A549及BEAS-2B細(xì)胞完全培養(yǎng)基中胎牛血清∶培養(yǎng)基為體積比1∶9，NCI-H1395和NCIH1975細(xì)胞完全培養(yǎng)基中胎牛血清∶培養(yǎng)基∶谷氨酰胺∶丙酮酸鈉為體積比88∶10∶1∶1。細(xì)胞在5% CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分為sh-NC組、sh-SNHG16-1組、sh-SNHG16-2組，采用LipofectAMINE 3000向已接種細(xì)胞的6孔板中轉(zhuǎn)染，48 h后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 細(xì)胞增殖率檢測(cè)

96孔板中按5×103/孔接種細(xì)胞，待細(xì)胞覆蓋率達(dá)到50%左右，分別加入完全培養(yǎng)基稀釋的0、5、10、20 μmol/L 的吉西他濱溶液，與細(xì)胞孵育48 h；棄去培養(yǎng)液，加入不含血清培養(yǎng)基配制的10% CCK-8反應(yīng)液，將培養(yǎng)板繼續(xù)置于37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)40 min，酶標(biāo)儀檢測(cè)D450nm值。

1.5 雙螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)

構(gòu)建載體，即含miR-520a-3p結(jié)合位點(diǎn)的WT-SNHG16及Mut-SNHG16插入pmir-GO，采用LipofectAMINE 3000將 miR-NC、miR-520a-3p mimics共轉(zhuǎn)染肺癌細(xì)胞，48 h后分別檢測(cè)螢火蟲螢光素酶及海腎螢光素酶活性，結(jié)果表示為相對(duì)螢光素酶活性（螢火蟲螢光素酶活性/海腎螢光素酶活性。

1.6 蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)

用細(xì)胞裂解液于冰上裂解細(xì)胞，4℃、12 000 r/min離心10 min分離細(xì)胞碎片和上清液，Bradford法測(cè)定總蛋白含量。蛋白樣品中加入適量的上樣緩沖液，于100℃水浴鍋中煮沸10 min后進(jìn)行SDS-PAGE，然后恒流轉(zhuǎn)膜2 h。將轉(zhuǎn)好蛋白的PVDF膜置于TBST配置的5%脫脂奶粉中封閉1～2 h，加入一抗4℃孵育過夜，接著加入含辣根過氧化物酶的二抗常溫孵育，ECL化學(xué)發(fā)光液反應(yīng)，凝膠成像儀成像顯影，拍攝蛋白條帶結(jié)果。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用GraphPad Prism 7.0對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析檢驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用x±s表示，組內(nèi)兩兩比較采用LSD-t分析，組間比較采用單因素或雙因素方差分析，檢測(cè)水平α＜0.05（雙側(cè)），Shapiro-Wilk檢測(cè)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均服從正態(tài)分布。P＜0.05表示有顯著性差異，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SNHG16在肺癌組織和肺癌細(xì)胞系中高表達(dá)

采用qRT-PCR檢測(cè)SNHG16在肺癌組織和細(xì)胞系中表達(dá)量，結(jié)果見圖1，Shapiro-Wilk檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果符合正態(tài)分布（均P＞0.05）。結(jié)果顯示，SNHG16在肺癌組織和肺癌細(xì)胞系中表達(dá)量均明顯高于相應(yīng)的癌旁組織和正常肺上皮細(xì)胞系，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 敲低SNHG16抑制NCI-H1395細(xì)胞增殖率和對(duì)吉西他濱耐藥

慢病毒包裝構(gòu)建sh-SNHG16-1、sh-SNHG16-2，分為sh-NC組、sh-SNHG16-1組、sh-SNHG16-2組，采用qRT-PCR檢測(cè)各組NCI-H1395細(xì)胞中SNHG16的表達(dá)量，結(jié)果見圖2A，Shapiro-Wilk檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果符合正態(tài)分布（均P＞0.05）。采用CCK-8檢測(cè)3組NCI-H1395細(xì)胞增殖率，結(jié)果見圖2B，Shapiro-Wilk檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果符合正態(tài)分布（均P＞0.05）。sh-SNHG16-1、sh-SNHG16-2組細(xì)胞增殖率在12、24和48 h時(shí)明顯低于sh-NC組，F(xiàn)時(shí)間=574，F(xiàn)組別=128.8，F(xiàn)時(shí)間×組別=16.7，均P＜0.001。采用CCK-8檢測(cè)3組NCI-H1395對(duì)吉西他濱耐藥的影響，結(jié)果見圖2C，Shapiro-Wilk檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果符合正態(tài)分布（均P＞0.05）。sh-SNHG16-1、sh-SNHG16-2組細(xì)胞存活率在吉西他濱濃度分別為5、10和 20 μmol/L時(shí)明顯低于 sh-NC 組，F(xiàn)濃度=320.5，P＜0.001，F(xiàn)組別=44.83，P＜0.001，F(xiàn)濃度×組別=3.562，P=0.0053。以上結(jié)果表明，sh-SNHG16敲低SNHG16的表達(dá)量，抑制NCI-H1395細(xì)胞增殖率和對(duì)吉西他濱耐藥，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3 SNHG16作為海綿抑制miR-520a-3p的表達(dá)

用starBase軟件預(yù)測(cè)靶向SNHG16的miRNA，分為Vector組、SNGH16組，qRT-PCR檢測(cè)各組miRNA的表達(dá)量，結(jié)果見圖3A，Shapiro-Wilk檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果符合正態(tài)分布（均P＞0.05）。雙螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)miR-NC、miR-520a-3p mimics組SNHG16野生型和突變型的相對(duì)雙螢光素酶活性，結(jié)果見圖3B，Shapiro-Wilk檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果符合正態(tài)分布（均P＞0.05）。圖3C為SNHG16野生型與miR-520a-3p結(jié)合位點(diǎn)。結(jié)果表明，增加SNHG16的表達(dá)明顯降低miR-520a-3p的表達(dá)，增加miR-520a-3p的表達(dá)明顯降低SNHG16野生型的相對(duì)螢光素酶活性，證明SNHG16作為海綿抑制miR-520a-3p的表達(dá)，差異結(jié)果均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 SNHG16在肺癌組織和肺癌細(xì)胞系中的表達(dá)量

圖2 敲低SNHG16對(duì)NCI-H1395細(xì)胞增殖率及吉西他濱耐藥的影響

圖3 SNHG16作為海綿抑制miR-520a-3p的表達(dá)

2.4 SNHG16/miR-520a-3p對(duì)NCI-H1395細(xì)胞增殖率和對(duì)吉西他濱耐藥的影響

分為sh-NC組、sh-SNHG16組、sh-SNHG16+miR-520a-3p-inhibitor組，qRT-PCR檢測(cè)各組NCI-H1395細(xì)胞中miR-520a-3p的表達(dá)量，結(jié)果見圖4A，Shapiro-Wilk檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果符合正態(tài)分布（均P＞0.05）。采用CCK-8檢測(cè)3組NCI-H1395細(xì)胞增殖率，結(jié)果見圖4B，Shapiro-Wilk檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果符合正態(tài)分布（均P＞0.05）。sh-SNHG16組細(xì)胞增殖率在12、24和48 h時(shí)明顯低于sh-NC組，sh-SNHG16+miR-520a-3p-inhibitor組相比sh-NC組各時(shí)間細(xì)胞增殖率沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），F(xiàn)時(shí)間=1177，F(xiàn)組別=178.3，F(xiàn)時(shí)間×組別=39.93，均P＜0.001。采用CCK-8檢測(cè)3組NCI-H1395對(duì)吉西他濱耐藥的影響，結(jié)果見圖4C，Shapiro-Wilk檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果符合正態(tài)分布（均P＞0.05）。sh-SNHG16組細(xì)胞存活率在吉西他濱濃度分別為5、10和20 μmol/L時(shí)明顯低于sh-NC組，sh-SNHG16+miR-520a-3p-inhibitor組相比sh-NC組各濃度對(duì)吉西他濱耐藥沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），F(xiàn)濃度=231.7，P＜0.001，F(xiàn)組別=27.86，P＜0.001，F(xiàn)濃度×組別=2.391，P=0.042。采用蛋白質(zhì)印跡檢測(cè) MRP1、MRP2、ABCG2轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)水平，結(jié)果見圖4D。sh-SNHG16組3種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)水平明顯低于sh-NC組，sh-SNHG16+miR-520a-3p-inhibitor組與sh-NC組相比沒有明顯差異。以上結(jié)果表明，sh-SNHG16通過上調(diào)miR-520a-3p的表達(dá)量，抑制NCI-H1395細(xì)胞增殖率和對(duì)吉西他濱耐藥，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖4 SNHG16/miR-520a-3p對(duì)NCI-H1395細(xì)胞增殖率和對(duì)吉西他濱耐藥的影響

3 討論

肺癌在所有癌癥死亡因素中居首位，每年死于肺癌的人數(shù)占癌癥死亡人數(shù)的18%～25%[2,10]。lncRNA是一類不編碼蛋白的長(zhǎng)鏈RNA，研究表明其在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用，通過多種機(jī)制調(diào)控靶基因，包括轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后加工、染色質(zhì)修飾和蛋白質(zhì)功能，從而參與人類癌癥的發(fā)生發(fā)展[8]。SNHG16屬于lncRNA中小核仁RNA宿主基因家族，研究表明其表達(dá)量與腫瘤分期分型、患者預(yù)后及生存率有關(guān)[6,8,11]。SNHG16在卵巢癌中高表達(dá)，與卵巢癌分期、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和預(yù)后不良有關(guān)，SNHG16能夠激活A(yù)KT磷酸化，上調(diào)MMP9的表達(dá)，促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移[12]。沉默SNHG16促進(jìn)細(xì)胞周期停滯和凋亡，抑制膀胱癌細(xì)胞的增殖[8]。SNHG16在乳腺癌組織中的表達(dá)水平高于相應(yīng)的非癌組織，其通過競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miR-98誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞遷移[13]。SNHG16在宮頸癌中作為癌基因，可通過作為內(nèi)源性“海綿”來調(diào)節(jié)miR-216a-5p/ZEB1，從而促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展[14]。SNHG16在結(jié)直腸癌中表達(dá)顯著上調(diào)，其表達(dá)與Wnt調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子ASCL2、ETS2和cMyc的表達(dá)呈正相關(guān)，敲低Wnt信號(hào)可降低SNHG16的表達(dá)，表明SNHG16受Wnt信號(hào)通路調(diào)控[7]。SNHG16過表達(dá)能夠抑制肝癌細(xì)胞增殖、5-氟尿嘧啶耐藥和體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)。

本研究主要探討肺癌中SNHG16的表達(dá)量對(duì)化療耐藥影響的作用機(jī)制。前期研究結(jié)果表明，SNHG16在肺癌中的表達(dá)量明顯高于癌旁組織，其在肺癌細(xì)胞系中的表達(dá)量也明顯高于正常肺上皮細(xì)胞。我們?cè)诜伟┘?xì)胞系中敲低SNHG16的表達(dá)，降低了細(xì)胞增殖和對(duì)化療藥物吉西他濱的耐藥，提示SNHG16可能在肺癌中作為癌基因促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖和對(duì)化療的耐藥。

為進(jìn)一步探究SNHG16調(diào)控肺癌細(xì)胞增殖和耐藥的作用機(jī)制，我們通過軟件預(yù)測(cè)SNHG16作為海綿拮抗miR-520a-3p的表達(dá)，其在肺癌中的表達(dá)與SNHG16呈負(fù)相關(guān)，并采用螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證了該結(jié)果，證實(shí)SNHG16靶向作用miR-520a-3p。在肺癌細(xì)胞中，同時(shí)敲低SNHG16和miR-520a-3p的表達(dá)，可降低細(xì)胞增殖和對(duì)化療藥物吉西他濱耐藥的影響結(jié)果。此外，敲低SNHG16明顯增加miR-520a-3p的表達(dá)量，說明敲低SNHG16抑制肺癌細(xì)胞增殖和化療耐藥通過增加miR-520a-3p的表達(dá)量實(shí)現(xiàn)。研究發(fā)現(xiàn)，miR-520a-3p在非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）和小細(xì)胞肺癌（SCLC）中表達(dá)下調(diào)，miRNA-520a-3p通過靶向HOXD8抑制NSCLC細(xì)胞的增殖和腫瘤干細(xì)胞表型，逆轉(zhuǎn)吉非替尼耐藥性[15]。lncRNA能夠靶向miRNA，影響miRNA生物功能，如LINC01116通過靶向miR-520a-3p上調(diào)骨肉瘤中IL-6R的表達(dá)，激活JAK-STAT信號(hào)通路，促進(jìn)骨肉瘤進(jìn)展[16]。

綜上，SNHG16在肺癌組織和細(xì)胞中高表達(dá)，并通過“海綿”作用抑制miR-520a-3p的表達(dá)，從而促進(jìn)肺癌細(xì)胞增殖和耐藥。但是，目前尚不清楚SNHG16調(diào)控肺癌增殖和化療耐藥的具體作用機(jī)制，須進(jìn)一步探討。SNHG16可以作為肺癌治療的潛在作用靶點(diǎn)。