LC-MS技術(shù)在天然產(chǎn)物黃酮類成分分析中的應(yīng)用△

牛江濤，曹瑞，司昕蕾，辛二旦，張育貴，張淑娟，李越峰*

1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅省中藥質(zhì)量與標(biāo)準(zhǔn)研究重點實驗室，甘肅 蘭州 730000

黃酮類化合物(flavonoids)是廣泛存在于自然界，基本母核為2-苯基色原酮(C6-C3-C6)的一系列化合物的總稱[1]。黃酮類成分是多種中藥的次生代謝產(chǎn)物，也是其主要的藥效成分[2-3]。研究表明，黃酮類化合物具有保護心血管系統(tǒng)[4-7]、抗氧化[8]、抗抑郁[9]、抗炎[10]、抗腫瘤[11]、鎮(zhèn)靜催眠[12]等作用，并有類雌激素[13]作用。黃酮類化合物分布廣泛、數(shù)量眾多且結(jié)構(gòu)復(fù)雜，因此選用一種高效、快速、準(zhǔn)確的結(jié)構(gòu)鑒定和含量測定的分析技術(shù)具有重要的意義。液質(zhì)聯(lián)用(LC-MS)技術(shù)是近年來發(fā)展起來的集LC的高分離能力和MS的高靈敏度及強大的結(jié)構(gòu)測定能力于一體的一門綜合性分析技術(shù)[14]，近年來已經(jīng)越來越廣泛地應(yīng)用于黃酮類成分的分析測定中。本文通過對LC-MS技術(shù)在黃酮類成分研究中應(yīng)用的相關(guān)文獻進行綜述和歸納，旨在為黃酮類成分的分析測定提供參考。

1 LC-MS技術(shù)概述及化合物分析方法

1.1 LC-MS簡述

液質(zhì)聯(lián)用儀主要由高效液相色譜、接口設(shè)備以及質(zhì)譜3個部分組成，接口設(shè)備將LC和MS精密地結(jié)合，使得LC-MS可以同時對復(fù)雜成分進行定性和定量分析[15]。LC-MS技術(shù)的主要原理是樣品先經(jīng)過液相色譜分離后進入接口設(shè)備，使樣品氣化、電離并除去流動相溶劑，最后進入質(zhì)譜儀做質(zhì)譜檢測。接口技術(shù)是LC-MS的關(guān)鍵技術(shù)，目前應(yīng)用最廣泛的接口技術(shù)主要是大氣壓離子化接口(API)技術(shù)，其主要包括電噴霧離子化(ESI)、大氣壓化學(xué)離子化(APCI)和離子噴霧離子化(ISI)模式[16]。隨著技術(shù)的不斷更新，LC-MS技術(shù)不僅能檢測小分子物質(zhì)還能檢測如蛋白質(zhì)、多肽等大分子物質(zhì)，同時還可以分析極性大、揮發(fā)性差和熱不穩(wěn)定的化合物[15]。因此，LC-MS技術(shù)在藥物分析、質(zhì)量控制、藥代動力學(xué)、代謝組學(xué)、蛋白組學(xué)等諸多領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用[17]。

1.2 LC-MS化合物分析方法

樣品經(jīng)前處理后，進入液相色譜，經(jīng)分離后，洗脫進入質(zhì)譜離子源，實現(xiàn)樣品離子化，然后進入質(zhì)譜檢測器中按照母離子質(zhì)荷比(m/z)差異進行分離選擇，然后進入碰撞室發(fā)生碰撞誘導(dǎo)裂解，產(chǎn)生子離子，再經(jīng)后1個質(zhì)量分析器按m/z分離后檢測，從而實現(xiàn)定性定量分析[18]。例如基于超高效液相色譜聯(lián)合飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-Q-TOF/MS)技術(shù)結(jié)合數(shù)據(jù)依賴型掃描模式，能夠獲得成分高質(zhì)量精度的一級質(zhì)譜和二級質(zhì)譜信息。依據(jù)化合物的一級質(zhì)譜信息(相對保留時間、準(zhǔn)離子峰質(zhì)荷比以及對應(yīng)的加合離子)能夠確定化合物的分子式，通過檢索NISI、Wiley等數(shù)據(jù)庫，可以從中篩選出目標(biāo)化合物[19]；再結(jié)合化合物的二級質(zhì)譜信息進一步確定化合物的母核結(jié)構(gòu)、特征官能團等，從而快速篩選或推測出目標(biāo)化合物結(jié)構(gòu)。

2 黃酮類化合物結(jié)構(gòu)特征和裂解規(guī)律

2.1 結(jié)構(gòu)特征

黃酮類化合物是由2個苯環(huán)(A與 B環(huán))通過3個碳原子互相聯(lián)結(jié)而成的一系列化合物。通常根據(jù)中間3個碳原子是否成環(huán)、環(huán)與環(huán)的接連位置以及三碳的氧化程度等結(jié)構(gòu)特征，常將黃酮類化合物分成黃酮(flavone)、異黃酮(isoflavone)、黃酮醇(flavonol)、二氫黃酮(flavanone)、二氫異黃酮(isoflavanone)、二氫黃酮醇(flavanonol)、查耳酮(chalcone)、花色素(anthocyanidin)等[20-21]。黃酮類化合物的基本母核結(jié)構(gòu)見圖1。

圖1 黃酮和異黃酮母核結(jié)構(gòu)

自然界中存在的天然黃酮大多是以上述結(jié)構(gòu)為母核的衍生物，因A、B環(huán)上取代基的數(shù)目、種類、取代位點的不同而形成各種各樣的黃酮類物質(zhì)，常見的取代基有羥基、甲基、甲氧基及異戊烯基等[22]。黃酮類化合物主要以2種形式存在于植物體內(nèi)，其中大部分以與糖基結(jié)合成苷的形式存在，而另一部分以游離形式存在。天然黃酮糖苷多以O(shè)-糖苷和C-糖苷形式存在。

2.2 裂解規(guī)律

近年來，學(xué)者們對黃酮類化合物做了大量的質(zhì)譜研究。研究表明，ESI和APCI模式均適用于黃酮類化合物分析，一般正離子模式下稍好于負離子模式[23]。電噴霧質(zhì)譜等軟電離質(zhì)譜技術(shù)，不但可以得到游離黃酮類的強分子離子峰，并且可以直接測定黃酮類O-糖苷，而獲得很強的分子離子峰或準(zhǔn)分子離子峰，同時也能獲得有關(guān)苷元及糖基部分的重要結(jié)構(gòu)信息[24]。研究表明，黃酮類化合物均發(fā)生系列以C環(huán)為中心的斷裂、丟失與重排反應(yīng)，其主要有如圖2所示的2種裂解方式。

裂解方式Ⅰ(RDA裂解)：

裂解方式Ⅱ：

圖2 黃酮類化合物主要裂解方式

上述2種裂解方式呈相互競爭、互相制約的關(guān)系[24]。大多數(shù)游離黃酮的分子離子峰[M]+為基峰，[M-H]+、[M-CO]+以及由裂解方式I產(chǎn)生的碎片A1+、[A1-CO]+和B1+峰均為較重要的峰，此類質(zhì)譜信息可以確定苷元類型及A、B、C環(huán)上的取代基類型及取代基數(shù)目[25]。黃酮苷類因與糖基連接的苷鍵原子為C原子和O原子的不同而分為黃酮C-糖苷和黃酮O-糖苷。黃酮C-糖苷多以糖環(huán)的交叉環(huán)切除裂解為主，幾乎不產(chǎn)生苷元離子；黃酮O-糖苷的裂解以糖苷鍵的斷裂、糖糖鍵的斷裂以及糖環(huán)的交叉環(huán)切除裂解為主[23]。研究表明，在質(zhì)譜分析中結(jié)構(gòu)相同的化合物一般其裂解規(guī)律相似并具有相似的特征碎片，因而總結(jié)黃酮標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的裂解規(guī)律，并以其特征碎片離子作為診斷離子，有利于黃酮類未知化合物的質(zhì)譜解析[26]。

3 LC-MS技術(shù)在黃酮類成分分析中的應(yīng)用

3.1 LC-MS技術(shù)在黃酮類成分結(jié)構(gòu)分析中的應(yīng)用

LC-MS技術(shù)可以得到樣品的紫外圖譜、正負模式下的總離子流圖以及各組分的一級、二級質(zhì)譜圖，通過與對照品相對保留時間的比對及準(zhǔn)分子離子峰、特征碎片離子峰信息的綜合分析，可以解析化合物結(jié)構(gòu)信息。黨立志等[27]采用 LC-MS技術(shù)，以迷迭香為研究藥材，建立了一種快速識別其中黃酮苷類化合物的方法，同時解析出了14 種黃酮苷及其同系物結(jié)構(gòu)。王翌臣等[28]基于LC-MS技術(shù)從大狼把草的提取液中鑒定出了22個黃酮類成分，并發(fā)現(xiàn)其裂解方式主要是丟失CO和H2O等碎片。王蘆笛[29]采用多離子監(jiān)測-信息依賴-增強型子離子掃描(MIM-IDA-EPI)掃描方式為主，LTQ/Orbitrap mass分析為輔的分析方法對瑞香狼毒水提液進行分析，并鑒定出23種黃酮類化合物。白海玉等[30]基于前級離子質(zhì)量準(zhǔn)確度、同位素分布模式和碰撞誘導(dǎo)解離(CID)碎裂模式等分析，同時結(jié)合二級譜圖信息匹配及文獻報道，從野菊花中共鑒定出28種黃酮類成分的結(jié)構(gòu)。馮藝飛等[31]基于LC-MS技術(shù)對茵陳黃酮提取物組成進行分析，并從中鑒定出了蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷等成分。Cao等[32]基于高效液相色譜-電噴霧電離子串聯(lián)離子阱質(zhì)譜(HPLC-ESI-IT-MSn)技術(shù)從紫花地丁中成功鑒定出了35種黃酮苷類成分結(jié)構(gòu)。

3.2 LC-MS技術(shù)在黃酮類成分定量分析中的應(yīng)用

LC-MS技術(shù)以其高靈敏性可以測定極少量樣品中成分的含量。謝進等[33]采用LC-MS對黃秋葵莢果中黃芩素、柚皮素、槲皮素、黃芩苷和蘆丁5種黃酮類成分的含量進行測定，并發(fā)現(xiàn)該方法具有重復(fù)性好、靈敏度高、專一性強等優(yōu)點。杜娟等[34]采用LC-MS技術(shù)，以體積分數(shù)為0.1%甲酸乙腈和體積分數(shù)為0.1%甲酸水溶液為流動相，在負離子模式下采用多反應(yīng)監(jiān)測，測定葛根素、木犀草素、槲皮素和兒茶素含量。其研究結(jié)果表明，4 種黃酮的平均加樣回收率為93.6%～107.5%，RSD為1.62%～2.21%，表明該方法靈敏、準(zhǔn)確、穩(wěn)定，可用于山楂降脂軟膠囊的質(zhì)量控制。魏巍等[35]采用UPLC-MS/MS同時測定了鎮(zhèn)江香醋中10種黃酮類成分含量，結(jié)果表明，10種黃酮類化合物在25.0～1 000.0 ng·mL-1線性關(guān)系良好(0.999 8≥r≥0.993 4)，檢出限為1.0～4.0 ng·mL-1。朱雅玲等[36]基于HPLC-MS/MS同時測定了喘可治注射液中4種黃酮苷含量，其研究結(jié)果顯示，4種成分在API3000液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)儀上的定量限均為 0.04 ng·mL-1、檢測限均為 0.05 ng·mL-1。

3.3 LC-MS技術(shù)在黃酮類成分藥動學(xué)研究中的應(yīng)用

近年來，LC-MS技術(shù)越來越多地應(yīng)用到黃酮類成分的藥代動力學(xué)研究中。有研究采用HPLC-MS/MS，同時測定了灌胃大薊提取物后大鼠血漿中7種黃酮類成分的含量，并發(fā)現(xiàn)其中除芹菜素外，6種大薊黃酮類成分在大鼠體內(nèi)吸收和消除迅速[37]。常路[38]采用LC-MS對槐角中槐角苷、染料木苷、染料木素、蘆丁、槲皮素和山柰酚6種黃酮類成分做了藥代動力學(xué)研究，其研究結(jié)果顯示，灌胃給藥槐角提取物后黃酮苷先被吸收，黃酮苷元后被吸收，且黃酮苷元在血液中消除緩慢。另有研究采用LC-MS做了麥冬中黃烷酮E、麥冬黃酮A、麥冬二氫黃烷酮A和麥冬二氫黃烷酮B大鼠血漿中的藥物動力學(xué)研究，結(jié)果表明，麥冬黃酮類成分雖具有相似的化學(xué)結(jié)構(gòu)，但血藥濃度-時間曲線和藥物代謝動力學(xué)參數(shù)卻表現(xiàn)出顯著差異[39]。

4 結(jié)語

黃酮類化合物廣泛存在于植物體內(nèi)，具有多種藥理活性，是一類具有廣泛開發(fā)前景的天然藥物。因此，總結(jié)梳理黃酮類化合物的快速準(zhǔn)確的定性定量分析方法，對其進一步開發(fā)研究具有重要意義。LC-MS技術(shù)集液相色譜高分離能力和質(zhì)譜的結(jié)構(gòu)解析能力于一體，具有高靈敏度、高分辨率、快速、穩(wěn)定等特點，是黃酮類等復(fù)雜化合物同時定性定量分析的重要技術(shù)手段。隨著LC-MS技術(shù)的不斷發(fā)展，采用該技術(shù)分析黃酮類化合物將會變得更加快速、準(zhǔn)確、簡單和便捷。