基于UPLC含量測定的不同廠家穿心蓮膠囊質(zhì)量評價

趙振霞，蘇建，孔亞萍，劉永利

河北省藥品檢驗研究院，石家莊 050011

穿心蓮膠囊是由穿心蓮單味藥制成的中成藥，具有清熱解毒、涼血消腫的功效，是臨床常用清熱解毒用藥，主要用于咽喉腫痛、口舌生瘡等[1]。穿心蓮主要有效成分為穿心蓮內(nèi)酯(andrographolide，AP)、脫水穿心蓮內(nèi)酯(dehyandrographolide，DAP)、去氧穿心蓮內(nèi)酯和新穿心蓮內(nèi)酯等二萜內(nèi)酯類成分，其中AP和DAP含量較高，在解熱消炎、抗腫瘤等方面具有較強的藥理作用[2-4]。全國穿心蓮膠囊的生產(chǎn)企業(yè)共有28家，此次依托國家藥品評價抽驗，在全國藥品生產(chǎn)、經(jīng)營、使用單位共抽取了27批樣品，涉及4個生產(chǎn)企業(yè)，基本覆蓋了目前市場上主流產(chǎn)品。本研究采用超高效液相色譜法(UPLC)，建立了同時測定穿心蓮膠囊中AP與DAP含量的方法，對27批穿心蓮膠囊樣品的含量進行分析，發(fā)現(xiàn)了穿心蓮膠囊的主要質(zhì)量問題，為藥品生產(chǎn)企業(yè)改進質(zhì)量與完善質(zhì)量標準提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

超高效液相色譜儀(配備四元泵、DAD 檢測器，美國 Waters 公司)；AE240型電子分析天平(瑞士METTLER TOLEDO 公司)；KQ-500DE 型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；超純水儀(美國Millipore 公司)。

1.2 試藥

AP對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：110797-201609，純度：99.7%)；DAP對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：110854-201509，純度：99.4%)；穿心蓮膠囊樣品抽自全國藥品生產(chǎn)、經(jīng)營、使用單位；甲醇、乙腈(色譜純，Merck，Germany)；水為超純水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱選用ACQUITY UPLC BEH C18柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)；以乙腈為流動相A，水為流動相B，梯度洗脫(0～5 min，10%～15%A；5～15 min，15%～22%A；15～20 min，22%～25%A；20～30 min，25%～35%A)；柱溫：30 ℃，流速：0.3 mL·min-1；檢測波長：225 nm(AP)、254 nm(DAP)。

2.2 溶液的制備

2.2.1混合對照品溶液的制備 分別精密稱取AP對照品、DAP對照品10.45、10.90 mg，分別置于50 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，制成質(zhì)量濃度分別為0.208 4、0.216 7 mg·mL-1的混合對照品溶液，即得。

2.2.2供試品溶液的制備 取裝量差異項下的本品，研細，取約1粒的量，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz)30 min，取出，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3陰性樣品溶液的制備 取穿心蓮膠囊陰性樣品粉末適量(按處方及工藝，制備不含穿心蓮的陰性樣品)，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz)30 min，取出，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 系統(tǒng)適用性實驗

精密量取2.2項下混合對照品溶液、供試品溶液、陰性樣品溶液各適量，按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結果，在該色譜條件下，AP和DAP與相鄰成分均可達到較好的分離，分離度>1.5，理論板數(shù)以AP峰計不低于5000，且陰性無干擾，說明系統(tǒng)適用性良好，見圖1。

注：1.AP；2.DAP。圖1 穿心蓮膠囊專屬性UPLC圖

2.4 方法學考察

2.4.1線性關系考察 依次精密量取不同濃度的AP對照品溶液與DAP對照品溶液2 μL，分別注入超高效液相色譜儀，按2.1項下色譜條件測定，以對照品進樣量(μg)為橫坐標，峰面積積分值為縱坐標，繪制標準曲線，計算線性回歸方程。結果表明，AP在0.082 6～2.064 8 μg呈良好的線性關系，回歸方程：Y=7.863×106X+6.103×104(r=0.999 9)；DAP在0.040 8～1.019 7 μg呈良好的線性關系，回歸方程：Y=6.239×106X+5.327×104(r=0.999 9)。

2.4.2穩(wěn)定性試驗 取按2.2項下制備的同一份穿心蓮膠囊供試品溶液，照2.1項下的色譜條件分別在0、1、2、4、8、16、24 h進樣測定，記錄峰面積，AP和DAP峰面積的RSD分別為0.85%、1.24%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.3重復性試驗 取同一批穿心蓮膠囊樣品，研細，取0.15、0.30、0.45 g，各3份，精密稱定，分別按2.2項下制備方法制備供試品溶液，照2.1項下的色譜條件進樣測定，記錄各成分峰面積，計算得到AP和DAP的平均質(zhì)量分數(shù)分別為46.64、17.99 mg·g-1，RSD分別為1.1%、1.6%，表明該方法重復性良好。

2.4.4加樣回收率試驗 精密稱取已知含量的穿心蓮膠囊樣品約0.15 g，共9份，分別加入低、中、高3個濃度的混合對照品溶液，按2.2項下制備方法制備供試品溶液，照2.1項下的色譜條件進樣測定，計算回收率及其RSD，結果見表1，表明該方法回收率較好。

表1 穿心蓮膠囊中AP與DAP加樣回收率試驗結果(n=9)

2.5 樣品測定

精密吸取按2.2項下方法制備的穿心蓮膠囊供試品溶液，照2.1項下的色譜條件依次進樣測定，按外標法計算各樣品中AP和DAP的含量，結果見表2，不同生產(chǎn)企業(yè)之間測定結果比較的箱式圖見圖2。

表2 穿心蓮膠囊中AP與DAP的含量測定結果 mg/粒

含量測定結果顯示，27批穿心蓮膠囊樣品中，AP與DAP的含量分別為0.94～7.50、5.62～10.12 mg/粒。箱式圖顯示，不同生產(chǎn)企業(yè)之間DAP的含量相差較小，測定結果較為集中；而AP的含量相差懸殊，部分樣品的測定結果較低；表明生產(chǎn)企業(yè)在生產(chǎn)中未關注AP含量，只關注了法定標準中測定的DAP含量。另外，各企業(yè)樣品都是DAP含量>AP含量，與藥材中兩者含量相反[5-7]，可能與藥材質(zhì)量、生產(chǎn)工藝等有關。

AP聚類分析(見圖3)顯示，廣西千珍制藥有限公司的樣品單獨聚為一類，說明與其他企業(yè)之間存在明顯差異，從測定結果也可以看出廣西千珍制藥有限公司的樣品含量測定值比其他企業(yè)要高；DAP聚類分析結果顯示，各企業(yè)不同批次之間樣品含量測定結果都有交叉，說明企業(yè)之間的差異性較小。

圖2 穿心蓮膠囊中AP與DAP的含量測定結果

注：A.AP;B.DAP；使用平均聯(lián)接(組間)的樹狀圖重新調(diào)整距離聚類合并。圖3 穿心蓮膠囊含量測定聚類分析結果

3 討論

3.1 提取條件的選擇

在前期實驗中考察了回流提取法和超聲提取法對樣品中AP和DAP提取量的影響。結果表明，回流和超聲對兩者的提取量差異無統(tǒng)計學意義，且超聲提取法簡單、方便，故確定超聲提取法為樣品提取方法。還對40%甲醇、60%甲醇、80%甲醇和甲醇等不同提取溶劑進行考察，結果表明，采用甲醇為溶劑提取效果最好。

3.2 檢測波長的選擇

采用紫外全波長光譜掃描得到AP最大吸收波長在225 nm處，DAP最大吸收波長在254 nm處，選用其中任意一個波長，另一組分響應值都較低，因此選定雙波長法對樣品進行測定。

3.3 樣品質(zhì)量評價

中成藥是通過整體作用而發(fā)揮療效，因此生產(chǎn)中需盡可能關注所有成分的變化情況，而不是僅僅關注質(zhì)量標準中測定的指標成分。此次樣品測定結果表明，企業(yè)只關注了法定標準中規(guī)定的DAP含量，未關注AP含量，而AP穩(wěn)定性較差，在提取過程中易降解[8]，文獻報道通過合適的工藝參數(shù)可有效提高AP的轉(zhuǎn)移率[9-10]，因此企業(yè)需優(yōu)化工藝參數(shù)，保證AP與DAP的轉(zhuǎn)移率。

3.4 意義

鑒于中藥的特殊性，采用何種方法對其質(zhì)量進行評價，是目前行業(yè)內(nèi)亟須解決的關鍵問題[11-12]。雖然多成分的含量測定技術并不足以對產(chǎn)品不同批次質(zhì)量的一致性進行科學全面的評價，但在實際生產(chǎn)過程中，廠家可以通過對這2種主要成分含量變化的關注，快速、科學地評價產(chǎn)品質(zhì)量。另外，本研究對穿心蓮膠囊的質(zhì)量標準的提高也具有重要意義。