不同企業(yè)雷公藤多苷片的制劑質(zhì)量比較與評(píng)價(jià)△

汪祺，王亞丹，鄭笑為，文海若，馬雙成

中國(guó)食品藥品檢定研究院，北京 100050

雷公藤為衛(wèi)矛科雷公藤屬植物，藥用部位多為其干燥根[1]。其具有祛風(fēng)除濕、活血通絡(luò)、殺蟲解毒等功效，臨床應(yīng)用范圍較廣，適應(yīng)癥包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、銀屑病、紅斑狼瘡及器官移植后作為免疫抑制劑使用[2-5]。雷公藤主要化學(xué)成分包括萜類，其中對(duì)二萜成分雷公藤甲素和三萜成分雷公藤紅素藥理研究較多，其被認(rèn)為是雷公藤的主要藥效成分；此外，雷公藤還含有倍半萜生物堿、倍半萜多醇酯及木脂素等[6-13]。隨著雷公藤制劑的廣泛使用，其臨床不良反應(yīng)及毒性逐漸凸顯，主要表現(xiàn)為肝、腎毒性、血液系統(tǒng)及生殖系統(tǒng)損害。有研究顯示，雷公藤甲素及雷公藤紅素為其主要藥效及毒性成分[14-15]。有研究針對(duì)不同廠家雷公藤多苷片制劑進(jìn)行了指紋圖譜及小鼠體內(nèi)抗炎藥效、毒性比較研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，7個(gè)廠家的雷公藤多苷片化學(xué)成分差異顯著，同時(shí)抗炎藥效及肝腎毒性方面也存在較大差異。因此控制制劑質(zhì)量，使其發(fā)揮藥效的同時(shí)避免不良反應(yīng)發(fā)生成為雷公藤制劑質(zhì)控亟待解決的問題[16]。

本研究依托國(guó)家藥品評(píng)價(jià)抽驗(yàn)工作，對(duì)全部雷公藤多苷片現(xiàn)行生產(chǎn)企業(yè)進(jìn)行抽樣測(cè)定，共涉及10個(gè)企業(yè)171批次樣品，實(shí)驗(yàn)采取標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)與探索性研究相結(jié)合的方法，首先對(duì)雷公藤多苷片質(zhì)量進(jìn)行整體評(píng)價(jià)，并發(fā)現(xiàn)該品種存在的問題；其次進(jìn)行體外毒性實(shí)驗(yàn)，對(duì)制劑中含量較高的單體成分進(jìn)行肝毒性考察，旨在為進(jìn)一步完善該制劑安全性標(biāo)準(zhǔn)提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料

1.1 儀器

Waters 2695-2996 PDA型液相色譜系統(tǒng)；薄層色譜自動(dòng)點(diǎn)樣儀(卡瑪公司)；ZBS-6E型智能崩解試驗(yàn)儀(天津市精拓儀器科技有限公司)；VICTOR X5型多功能酶標(biāo)儀(PerkinElmer)。

1.2 試藥

雷公藤甲素對(duì)照品(批號(hào)：111567-201404，純度：99.8%)、雷公藤紅素對(duì)照品(批號(hào)：111946-201501，純度：97.0%)、雷公藤內(nèi)酯甲對(duì)照品(批號(hào)：111597-200505，純度：100%)購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；對(duì)琨B(純度>98%)為中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所贈(zèng)送；雷公藤次堿(批號(hào)：PL0078，純度≥98.5%)、雷公藤春堿(批號(hào)：PL0077，純度≥98.5%)、雷公藤晉堿(批號(hào)：PL0080，純度≥99%)購(gòu)自成都普利斯生物科技有限公司；二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO，Sigma)；RPMI 1640培養(yǎng)基(Hyclone)；1%青鏈霉素混合液(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司)；胰蛋白酶-EDTA消化液(Life Technologies)；胎牛血清(FBS,Gibco)；細(xì)胞增殖-毒性檢測(cè)試劑盒/CCK-8(日本同仁化學(xué)研究所)；中性氧化鋁(Agela Technologies，200目)；雷公藤多苷片(來自10個(gè)企業(yè)共171批次，企業(yè)分別用A～J代表)；乙酸乙酯(分析純，北京化學(xué)試劑廠)；乙腈、甲醇均為色譜純(Fisher公司)。

2 方法

2.1 崩解時(shí)限考察

按《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版一部附錄Ⅻ A 崩解時(shí)限檢查法測(cè)定171批次雷公藤多苷片崩解時(shí)間，標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定供試品應(yīng)在1 h內(nèi)全部崩解。

2.2 薄層鑒別

參照國(guó)家藥品監(jiān)督管理局頒標(biāo)準(zhǔn)(WS3-B-3350-98-2011)項(xiàng)下雷公藤內(nèi)酯甲薄層檢查，制備質(zhì)量濃度為1 mg·mL-1的雷公藤內(nèi)酯甲對(duì)照品溶液。供試品溶液制備方法詳見標(biāo)準(zhǔn)。以環(huán)己烷-丙酮(5∶3)為展開劑展開，10%硫酸乙醇溶液顯色，105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰[17]。

2.3 雷公藤甲素檢查

取雷公藤甲素適量，精密稱定，加甲醇制成0.05 mg·mL-1的對(duì)照品溶液；供試品溶液同[雷公藤內(nèi)酯甲含量測(cè)定]項(xiàng)下供試品溶液制備方法，分別精密吸取對(duì)照品及供試品溶液各10 μL測(cè)定，以甲醇-水(43∶57)為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)為218 nm[17]。

2.4 雷公藤內(nèi)酯甲含量測(cè)定

參照國(guó)家藥品監(jiān)督管理局頒標(biāo)準(zhǔn)(WS3-B-3350-98-2011)項(xiàng)下雷公藤內(nèi)酯甲含量測(cè)定項(xiàng)，取雷公藤內(nèi)酯甲適量，甲醇溶解配制每1 mL含0.1 mg的對(duì)照品溶液；供試品溶液制備方法：雷公藤多苷片乙酸乙酯提取后經(jīng)中性氧化鋁處理，收集洗脫液，最終定容至5 mL量瓶。取對(duì)照品及供試品溶液各10 μL測(cè)定，以甲醇-乙腈-水(64∶16∶20)為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm[17]。

2.5 體外肝細(xì)胞毒性研究

將HepaRG細(xì)胞接種于75 mL培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，以RPMI 1640完全培養(yǎng)基(含10%FBS和1%青鏈霉素混合液)于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。培養(yǎng)基隔天更換，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，覆蓋瓶底80%～90%時(shí)，用胰蛋白酶-EDTA消化液消化，并調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個(gè)/mL。在96孔板中接種細(xì)胞懸液，每孔100 μL，置于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后更換含不同濃度藥物的培養(yǎng)液。雷公藤甲素、雷公藤內(nèi)酯甲給藥濃度分別為5、10、20、40、80、160、320 nmol·L-1，雷公藤紅素給藥濃度分別為0.15、0.3、0.6、1.2、2.4、4.8、9.6 μmol·L-1，對(duì)琨B給藥濃度分別為2.5、5、10、20、40、80、160 μmol·L-1，雷公藤春堿、雷公藤次堿、雷公藤晉堿給藥濃度均分別為5、10、20、40、80、160、320 μmol·L-1，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)0.5%DMSO作為溶媒對(duì)照，設(shè)不含細(xì)胞的培養(yǎng)基作為空白對(duì)照。給藥后在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育24 h，向每孔加入10 μL CCK-8溶液后在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1～4 h，用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處的吸光度值并計(jì)算細(xì)胞存活率。

(1)

3 結(jié)果

3.1 崩解時(shí)限檢查結(jié)果

按標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)所有樣品崩解時(shí)限(1 h)均符合規(guī)定，但不同企業(yè)間崩解時(shí)間差異顯著，部分企業(yè)樣品崩解時(shí)間不足1 min，而導(dǎo)致崩解時(shí)間差異顯著的主要原因?yàn)橹苿┕に嚥唤y(tǒng)一。結(jié)果見表1。

表1 10個(gè)不同企業(yè)來源的雷公藤多苷片的崩解時(shí)間

3.2 薄層鑒別檢查結(jié)果

按標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行薄層檢查(見圖1)，171批次樣品均可檢出雷公藤內(nèi)酯甲相對(duì)應(yīng)斑點(diǎn)，但現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中對(duì)照品配制濃度與樣品中雷公藤內(nèi)酯甲實(shí)際含量相差較大，建議調(diào)整該標(biāo)準(zhǔn)中對(duì)照品使用濃度。

注：1～8、10～20.10個(gè)企業(yè)中隨機(jī)抽取樣品各1個(gè)批次；9.雷公藤內(nèi)酯甲對(duì)照品。圖1 雷公藤多苷片薄層鑒別

3.3 雷公藤甲素檢查結(jié)果

10個(gè)企業(yè)隨機(jī)抽取1個(gè)批次樣品進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見圖2。液相色譜圖顯示，不同企業(yè)間雷公藤多苷片所含化學(xué)成分存在明顯差異；此外通過對(duì)171批次樣品測(cè)定發(fā)現(xiàn)(見表2、圖2)，雖然10個(gè)企業(yè)雷公藤甲素含量均符合標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，每片含雷公藤甲素不超過10 μg，但不同企業(yè)及相同企業(yè)不同批次間，雷公藤甲素含量差異顯著，部分企業(yè)甚至未檢出雷公藤甲素。提示，作為已被證明為藥效成分的雷公藤甲素除規(guī)定上限外，同時(shí)應(yīng)對(duì)含量下限進(jìn)行明確規(guī)定。

注：10個(gè)企業(yè)隨機(jī)取1批進(jìn)行測(cè)定。圖2 雷公藤多苷片中雷公藤甲素液相色譜圖

表2 10個(gè)不同企業(yè)來源的雷公藤多苷片中的雷公藤甲素含量

3.4 雷公藤內(nèi)酯甲含量測(cè)定結(jié)果

10個(gè)企業(yè)隨機(jī)抽取1批次樣品進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見圖3、表3。液相色譜圖顯示，不同企業(yè)間雷公藤多苷片所含成分存在明顯差異。通過對(duì)171批次樣品測(cè)定發(fā)現(xiàn)，10個(gè)企業(yè)雷公藤內(nèi)酯甲含量均符合標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，每片含雷公藤內(nèi)酯甲不少于10 μg，然而不同企業(yè)間，雷公藤內(nèi)酯甲含量11～62 μg/片，同一企業(yè)不同批次間含量19～62 μg/片，可見質(zhì)控指標(biāo)雷公藤內(nèi)酯甲含量波動(dòng)范圍大，存在產(chǎn)品質(zhì)量整體不穩(wěn)定的情況。

注：10個(gè)企業(yè)隨機(jī)取1批進(jìn)行測(cè)定。圖3 雷公藤多苷片中雷公藤內(nèi)酯甲液相色譜圖

表3 10個(gè)企業(yè)雷公藤多苷片中雷公藤內(nèi)酯甲含量情況

3.5 體外細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)

雷公藤多苷片現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)控制的指標(biāo)成分主要為雷公藤內(nèi)酯甲及雷公藤甲素，10個(gè)企業(yè)171批次樣品中雷公藤內(nèi)酯甲含量范圍分布差異較大，而已有明確毒性報(bào)道的雷公藤甲素在制劑中含量普遍較低，部分企業(yè)甚至不含雷公藤甲素，因此提示雷公藤多苷片不良反應(yīng)的原因是否為其他成分導(dǎo)致。查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，雷公藤多苷片中雷公藤紅素也具有藥效作用且含量較高，此外生物堿類成分約占其總提取物的30%，而此類成分以往研究較少，因此針對(duì)這一類含量高或具有藥效作用的成分進(jìn)行體外細(xì)胞毒性考察，可初步推測(cè)其潛在毒性風(fēng)險(xiǎn)，為形成制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供數(shù)據(jù)支持。實(shí)驗(yàn)選取雷公藤甲素、雷公藤內(nèi)酯甲、雷公藤紅素、對(duì)琨B及具有結(jié)構(gòu)代表性的生物堿雷公藤春堿、雷公藤次堿、雷公藤晉堿進(jìn)行體外毒性考察。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果以細(xì)胞存活率及半數(shù)抑制濃度(IC50)值為評(píng)價(jià)指標(biāo)，考察待測(cè)單體的潛在毒性作用，結(jié)果見圖4、表4。分析數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，雷公藤甲素(IC50為0.015 μmol·L-1)及對(duì)琨B(IC50為0.10 μmol·L-1)毒性強(qiáng)，雷公藤紅素(IC50為5.73 μmol·L-1)次之，4個(gè)生物堿單體成分幾乎沒有毒性作用，因此提示，除雷公藤甲素外，應(yīng)增加制劑中對(duì)琨B及雷公藤紅素的含量限度控制。相反，生物堿類成分含量高，無明顯毒性作用，因此其是否具有藥效作用值得進(jìn)一步研究。

注：a.雷公藤甲素；b.雷公藤紅素；c.雷公藤內(nèi)酯甲；d.雷公藤春堿；e.雷公藤次堿；f.雷公藤晉堿；g.對(duì)琨B。圖4 雷公藤藥材不同單體體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

表4 雷公藤藥材中不同單體的體外細(xì)胞毒性結(jié)果 μmol·L-1

4 討論與結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)，雷公藤多苷片制劑不同企業(yè)及相同企業(yè)不同批次間樣品崩解時(shí)限差異大，雷公藤甲素及雷公藤內(nèi)酯甲含量相差懸殊，雷公藤內(nèi)酯甲含量測(cè)定結(jié)果顯示，該成分含量11～62 μg/片，提示該產(chǎn)品整體質(zhì)量不穩(wěn)定。

目前，雷公藤多苷片制劑原料均由制劑廠家自行制備，無統(tǒng)一生產(chǎn)工藝，制備雷公藤總苷涉及柱層析環(huán)節(jié)，而吸附劑用量、洗脫溶劑、組分收集等方面各企業(yè)不盡相同，由此導(dǎo)致制劑崩解時(shí)間相差懸殊，化學(xué)成分含量相差較大，在臨床上則表現(xiàn)為療效和毒副作用的差異?，F(xiàn)代藥理研究表明，不同生產(chǎn)企業(yè)雷公藤多苷片制劑在抗炎藥效方面不同[16]。此外，6個(gè)不同企業(yè)雷公藤多苷片小鼠肝毒性研究發(fā)現(xiàn)，不同企業(yè)生產(chǎn)的雷公藤多苷片，對(duì)于小鼠肝系數(shù)、血清生化及肝組織中丙二醛(MDA)值影響作用差異顯著，提示質(zhì)量差異與其臨床不良反應(yīng)也具有明顯相關(guān)性[18]。因此控制制劑質(zhì)量，使其發(fā)揮藥效的同時(shí)避免不良反應(yīng)發(fā)生成為雷公藤制劑質(zhì)控亟待解決的問題。提高雷公藤多苷片制劑質(zhì)量，首先要統(tǒng)一該制劑生產(chǎn)工藝，其次建立合理的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。本研究發(fā)現(xiàn)，雷公藤多苷片現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)存在如下問題：薄層鑒別與含量測(cè)定項(xiàng)重復(fù)設(shè)定，且薄層鑒別對(duì)照品溶液濃度與制劑中雷公藤內(nèi)酯甲含量差異大，不利于實(shí)驗(yàn)結(jié)果判定；雷公藤甲素含量檢查僅設(shè)置上限，而部分企業(yè)樣品未檢出該成分，因此建議增加下限檢查。其次，針對(duì)其不良反應(yīng)的發(fā)生，本研究體外毒性實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，對(duì)琨B及雷公藤紅素為潛在毒性成分，含量較高的生物堿可能為一類毒性低同時(shí)具有藥效的活性成分，因此建議進(jìn)一步考察其藥效并增設(shè)控制指標(biāo)。