茯苓抑制小腸收縮的作用機(jī)制△

肖洪賀，張明波，郭周全，楊靜嫻

遼寧中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，遼寧 大連 116600

茯苓為多孔菌科真菌茯苓Poriacocos(Schw.) Wolf的干燥菌核，具有利水滲濕、健脾、寧心等功效。茯苓性平，味甘淡，既能健脾，又能滲濕，常與人參、白術(shù)、甘草等配伍，治療脾虛運(yùn)化失常所致泄瀉，如健脾丸、參苓白術(shù)散、四君子湯等健脾類方劑中均配有茯苓[1-3]。本課題組前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，茯苓提取物能抑制乙酰膽堿刺激的離體小腸痙攣性收縮，并且能有效緩解新斯的明誘導(dǎo)的小鼠胃腸功能亢進(jìn)[4]，但茯苓抑制小腸收縮的作用機(jī)制尚不明確，且未見國(guó)內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。

分子對(duì)接(molecular docking)是一種利用計(jì)算機(jī)模擬配體(蛋白質(zhì)、DNA/RNA、小分子)與受體生物大分子相互結(jié)合，根據(jù)計(jì)算得出的物理化學(xué)參數(shù)來預(yù)測(cè)其結(jié)合模式及親合力的方法[5]。利用分子對(duì)接技術(shù)可以從化合物庫中篩選出具有一定生物活性的候選化合物，特別適合從中藥復(fù)雜成分中篩選出可能的有效成分，進(jìn)而從分子層面揭示中藥的物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制[6]。

本實(shí)驗(yàn)采用離體小腸灌流技術(shù)，觀察茯苓對(duì)小鼠離體小腸自發(fā)收縮以及不同工具藥刺激下的小腸收縮的拮抗作用，并比較阻斷M受體前后茯苓抑制小腸收縮作用的差異；利用分子對(duì)接技術(shù)將茯苓中33個(gè)化合物與M受體進(jìn)行對(duì)接打分，篩選得到能夠結(jié)合M受體的有效成分，進(jìn)而從分子層面分析茯苓抑制小腸收縮的作用機(jī)制及主要活性成分，為茯苓健脾功效的研究與應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 試藥

茯苓購自河北亞寶藥業(yè)有限公司，產(chǎn)地云南，經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)康廷國(guó)教授鑒定為多孔菌科真菌茯苓P.cocos(Schw.) Wolf的干燥菌核。

氯化乙酰膽堿(acetylcholine，Ach，上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批號(hào)：A111014)；硫酸阿托品(atropine，上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批號(hào)：A109524)；無水乙醇(分析純，南京化學(xué)試劑有限公司)；聚山梨酯-80(南京化學(xué)試劑有限公司)；氯化鋇(BaCl2)和氯化鈣(CaCl2)均為分析純。

1.2 儀器

RM6240B型多道生理信號(hào)采集系統(tǒng)(成都儀器廠)；電熱套(北京市永光明醫(yī)療儀器廠)；501型恒溫水浴鍋(金壇市白塔新寶儀器廠)；JJ224BC型分析天平(常熟市雙杰測(cè)試儀器廠)；DFT-50型中藥粉碎機(jī)(溫嶺市林大機(jī)械有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雄性昆明種小鼠，體質(zhì)量18～22 g，購自遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)有限公司，合格證號(hào)：SCXK(遼)2015-0001。

2 方法

2.1 茯苓提取液的制備

茯苓飲片粉碎，過60目篩，稱取80 g，加8倍量50%乙醇溶液，浸泡1 h，回流1 h，趁熱抽濾，濾渣加6倍量50%乙醇溶液，回流1 h，趁熱抽濾，合并2次濾液，60 ℃水浴濃縮，以2%的聚山梨酯-80水溶液配成2 g·mL-1的茯苓提取液(按生藥量計(jì)算)，-20 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 腸管標(biāo)本的制備與收縮曲線記錄

參照文獻(xiàn)方法[7]，小鼠禁食12 h(自由飲水)，脫頸處死后迅速剪開腹腔，剪取回腸部位腸段，剝離腸系膜后按1 cm長(zhǎng)度剪成數(shù)段，臺(tái)氏液清洗內(nèi)容物，兩端穿線，置于盛有80 mL臺(tái)氏液的麥?zhǔn)显〔壑校欢诉B于接張力換能器，一端固定于L形通氣鉤，溫度控制在(37±0.2)℃，持續(xù)通入空氣。設(shè)置腸管預(yù)負(fù)荷1～1.5 g，待恢復(fù)自發(fā)收縮后，將收縮曲線波谷調(diào)至基線，記錄自發(fā)收縮曲線5 min。

2.3 茯苓對(duì)小鼠離體小腸自發(fā)活動(dòng)的影響

記錄自發(fā)收縮曲線后，分別依次加入茯苓提取液20、20、40、80、160、320、640 μL，每個(gè)濃度作用5 min，記錄收縮曲線，溶媒組加入等體積2%聚山梨酯-80，根據(jù)公式(1)計(jì)算平均肌張力抑制率，平均肌張力即為收縮波形曲線下面積[8]。

平均肌張力抑制率=(茯苓給藥后的平均肌張力-
自發(fā)收縮時(shí)的平均肌張力)/
自發(fā)收縮時(shí)的平均肌張力×100%

(1)

2.4 茯苓對(duì)Ach、BaCl2和CaCl2刺激下的離體小腸收縮的影響

記錄自發(fā)收縮曲線后，分別加入Ach(終濃度為7.5×10-7mol·L-1)、BaCl2(終濃度為1.56×10-4mol·L-1)、CaCl2(終濃度為1.39×10-5mol·L-1)，作用10 min后，分別依次加入茯苓提取液20、20、40、80、160、320、640 μL，每個(gè)濃度作用5 min，記錄收縮曲線，根據(jù)公式(2)計(jì)算平均肌張力抑制率。CaCl2組采用無鈣臺(tái)氏液，溶媒組加入等體積2% TW-80水溶液。

平均肌張力抑制率=(工具藥刺激后的平均肌張力-
茯苓給藥后的平均肌張力)/
工具藥刺激后的平均肌張力×100%

(2)

2.5 M受體對(duì)茯苓抑制離體小腸收縮的影響

記錄自發(fā)收縮曲線后，加入硫酸阿托品(終濃度為8.69×10-6mol·L-1)孵育5 min以阻斷M受體，然后加入Ach(終濃度為7.5×10-7mol·L-1)使腸管收縮，作用10 min后，依次加入茯苓提取液20、20、40、80、160、320、640 μL，每個(gè)濃度作用5 min，記錄腸管收縮曲線，計(jì)算平均肌張力抑制率，比較阻斷M受體前后茯苓拮抗小腸收縮的作用差異。

2.6 茯苓所含化學(xué)成分與M受體的分子對(duì)接

查閱文獻(xiàn)收集得到茯苓中33個(gè)化學(xué)成分，利用Chemdraw畫出結(jié)構(gòu)式，利用Chem3D將結(jié)構(gòu)式轉(zhuǎn)換成為三維結(jié)構(gòu)，采用MM2力場(chǎng)對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化，借助Autodock Tool將33個(gè)化合物加氫、加電荷后轉(zhuǎn)成Autodock文件(pqbqt)格式，建立可供篩選的化合物數(shù)據(jù)庫。從PDB數(shù)據(jù)庫下載M受體的結(jié)構(gòu)文件(ID為3UON)[9]，利用Discovery Studio從蛋白晶體復(fù)合物中提取原配體分子，配體分子和受體大分子分別進(jìn)行加極性氫、賦予電荷，采用Autodock Vina V1.1.2 軟件將M受體與原配體重新對(duì)接，Grid box范圍設(shè)定為28 nm×28 nm×28 nm，中心坐標(biāo)為(X：8.73，Y：-0.02，Z：-3.06)。采用Autodock Vina V1.1.2對(duì)茯苓中33個(gè)化合物和M受體進(jìn)行虛擬對(duì)接，對(duì)接過程中，只改變配體的構(gòu)象，而保持蛋白構(gòu)象不變，其余所有參數(shù)均采用默認(rèn)值。另外選取4個(gè)M受體拮抗劑作為陽性對(duì)照進(jìn)行對(duì)接打分，名稱及結(jié)構(gòu)見圖1。

圖1 M受體拮抗劑的名稱及結(jié)構(gòu)式

3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

4 結(jié)果

4.1 茯苓對(duì)小鼠離體小腸自發(fā)活動(dòng)的影響

如圖2A所示，離體腸管經(jīng)過10～15 min后恢復(fù)自發(fā)收縮，呈現(xiàn)良好的節(jié)律性。累積加入溶媒持續(xù)作用60 min，仍保持良好的活性，腸管活力與實(shí)驗(yàn)開始時(shí)無明顯減弱，說明本實(shí)驗(yàn)方法可靠。如圖2B所示，腸管恢復(fù)自發(fā)性收縮后，累積加入0.5～32 g·L-1茯苓提取液，腸管收縮基線逐漸降低，收縮幅度逐漸減小，平均肌張力(即收縮曲線下面積)逐漸降低，并呈現(xiàn)劑量依賴性關(guān)系。當(dāng)茯苓質(zhì)量濃度增至32 g·L-1時(shí)，平均肌張力抑制率達(dá)到(181.92±47.75)%(見圖3)，說明茯苓能夠顯著抑制小腸自發(fā)性收縮。

注：A.溶媒組；B.茯苓組。圖2 茯苓對(duì)離體小腸自發(fā)活動(dòng)波形的影響

注：與2%聚山梨酯-80組比較，**P<0.01。圖3 茯苓對(duì)離體小腸自發(fā)活動(dòng)平均肌張力的影響

4.2 茯苓對(duì)Ach、BaCl2和CaCl2所致的離體小腸痙攣性收縮的影響

如圖4所示，恢復(fù)自發(fā)收縮的離體腸管，在給予Ach、BaCl2或CaCl2后，小腸收縮波形基線明顯抬高，給予0.5～32 g·L-1的茯苓提取液可明顯降低波形基線，并劑量依賴性抑制小腸平均肌張力，與溶媒組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01，見圖5)，說明茯苓能夠有效抑制Ach、BaCl2或CaCl2引起的小鼠離體小腸痙攣性收縮，而對(duì)Ach的抑制作用最強(qiáng)，所以后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇M受體進(jìn)行研究。

注：A.Ach組；B.BaCl2組；C.CaCl2組。圖4 茯苓對(duì)Ach、BaCl2和CaCl2所致的離體小腸痙攣性收縮波形的影響

注：與2%聚山梨酯-80組比較，*P<0.05，**P<0.01。圖5 茯苓對(duì)Ach、BaCl2和CaCl2所致的離體小腸痙攣性收縮平均肌張力的影響

4.3 M受體對(duì)茯苓抑制離體小腸收縮的影響

小鼠離體小腸恢復(fù)自發(fā)收縮后，給予Ach刺激，收縮基線立即抬高，小腸呈現(xiàn)痙攣性收縮；給予茯苓后，小腸的收縮幅度和收縮基線迅速降低。事先給予硫酸阿托品阻斷M受體，茯苓對(duì)小腸收縮的抑制作用明顯減弱(見圖6)，與未給予硫酸阿托品的Ach+茯苓組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見圖7)，說明茯苓抑制小腸收縮的作用與M受體有關(guān)。

注：A.溶媒組；B.Ach+茯苓組；C.Atropine+Ach+茯苓組。圖6 M受體對(duì)茯苓抑制離體小腸收縮波形的影響

注：與2%聚山梨酯-80組比較，*P<0.05,**P<0.01;與Ach+茯苓組比較，#P<0.05,##P<0.01。圖7 M受體對(duì)茯苓抑制離體小腸平均肌張力的影響

4.4 茯苓成分與M受體對(duì)接的結(jié)果

茯苓中的齒孔酸、松苓酸A、3-氫化松苓酸、麥角甾醇等成分能夠與M受體結(jié)合，結(jié)合能分別為-9.3、-9.2、-9.1、-8.6 kcal·mol-1，均低于M受體阻滯劑阿托品、異丙托溴銨、哌侖西平、托特羅定與M受體的結(jié)合能，說明茯苓中的活性成分能夠與M受體結(jié)合，阻斷M受體的生物學(xué)功能(見表1)。齒孔酸、松苓酸A和3-氫化松苓酸與M受體主要以

表1 茯苓33個(gè)成分及M受體阻滯劑與M受體的結(jié)合能力 kcal·mol-1

注：A、B.齒孔酸；C、D.松苓酸A；E、F.3-氫化松苓酸。圖8 茯苓代表性成分與M受體相互作用

氫鍵和疏水作用結(jié)合(見圖8)。齒孔酸與M受體的TYR83形成氫鍵，與TRP422、PHE181形成疏水作用(見圖8A～B)；松苓酸A與M受體的THR187形成氫鍵，與TRP422、TRP99、TYR426、TYR177、LEUA100形成疏水作用(見圖8C～D)；3-氫化松苓酸與M受體主要以氫鍵和疏水作用結(jié)合，與M受體的TYR83、ASN491、PHE181形成氫鍵，與TRP422、TRP426和TYR80形成疏水作用(見圖8E～F)。

5 討論

胃腸動(dòng)力的異常能夠引起許多胃腸疾病，如最常見的功能性胃腸道疾病——腸易激綜合征(irritable bowel syndrome，IBS)。IBS患者的內(nèi)臟靈敏性異常升高，腦腸肽水平也處于異常狀態(tài)[10]。腹瀉型IBS患者小腸轉(zhuǎn)運(yùn)速度過快，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)來不及吸收就被轉(zhuǎn)運(yùn)至結(jié)腸，導(dǎo)致結(jié)腸內(nèi)產(chǎn)氣增加；而便秘型IBS患者小腸運(yùn)轉(zhuǎn)速度過慢，水分被過度吸收而致便秘[11]。所以調(diào)節(jié)小腸蠕動(dòng)功能，有可能是治療腹瀉型IBS的有效途徑。

小腸的蠕動(dòng)依賴于小腸平滑肌的電生理活動(dòng)。動(dòng)作電位直接引起平滑肌的收縮，慢波電位本身不引起收縮，但是可以引發(fā)動(dòng)作電位，進(jìn)而調(diào)控平滑肌的收縮節(jié)律和運(yùn)動(dòng)功能[12]。小腸平滑肌的運(yùn)動(dòng)受到神經(jīng)和體液的調(diào)節(jié)，其中膽堿能神經(jīng)元及相應(yīng)受體對(duì)胃腸活動(dòng)的調(diào)節(jié)作用至關(guān)重要。內(nèi)源性神經(jīng)遞質(zhì)Ach能夠激活小腸平滑肌的M膽堿能受體，使胞內(nèi)三磷酸肌醇(IP3)和二?；视?DG)水平升高。IP3作為第二信使與IP3受體結(jié)合，使肌質(zhì)網(wǎng)內(nèi)貯存的高濃度Ca2+迅速釋放到胞漿中，進(jìn)而啟動(dòng)平滑肌興奮-收縮偶聯(lián)，引起平滑肌收縮。此外，胃腸平滑肌上還存在組胺和5-羥色胺等受體，以及鈣離子通道、鉀離子通道和鈉離子通道，共同調(diào)節(jié)胃腸平滑肌的動(dòng)力功能[13-16]。

茯苓是常見的健脾利濕中藥，其健脾作用多與調(diào)節(jié)胃腸道蠕動(dòng)功能有關(guān)。已有研究表明，茯苓水提液能夠抑制正常小鼠胃排空和小腸推進(jìn)[17]，茯苓粗提物能夠舒張家兔離體空腸和盲腸[18]。離體灌流結(jié)果顯示，茯苓提取液能夠濃度依賴性地抑制小鼠小腸自主收縮，并顯著抑制Ach引起的小腸痙攣性收縮；當(dāng)腸管經(jīng)M受體阻滯劑阿托品孵育后，茯苓抑制小腸收縮的作用明顯減弱，與無阿托品孵育組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明茯苓需要通過與M受體相互作用才能有效地抑制小腸收縮。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證茯苓與M受體的相互作用，本研究采用分子對(duì)接技術(shù)對(duì)茯苓中含有的成分與M受體進(jìn)行虛擬對(duì)接。分子對(duì)接結(jié)果顯示，茯苓中含有大量能夠與M受體結(jié)合的成分，其中齒孔酸、松苓酸A、3-氫化松苓酸、麥角甾醇、去氫齒孔酮酸與M受體結(jié)合的自由能均低于阿托品、異丙托溴銨等M受體阻滯劑，說明茯苓具備阻斷M受體的物質(zhì)基礎(chǔ)，并且這些能夠與M受體結(jié)合的化合物可能是茯苓抑制小腸收縮的主要活性成分。

此外，本研究發(fā)現(xiàn)，茯苓還能一定程度上抑制BaCl2和CaCl2引起的小腸痙攣性收縮。BaCl2是平滑肌內(nèi)向整流鉀通道阻滯劑，能夠通過阻斷內(nèi)向整流鉀通道引起細(xì)胞膜去極化，激活電壓依賴性Ca2+通道，使胞外Ca2+進(jìn)入胞內(nèi)，導(dǎo)致平滑肌收縮[19-21]。茯苓能夠抑制BaCl2、CaCl2引起的小腸痙攣性收縮，說明茯苓除了能阻斷M受體外，還能通過調(diào)節(jié)鉀通道和鈣通道活性而發(fā)揮舒張小腸平滑肌的作用，這也契合了中藥多成分、多靶點(diǎn)、多途徑的作用特點(diǎn)。

綜上，本研究結(jié)合小腸灌流技術(shù)和分子對(duì)接技術(shù)，考察了茯苓對(duì)離體小腸收縮抑制作用及其機(jī)制，發(fā)現(xiàn)茯苓能夠通過抑制M受體，并調(diào)節(jié)鉀通道和鈣通道抑制小腸的自發(fā)收縮和痙攣性收縮；齒孔酸、松苓酸A、3-氫化松苓酸、麥角甾醇、去氫齒孔酮酸能夠與M受體結(jié)合，可能是茯苓阻斷M受體、抑制小腸收縮的主要活性成分。本研究為茯苓的健脾活性及治療IBS等胃腸道疾病的應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，關(guān)于茯苓調(diào)節(jié)鉀通道和鈣通道的具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。