不同規(guī)格平貝母止咳祛痰抗炎的藥效研究△

趙倩，李波，沈瑩，孟祥才

黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040

平貝母為百合科植物平貝母FritillariaussuriensisMaxim.的干燥鱗莖，主要分布在我國黑龍江、吉林、遼寧3省，20世紀(jì)60年代以前曾為川貝母的偽品[1]。經(jīng)研究證明，平貝母具有良好的止咳、祛痰、抗炎作用[2]，《中華人民共和國藥典》2010年版開始收錄，現(xiàn)已成為東北的道地藥材。隨著平貝母的栽培技術(shù)不斷成熟，其種植面積不斷擴(kuò)大，成為常用藥材之一。

平貝母通常采用不同大小的鱗莖進(jìn)行無性繁殖，不同大小的鱗莖均可入藥。小貝母是2～3年生植株，此期間為營養(yǎng)生長期，只產(chǎn)生分化的葉，鱗莖明顯增大；中貝母是4～5年生植株，地上部分開始抽莖，但通常不能開花結(jié)實(shí)；大貝母是開花結(jié)果植株，此期間葉片光合作用產(chǎn)生的大量營養(yǎng)物質(zhì)用于地上莖的生長和花果的生長，必然影響地下鱗莖的生長發(fā)育和代謝。因此，不同生長年限平貝母的質(zhì)量可能存在差異。貝母商品價格也存在較大差異，小粒平貝母不僅流通較快，而且價格幾乎是中粒和大粒的2倍[3-4]，然而目前平貝母大小規(guī)格與質(zhì)量的關(guān)系并不明確。本研究通過評價平貝母止咳、祛痰、抗炎等主要藥效指標(biāo)，對3種規(guī)格的平貝母進(jìn)行比較，以期為合理評價平貝母藥材質(zhì)量提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

雄性SPF級昆明種小鼠由遼寧省實(shí)驗(yàn)動物資源中心遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司提供，動物質(zhì)量合格證號：SCXK(黑)2016-004，體質(zhì)量(20±2)g。動物飼養(yǎng)于恒溫(22 ℃)、相對濕度為50%的動物房中。

1.2 試藥

平貝母于2019年6月1日采自黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥用植物園，經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)孟祥才教授鑒定為百合科貝母屬植物平貝母F.ussuriensisMaxim.。氫溴酸右美沙芬糖漿(江西藥都仁和制藥有限公司，批號：H20073933)；鹽酸氨溴索口服溶液(華潤三九藥業(yè)有限公司，批號：H20103009)；醋酸地塞米松片(百正藥業(yè)股份有限公司，批號：H41022763)；苯酚紅、氨水、二甲苯(天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司)；碳酸氫鈉(天津博迪化工股份有限公司)。

1.3 儀器

VICTOR X3型酶標(biāo)儀(美國PerkinElmer公司)；AG135型電子分析天平(瑞士Metter Toledo公司)；KQ-250DB型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市舒美超聲儀器有限公司)；Julabo TW20型數(shù)顯恒溫水浴鍋(德國Julabo有限公司)；KDC-160HR型高速低溫離心機(jī)(合肥科大創(chuàng)新有限公司)。

2 方法

2.1 藥品制備

大粒平貝母為6年生鱗莖(直徑190 mm左右)，中粒平貝母為4～5年生鱗莖(直徑140 mm左右)，小粒平貝母為2～3年生鱗莖(直徑110 mm左右)。將不同規(guī)格平貝母分別打成粉末，過四號篩，稱取粉末10.0 g，于7倍量75%乙醇中浸泡2 h，加熱回流提取3 次，1.5 h/次，濾過，合并濾液于60 ℃下減壓濃縮，用0.9%氯化鈉溶液稀釋為0.2 g·mL-1(以生藥量計)的藥液[5]。紫外分光光度法于412 nm處檢測，得大、中、小粒平貝母總生物堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.224%、0.217%和0.251%。

2.2 止咳實(shí)驗(yàn)

選取體質(zhì)量為(20±2)g的小鼠50只，按體質(zhì)量隨機(jī)分為模型組、陽性對照氫溴酸右美沙芬組、大貝母組、中貝母組和小貝母組。適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，模型組給予0.9%氯化鈉溶液，氫溴酸右美沙芬組給予0.011 7 g·kg-1的氫溴酸右美沙芬溶液，不同規(guī)格貝母組按2.0 g生藥/kg的劑量給予醇提取物，各組均按0.2 mL·g-1灌胃給藥，連續(xù)灌胃給藥5 d，每天給藥1次。末次給藥后1 h后，進(jìn)行氨水引咳，將小鼠放入倒置的玻璃鐘罩內(nèi)，立即將含0.8 mL濃氨水(25.0%～28.0%)的棉球放入玻璃鐘罩內(nèi)，引咳30 s后立即取出，觀察咳嗽潛伏期(放入氨水至引發(fā)咳嗽的間隔時間)和2 min內(nèi)的咳嗽次數(shù)，以小鼠腹肌收縮或縮胸，同時張大嘴，為1次[6]，并按公式(1)計算咳嗽抑制率。

咳嗽抑制率=(模型組平均咳嗽次數(shù)-
用藥組平均咳嗽次數(shù))/
模型組平均咳嗽次數(shù)×100%

(1)

2.3 祛痰實(shí)驗(yàn)

精密稱取酚紅1.00 mg，5%的碳酸氫鈉溶解后，配成10 μg·mL-1酚紅溶液，順次配成10.00、5.00、2.50、1.25、0.625 μg·mL-1的溶液，用酶標(biāo)儀在波長546 nm下測定吸光度(A)值[7]。以酚紅濃度為橫坐標(biāo)，A值為縱坐標(biāo)，根據(jù)不同酚紅標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度和A值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

選取體質(zhì)量在(20±2)g的雄性小鼠60只，按體質(zhì)量隨機(jī)分對照組(給予0.9%氯化鈉溶液)、模型組(給予0.9%氯化鈉溶液)、鹽酸氨溴索組、大貝母組、中貝母組和小貝母組，適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d。不同規(guī)格貝母組均按2.0 g生藥/kg的劑量給予醇提取物，各組均按0.2 mL·g-1灌胃給藥，連續(xù)給藥5 d，每天1次。末次給藥后1 h后，除對照組外，其他各組小鼠按0.02 mL·g-1腹腔注射2.0%的酚紅0.9%氯化鈉溶液，40 min后，脫頸椎處死小鼠，仰臥固定，頸部拉直，分離出自甲狀軟骨下至氣管分叉處的一段相同長度的氣管，將各氣管段放入預(yù)先盛有2 mL NaHCO3溶液的試管中超聲35 min，3000 r·min-1離心10 min(離心半徑5 cm)，取上清液，于546 nm處測A值。與酚紅標(biāo)準(zhǔn)曲線對比，求得酚紅的質(zhì)量濃度[8]。

2.4 抗炎實(shí)驗(yàn)

選取體質(zhì)量為(20±2)g的雄性小鼠60只，隨機(jī)分為對照組(給予0.9%氯化鈉溶液)、模型組(給予0.9%氯化鈉溶液)、地塞米松組、大貝母組、中貝母組和小貝母組，適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d。不同規(guī)格貝母組均按2.0 g生藥/kg的劑量給予醇提取物，各組均按0.2 mL·g-1灌胃給藥，連續(xù)灌胃5 d，每天給藥1次。末次給藥后1 h，除對照組外，其他各組在每組小鼠左耳背腹兩側(cè)均勻涂布二甲苯各50 μL致炎，40 min后頸椎脫臼處死，沿耳廓基線均勻剪下兩耳，用直徑為7 mm的打孔器打下左右兩耳圓形組織塊，分別稱質(zhì)量[9]，按照公式(3)計算腫脹率，按照公式(4)計算腫脹度。

腫脹率=(左耳質(zhì)量-右耳質(zhì)量)/左耳質(zhì)量×100%

(2)

腫脹度=左耳質(zhì)量-右耳質(zhì)量

(3)

2.5 統(tǒng)計方法

3 結(jié)果

3.1 不同規(guī)格平貝母的止咳作用

與模型組比較，陽性藥氫溴酸右美沙芬和各貝母均能顯著減少小鼠氨水致咳嗽的次數(shù)(P<0.01)；氫溴酸右美沙芬組能顯著延長咳嗽潛伏期(P<0.01)，各貝母能夠延長咳嗽潛伏期，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見表1。

表1 不同規(guī)格平貝母的止咳作用

3.2 不同規(guī)格平貝母的祛痰作用

與模型組比較，陽性藥鹽酸氨溴索和各貝母均能顯著增加小鼠的酚紅分泌量(P<0.05)，各貝母組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見表2。

表2 不同規(guī)格平貝母的祛痰作用

3.3 不同規(guī)格平貝母的抗炎作用

與模型組相比，陽性藥醋酸地塞米松組和各貝母組均能顯著降低小鼠的耳腫脹率，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。各貝母組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見表3。

表3 不同規(guī)格平貝母的抗炎作用

4 討論

藥用植物的生長年限是影響藥材質(zhì)量的主要因素之一。防風(fēng)、當(dāng)歸等傘形科植物的藥材為營養(yǎng)生長期的地下部分，進(jìn)入生殖生長后木質(zhì)部纖維化嚴(yán)重，質(zhì)量下降，甚至無法使用[10-11]。栽培2年的白及主要藥效成分多糖的含量低于栽培3年生的含量[12]；南重樓為多年生植物，其藥效成分皂苷的積累量以8年生較高[13]；隨著生長年限的不斷增加，黃精5年生主要次生代謝產(chǎn)物含量達(dá)到峰值[14]。不同生長年限的平貝母均可入藥。小貝母是未抽莖植株，中貝母是抽莖但未開花植株，大貝母是開花植株。目前，小鼠氨水引咳法、小鼠酚紅排泌法及小鼠耳腫脹法分別是用于評價平貝母藥物止咳、祛痰和抗炎作用的經(jīng)典藥理模型[5，15]，通過上述模型證明，醇溶性成分中的生物堿是止咳、祛痰和抗炎的主要成分[16]。本研究止咳作用藥理研究表明，中貝母有優(yōu)于小貝母的趨勢。祛痰作用藥理研究表明，3種規(guī)格貝母藥效相近?？寡鬃饔盟幚硌芯勘砻?，中貝母有優(yōu)于小貝母的趨勢。小貝母大小及形狀與川貝母極其相似，在20世紀(jì)60年代以前，平貝母曾做川貝的偽品，小貝母市場價格頗高可能受川貝母質(zhì)量評價方法的影響。以小平貝母作為優(yōu)質(zhì)藥材缺乏科學(xué)依據(jù)，應(yīng)根據(jù)其藥理功效作出合理調(diào)整。