祖師麻片對CCI模型大鼠脊髓背角P2X4受體及p38 MAPK表達的影響△

宋敬怡，張?zhí)祛?，馬丹，程龍，程文豪，李穎慧，張碩峰*，格桑頓珠

1.北京中醫(yī)藥大學 中藥學院，北京 100029；2.西藏藏醫(yī)藥大學 藏藥系，西藏 拉薩 850000

祖師麻為瑞香科植物黃瑞香DaphnegiraldiiNitsche、陜西瑞香DaphnetanguticeMaxim.或凹葉瑞香DaphneretusaHemsl.的干燥莖皮及根皮。其味辛、苦，性溫；有小毒；歸肝經(jīng)，具有祛風除濕、止痛散瘀的功效，其制劑祖師麻片收載于《中華人民共和國藥典》2015年版，臨床用于治療坐骨神經(jīng)痛及風濕、類風濕性關(guān)節(jié)炎。

坐骨神經(jīng)痛屬于神經(jīng)病理性疼痛的一種。神經(jīng)病理性疼痛的產(chǎn)生可導致神經(jīng)系統(tǒng)對痛覺信號的產(chǎn)生、處理、傳遞等發(fā)生功能性障礙[1-2]。本研究采用慢性擠壓神經(jīng)損傷(chronic constriction injury of the sciatic nerve model，CCI)誘導的坐骨神經(jīng)損傷大鼠模型[3-4]，以痛反應時間(thermal withdrawal threshold，TWT)、50%機械縮足反射閾值(mechanical withdrawal threshold，50% MWT)為指標，觀察祖師麻片對CCI模型大鼠神經(jīng)病理性疼痛的抑制作用，并檢測CCI模型大鼠患側(cè)脊髓背角中絲裂原活化蛋白激酶p38(p38 MAPK)以及P2X4受體表達，以分析祖師麻片抑制坐骨神經(jīng)痛的可能機制，為其在臨床的應用提供試驗依據(jù)。

1 材料

1.1 實驗動物

6～7周齡SPF級SD大鼠84只(北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，動物合格證編號分別為11400700192661、11400700193358、11400700202282)，雌雄各42只，體質(zhì)量(200±20)g。大鼠飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學動物房，許可證號：SYXK(京)2016-0038，實驗過程中嚴格按照實驗動物使用的3R原則給予人道關(guān)懷。并獲得北京中醫(yī)藥大學實驗動物福利倫理委員會的批準(批準號：BUCM-4-2017090109-3009)。實驗前，大鼠適應性飼養(yǎng)3 d。

1.2 試劑

祖師麻片劑(秦皇島市山海關(guān)藥業(yè)有限責任公司，批號:20140702)，顏色為紅棕色，規(guī)格0.3 g/片，臨床人用量為每日3次，3片/次，即2.7 g·d-1，按照人體質(zhì)量為75 kg進行計算，即36 mg·kg-1。確定大鼠受試劑量為0.432、0.216、0.108 g·kg-1，即常規(guī)用量的12、6、3倍量。布洛芬緩釋膠囊(天津中美史克制藥有限公司，批號:16080652)，規(guī)格4 mg/粒，常規(guī)用藥量為8 mg·kg-1·d-1，本實驗采用48 mg·kg-1作為陽性藥組大鼠的受試劑量，即常規(guī)用藥量的6倍。

兔抗P2X4多克隆抗體、兔抗p38 MAPK抗體(Proteitech公司)；DAB顯色劑、兔二抗超敏試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。

1.3 儀器

Von-Frey纖維毛(美國Stoelting公司)；冷/熱盤測痛儀(美國IITC公司)。

2 方法

2.1 分組及給藥

SD大鼠84只，雌雄兼用。結(jié)扎手術(shù)完成后第8天按TWT值運用對位隨機法分為7組，分別為對照組、模型組、假手術(shù)組、布洛芬組及祖師麻片0.432、0.216、0.108 g·kg-1組。

布洛芬組及祖師麻片各劑量組大鼠于術(shù)后1周(即第8天)開始灌胃給藥，每天給藥1次，共14次，對照組、模型組、假手術(shù)組大鼠給予相同質(zhì)量的0.9%氯化鈉溶液。在造模后20 d測定相關(guān)行為學數(shù)據(jù)。

2.2 CCI模型的制備

除對照組外，其余各組大鼠腹腔注射1.5%戊巴比妥鈉麻醉，呈俯臥狀趴于手術(shù)臺上，右后肢外側(cè)褪毛處理。褪毛完成后將外側(cè)皮膚消毒后剪開，依次撥開皮膚、脂肪、淺筋膜直至看到股二頭肌，用眼科鑷將股二頭肌分離，用鑷子輕柔地將坐骨神經(jīng)主干挑起，以相鄰結(jié)扎線的距離約為1 mm長度對坐骨神經(jīng)進行結(jié)扎，共結(jié)扎4道。如大鼠大腿肌肉出現(xiàn)微微顫動，則說明結(jié)扎力度適宜[5]。結(jié)扎完畢之后將肌肉和皮膚逐層縫合，縫合處涂抹碘酒防止傷口感染。

2.3 指標檢測

2.3.1TWT測定 測定時間均設(shè)定在8：00～16：00。將大鼠放入透明玻璃罩內(nèi)適應5 min，測量的開始時間為大鼠停止探覓行為。開啟冷/熱盤測痛儀，溫度調(diào)至55 ℃，測定時間上限30 s，觀察部位為患肢(即右后足)。當儀器加熱到指定溫度后，大鼠會因灼熱出現(xiàn)不停抬足或舔足現(xiàn)象，此時為時間記錄終點。記錄的時間長度應為自開啟儀器至大鼠右后足出現(xiàn)舔足反應所用的時間，每只大鼠測量3次，每次測量距離上次測量的時間超過10 min，痛反應時間為3次測量數(shù)據(jù)的平均值。

2.3.250% MWT的測定 測定時間均設(shè)定在8：00～16：00，室溫20～25 ℃，濕度46%～52%。將大鼠置于提前準備好的籠內(nèi)，測量開始之前應使大鼠充分適應周圍環(huán)境，待其安靜后開始測量。利用Von-Frey纖維毛對其患肢(即右后足)進行刺激，方法為上下法，觀察大鼠患肢對Von-Frey纖維毛刺激出現(xiàn)的反應。選用的Von-Frey纖維毛質(zhì)量分別為15、26、60、100、180、300 g，測量開始先用最小克數(shù)纖維毛對大鼠的患肢進行刺激，若大鼠對纖維毛產(chǎn)生蹬踹或縮足的變化記作O(陽性反應)，反之記作×(陰性反應)。當反應為O時，選取比當前用于測量的纖維毛質(zhì)量低1級的纖維毛進行刺激，當反應為×時，選用比當前用于測量的纖維毛質(zhì)量高1級的纖維毛刺激。當連續(xù)2個及2個以上性質(zhì)相同的反應后出現(xiàn)與當前性質(zhì)相反的反應時，此反應所對應的數(shù)值即為第1個正式數(shù)據(jù)，之后再測5個數(shù)據(jù)，則每只大鼠的正式數(shù)據(jù)共6個。查纖維毛換算系數(shù)表[6]并按照公式(1)計算50%引起陽性反應量(ED50)。

ED50=10loga+k×b

(1)

a：用于正式數(shù)據(jù)所對應的纖毛質(zhì)量；b：相鄰纖毛的對數(shù)差的平均值；k：表中的相應參數(shù)。

2.3.3免疫組織化學反應顯色 末次給藥后1 h，大鼠腹腔注射1.5%戊巴比妥鈉麻醉，4%多聚甲醛溶液灌注，取出大鼠脊髓段L4～6后立即放入4%多聚甲醛溶液固定。脊髓段固定好后，經(jīng)脫水、包埋處理后，每組隨機抽取較完整的6只大鼠脊髓組織進行切片，每張厚度為3 μm左右。切片脫蠟，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗3 min×3；3%H2O2(15 min)封閉內(nèi)源性過氧化物酶，PBS沖洗3 min×3；微波爐加熱20 min進行抗原修復；PBS洗3 min×3；加一抗在37 ℃溫箱孵育1 h，4 ℃過夜；次日取出，PBS洗3 min×3；加二抗孵育2 h，DAB顯色，放入水中充分洗滌；樹膠封片，觀察結(jié)果。

本實驗每只大鼠選取3張切片，于顯微鏡200倍的視野中觀察免疫組化法染色后脊髓中P2X4和 p38 MAPK的表達情況，光鏡下陽性表達區(qū)呈現(xiàn)棕褐色，每張切片隨機選取3個視野，完成后計算出各組別脊髓背角區(qū)域中陽性顯色的平均吸光度(A)。

2.4 統(tǒng)計學方法

3 結(jié)果

3.1 祖師麻片對CCI大鼠痛閾值的影響

結(jié)果顯示，大鼠結(jié)扎坐骨神經(jīng)21 d后，患側(cè)痛閾值明顯降低，表現(xiàn)為TWT縮短，50% MWT降低(P<0.01)，提示模型大鼠患肢對溫度刺激、機械刺激敏感度提高，表現(xiàn)為痛覺過敏。與模型組比較，祖師麻片各劑量給藥后14 d，可明顯抑制大鼠患肢對溫度刺激、機械刺激敏感度的減低，表現(xiàn)為明顯延長TWT，提高50% MWT值(P<0.05，P<0.01)，結(jié)果見表1。

表1 祖師麻片對CCI大鼠痛閾值的影響

3.2 祖師麻片對CCI大鼠脊髓背角中p38 MAPK和P2X4受體表達的影響

造模21 d后，模型大鼠患側(cè)脊髓背角p38 MAPK、P2X4受體的表達水平明顯提高(與假手術(shù)組、對照組比較，P<0.01)。與模型組比較，祖師麻各劑量可不同程度抑制大鼠患側(cè)脊髓背角中p38 MAPK、P2X4受體表達水平的增高(P<0.01)，見表2和圖1～2。

表2 祖師麻片對CCI大鼠脊髓背角中p38 MAPK和P2X4受體表達的影響

注：A.對照組；B.假手術(shù)組；C.模型組；D.布洛芬組；E.祖師麻片0.108 g·kg-1組；F.祖師麻片0.216 g·kg-1組；G.祖師麻片0.432 g·kg-1組；下同。圖1 祖師麻片對CCI大鼠患側(cè)脊髓背角p38 MAPK表達的影響

圖2 祖師麻片對CCI大鼠患側(cè)脊髓背角中P2X4表達的影響

4 討論

神經(jīng)病理性疼痛是神經(jīng)系統(tǒng)受到機械損傷或炎癥侵害等引發(fā)的一種慢性疼痛，常導致痛覺的敏化，即痛覺過敏或觸痛超敏。CCI模型是臨床研究神經(jīng)病理性疼痛常用的動物模型之一。本研究表明，在大鼠結(jié)扎坐骨神經(jīng)1周后，其患肢對熱刺激、機械刺激敏感程度上升，具體表現(xiàn)為TWT縮短，50% MWT降低并隨著時間的推移有加重趨勢。提示結(jié)扎大鼠坐骨神經(jīng)可導致其產(chǎn)生痛覺過敏，與坐骨神經(jīng)痛的臨床癥狀一致。祖師麻為瑞香科植物，具有較強的抗炎、鎮(zhèn)痛作用[7-8]，其制劑廣泛用于類風濕、坐骨神經(jīng)痛、跌打損傷等疾病的治療[9-10]，但深入研究較少。本研究結(jié)果表明，祖師麻片可明顯延長CCI模型大鼠患肢的TWT、提高50% MWT，顯現(xiàn)出較強的抑制痛覺敏感的作用，與文獻報道一致。

痛覺敏感是病理性疼痛的主要癥狀，而中樞敏化是產(chǎn)生痛覺敏感的主要機制。脊髓神經(jīng)元的可塑性使神經(jīng)細胞的興奮性升高及痛覺的傳導性提高，是痛覺中樞敏化的主要機制。MAPK在受體間的信號傳導過程中有著至關(guān)重要的作用，p38 MAPK作為MAPK家族中重要的信號通路之一，近年來受到了廣泛關(guān)注[11-12]。p38 MAPK廣泛存在于神經(jīng)細胞和小膠質(zhì)細胞中，可完成通路信息間的交流，可參與神經(jīng)病理性疼痛的形成與維持。腺苷三磷酸(ATP adenosine triphosphate)是全身重要的供能物質(zhì)，可以作為信號分子作用于小膠質(zhì)細胞表面[13]。神經(jīng)損傷產(chǎn)生后，小膠質(zhì)細胞表面的P2X4受體上調(diào)[14]，使神經(jīng)細胞p38 MAPK激活并表達增強，p38 MAPK激活后可提高神經(jīng)元的興奮性，機體表現(xiàn)為疼痛感增強[15]。

本研究表明，CCI大鼠進行坐骨神經(jīng)結(jié)扎后，脊髓背角的P2X4受體和p38 MAPK表達顯著性增多，與TWT、50% MWT的結(jié)果一致。布洛芬可抑制脊髓背角小膠質(zhì)細胞表面的P2X4受體激活，患側(cè)脊髓背角p38 MAPK表達下調(diào)，阻斷中樞敏化的形成[6]，與實驗結(jié)果一致。祖師麻片可明顯抑制p38 MAPK和P2X4受體在CCI大鼠患側(cè)脊髓背角的表達，與給藥后模型大鼠的痛閾提高變化一致。提示祖師麻片可有效抑制CCI模型大鼠脊髓背角的P2X4受體上調(diào)，進而導致p38 MAPK的表達下降，使脊髓背角神經(jīng)細胞的興奮性降低，調(diào)節(jié)痛覺信號傳導，疼痛反應減輕，這可能是祖師麻在脊髓水平發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用的機制之一。

綜上所述，祖師麻片可抑制結(jié)扎大鼠坐骨神經(jīng)所致的痛覺敏感，其機制與抑制脊髓患側(cè)背角中P2X4受體表達以及抑制p38 MAPK通路有關(guān)。