藏綿羊BOLL的分子特征及其在睪丸中的表達調(diào)控與功能分析

李討討，王霞，馬友記,2，尹德恩，張勇，趙興緒

（1甘肅農(nóng)業(yè)大學動物科學技術(shù)學院，蘭州 730070；2甘肅肉羊繁育生物技術(shù)工程實驗室，甘肅民勤 733300；3甘肅農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，蘭州 730070）

0 引言

【研究意義】藏綿羊作為我國三大原始綿羊品種之一，是分布于海拔3 000 m以上的青藏高原及其毗鄰地區(qū)種群數(shù)量最多的家畜[1]，為當?shù)剞r(nóng)牧民提供了極其重要的生活物資和經(jīng)濟收入，并在高寒草甸草地生物多樣性及生態(tài)系統(tǒng)功能中發(fā)揮重要作用。但由于藏綿羊所具有的發(fā)育周期長、繁殖力低下、性成熟晚等繁殖生理特點，嚴重制約了其種群的數(shù)量。目前有關(guān)雄性藏綿羊睪丸發(fā)育及精子發(fā)生的分子生物學認識仍十分匱乏。睪丸作為維持雄性動物生殖能力的最關(guān)鍵器官，主要生物學功能是產(chǎn)生雄性配子（精子），而精子發(fā)生是精子產(chǎn)生所必需的發(fā)育過程，其有序運行是雄性生殖系統(tǒng)建立和維持的前提保障[2]。精子發(fā)生過程受到許多基因在多個層面（表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后、翻譯、翻譯后等）的精密調(diào)控[3-4]。研究精子發(fā)生相關(guān)基因在藏綿羊睪丸發(fā)育及精子發(fā)生中的表達特征及調(diào)控作用，對于理解綿羊及其他高原動物睪丸功能維持的分子調(diào)控機理具有重要科學意義。【前人研究進展】BOLL（也稱BOULE）作為無精癥缺失（Deleted in Azoospermia，DAZ）基因家族中最古老的成員，目前已被廣泛報道特異性存在于從昆蟲至哺乳動物的性腺中，并且主要在雄性動物睪丸中表達，如鋸蠅[5]、果蠅[6]、虹鱒[7]、雞[8]、小鼠[9]、地鼠[10]、山羊[11]、牛（黃牛、牦牛、犏牛）[12]、獼猴[13]、人[14-16]等。在睪丸發(fā)育期間，BOLL在精子發(fā)生（尤其減數(shù)分裂階段）中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用，當其表達缺失或功能異常時，可導致精子發(fā)生過程停滯，從而因精子生成障礙而造成精液品質(zhì)不良甚至雄性不育。在BOLL缺失或突變的人和果蠅睪丸中均表現(xiàn)出減數(shù)分裂紊亂和停滯，進而導致無精癥，并且人的BOLL可以挽救果蠅睪丸中BOLL缺失導致的減數(shù)分裂缺陷[14,17]，提示BOLL在昆蟲和人上具有類似的減數(shù)分裂調(diào)控作用。反之，在無精癥患者睪丸中，也發(fā)現(xiàn)BOLL的表達顯著降低，并且隨著睪丸功能衰竭程度的加深其降低程度愈發(fā)明顯[18]。在小鼠中，BOLL缺失的睪丸體積明顯縮小，雖然精母細胞的減數(shù)分裂過程可以正常進行，但減數(shù)分裂產(chǎn)生的圓形精細胞喪失進一步發(fā)育為成熟精子的能力[9]，表明BOLL在精子發(fā)生階段的調(diào)控作用因物種而異。此外，在人原始生殖細胞中BOLL的過表達可誘導聯(lián)會復合體的形成從而進入減數(shù)分裂階段，形成在細胞形態(tài)上類似于圓形精細胞的單倍體生殖細胞[15]。與之相類似，在奶山羊雄性生殖干細胞中過表達BOLL也可啟動并促進其減數(shù)分裂進程[11]?！颈狙芯壳腥朦c】當前研究表明，BOLL盡管在雄性動物的精子發(fā)生過程中扮演不可或缺的角色，且在很多物種精子發(fā)生的減數(shù)分裂階段起關(guān)鍵調(diào)控作用，但不難發(fā)現(xiàn)，其所執(zhí)行的生物學功能因物種的不同存在差異，并且目前在藏綿羊睪丸中有關(guān)BOLL的序列特征、表達模式及調(diào)控作用尚不清楚?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究以藏綿羊作為試驗動物，旨在解讀BOLL的分子特征及在綿羊睪丸發(fā)育過程中的動態(tài)表達與分布規(guī)律，進而探究其表達調(diào)控作用及所賦予的生物學功能，為進一步探索BOLL在綿羊乃至其他哺乳動物睪丸中的時空表達轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制及在精子發(fā)生中的作用機理提供依據(jù)。

1 材料與方法

試驗于2019年3月至2020年8月在甘肅農(nóng)業(yè)大學進行。

1.1 試驗動物與樣品采集

以甘肅省夏河甘加藏羊養(yǎng)殖合作社提供的 24只健康雄性藏綿羊（同父異母）作為試驗動物。試驗羊來自相同父本，不同母本，分為3個發(fā)育階段：性成熟前（3月齡，n=8）、性成熟（1歲齡，n=8）和成年（3 歲齡，n=8）。所有羊只在海拔 3 000—3 500 m的天然草場圍欄放牧，晝夜自由采食，無補飼。屠宰后收集每只綿羊的右側(cè)睪丸組織，一部分液氮速凍后存放于-80 ℃，另一部分置于4%多聚甲醛溶液中固定用于制作石蠟切片。

1.2 總RNA提取及質(zhì)檢

冷凍的各睪丸組織經(jīng)液氮快速研磨后，使用Trizol試劑盒（全式金生物公司, 北京）進行總RNA提??；使用NanoDrop ND-2000分光光度計（德國）對提取的 RNA濃度和純度進行檢測。選取 OD260/OD280介于1.8—2.1，OD260/OD230大于2.0的RNA樣品，并經(jīng) 1.5%的瓊脂糖凝膠電泳對其完整性進行檢測。

1.3 第一鏈cDNA的合成

以質(zhì)量和濃度檢測合格的RNA樣品作為模板，根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Evo M-MLV RT Kit with gDNA Clean for qPCR，艾克瑞，湖南）的操作說明合成第一鏈cDNA。

1.4 引物設(shè)計與合成

從 NCBI數(shù)據(jù)庫中獲取綿羊BOLL（XM_004004798.4）和β-actin（NM_001009784.2）的核苷酸序列，隨后利用Primer Premier 6.0軟件設(shè)計引物并送至擎科生物公司（西安）進行合成。

1.5 BOLL的克隆

以合成的cDNA為模板，利用RT-PCR技術(shù)進行BOLLCDS區(qū)的擴增。擴增總反應(yīng)體系為 50 μL：2×TransStart FastPfu Fly PCR SuperMix（全式金生物公司，北京）25 μL，PCR Stimulant 10 μL（全式金生物公司，北京），模板 1 μL，上下游引物（BOLL-F：5′-ATG GAGACCGAGTCCGGG-3′，BOLL-R：5′-TTAATAAT GAATGCTCCACAC-3′）各 2 μL， ddH2O 10 μL。PCR擴增程序：95 °C 5 min；95 °C 30 s，55 °C 30 s，72 °C 1 min，30 個循環(huán)；72 °C 5 min。對 PCR 產(chǎn)物進行 1%瓊脂糖凝膠電泳分離后，用膠回收試劑盒對目的擴增產(chǎn)物進行純化并回收，隨后與pEASY-Blunt載體相連并轉(zhuǎn)化Trans1-T1化學感受態(tài)細胞。隨機挑取8個獨立的陽性克隆通過菌落PCR法鑒定后，由擎科生物公司（西安）進行測序。

1.6 生物信息學分析

利用BLAST工具將獲得的藏綿羊BOLL序列與NCBI中現(xiàn)有的核苷酸序列數(shù)據(jù)庫進行比對，以確定最近的親緣關(guān)系和序列相似度，并用 DNAMAN 8.0軟件對不同物種 BOLL的氨基酸序列同源性進行比較。使用NCBI中的ORFfinder在線工具（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）對藏綿羊CDS區(qū)所有開放閱讀框（ORF）進行查找分析。分別利用 ProtParam（https://web.expasy.org/protparam/）、InterPro（http://www.ebi.ac.uk/interpro/）、SOPMA（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）和 Phyre 2.0（http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index）在線軟件對藏綿羊BOLL蛋白的理化性質(zhì)、功能結(jié)構(gòu)域、二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)進行分析。用 WebLogo 在線工具（http://weblogo.berkeley.edu/logo.cgi）對結(jié)構(gòu)域區(qū)段的核苷酸和氨基酸序列保守性進行分析。該蛋白的跨膜區(qū)和信號肽區(qū)分別通過 TMHMM 2.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM- 2.0）和 SignalP 4.0（http://www.cbs.dtu.dk/ services/SignalP-4.0/）軟件進行預(yù)測。采用鄰接算法通過MEGA 7.0軟件構(gòu)建BOLL蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹。采用 STRING 11.0數(shù)據(jù)庫（https://stringdb.org）對與綿羊BOLL蛋白相互作用的潛在蛋白質(zhì)進行分析，并使用Cytoscape 3.8.0軟件進行可視化。

1.7 qRT-PCR 分析

采用qRT-PCR技術(shù)在羅氏LightCycler 96熒光定量PCR儀（瑞士）上對各年齡組睪丸中BOLLmRNA的表達量進行實時定量檢測。以β-actin作為內(nèi)參。采用兩步法反應(yīng)程序：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共 40 個循環(huán)。反應(yīng)體系如下：1 μL cDNA, 每 0.4 μL上下游引物（表 1），10 μL 2×SYBR GreenPro TaqHS Premix（艾克瑞，湖南），補充ddH2O至20 μL。每個樣本設(shè)計3個重復。

表1 qRT-PCR引物信息Table 1 Primer information used for qRT-PCR

1.8 Western blot 檢測

使用含PMSF的RIPA裂解液（索萊寶生物公司,北京）提取各睪丸組織總蛋白，BCA試劑盒（碧云天生物公司，上海）對其濃度進行測定，并經(jīng) 5×SDS上樣緩沖液（索萊寶生物公司，北京）變性后，用12%SDS-PAGE進行電泳分離。電泳結(jié)束后，轉(zhuǎn)移蛋白至PVDF膜上，并經(jīng)5%脫脂奶粉室溫封閉2.5 h后，用一抗BOLL（稀釋比1∶500；博奧森，北京）或β-actin（稀釋比1∶1 500；博奧森，北京）4 ℃孵育過夜。0.1% PBST洗膜后，添加山羊抗兔二抗（稀釋比1∶5 000；博奧森，北京）孵育2 h。使用ECL發(fā)光液進行化學發(fā)光、曝光和顯影。用AlphaEaseFC軟件對條帶灰度值進行量化，并對BOLL蛋白的相對表達豐度進行計算。

1.9 免疫熒光染色

使用常規(guī)方法對石蠟切片進行脫蠟、梯度乙醇脫水后，用微波爐加熱法加入EDTA抗原修復緩沖液對組織切片進行抗原修復。5%BSA室溫封閉30 min后，添加一抗 BOLL（1∶200；博奧森，北京）4 ℃孵育過夜。同時用5%BSA代替一抗BOLL作為陰性對照。PBS清洗后，切片中滴加帶有FITC綠色熒光標簽的山羊抗兔二抗（稀釋比1∶200；賽維爾，武漢），室溫避光孵育1 h。PBS沖洗后，DAPI核染10 min，用含抗熒光猝滅劑的溶液封片，熒光顯微鏡（尼康，日本）觀察并拍照。

1.10 綿羊BOLL的功能注釋與ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析

利用非冗余蛋白質(zhì)（NR）數(shù)據(jù)庫和基因本體論（GO）數(shù)據(jù)庫，對綿羊BOLL所參與的生物學過程或功能進行注釋。基于課題組前期通過 RNA測序（RNA-seq）技術(shù)獲得的藏綿羊睪丸組織全轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)，利用 RNAhybrid 2.1.2（https://bibiserv.cebitec.uni-bielefeld）+SVM_light 6.01（http://svmlight.joachims.org/），Miranda 3.3a（http://www.microrna.org/microrna/home）和 TargetScan 7.0（http://www.targetscan.org/）數(shù)據(jù)庫對潛在的調(diào)控BOLL的長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）/環(huán)狀 RNA（circular RNA，circRNA）-微小 RNA（microRNA，miRNA）-BOLL作用網(wǎng)絡(luò)進行預(yù)測分析，并對上述數(shù)據(jù)庫的預(yù)測結(jié)果取交集作為 ceRNA整合分析結(jié)果，使用 Cytoscape 3.8.0軟件對網(wǎng)絡(luò)進行可視化。

1.11 潛在靶向調(diào)控BOLL的miRNAs及ceRNAs表達量驗證

對通過上述 ceRNA網(wǎng)絡(luò)分析獲得的潛在調(diào)控BOLL的lncRNAs、circRNAs和miRNAs表達量進行qRT-PCR驗證，并與RNA-seq結(jié)果進行比較。以1.2中提取的總RNA為模板，根據(jù)Evo M-MLV RT Kit with gDNA Clean for qPCR（艾克瑞，湖南）和Mir-XTM miRNA First-Strand Synthesis Kit（Takara，日本）反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明分別合成用于 lncRNA/circRNA和miRNA qRT-PCR擴增的第一鏈cDNA。qRT-PCR操作方法同1.7所述。運用Primer Premier 6.0軟件設(shè)計lncRNA引物和circRNA發(fā)散引物，并經(jīng)Blast對其特異性檢測；采用加尾法設(shè)計miRNA的上游引物。引物（表1）均由擎科生物公司（西安）進行合成。每個樣本設(shè)計 3個重復。分別以β-actin和 U6作為內(nèi)參對lncRNA/circRNA和miRNA的表達量進行校正。

1.12 熒光素酶報告基因載體構(gòu)建及雙熒光素酶活性檢測

將分別含有 oar-miR-760-3p、oar-miR-127-5p和oar-miR-382-5p假定靶結(jié)合位點的綿羊源BOLL3′UTR區(qū)序列（XM_004004798.4），即BOLL-m760-3′UTR WT（核苷酸位點 1539-1843）、BOLL-m127-3′UTR WT（核苷酸位點 1599-1918）和 BOLL-m382-3′UTR WT（核苷酸位點 2430-2769）；含有 oar-miR-760-3p假定靶結(jié)合位點的circ-SPHKAP、Circ-ECT2L、LOC105602204（XR_001020768，核苷酸位點 16-325）、LOC105603195（XR_001022217，核苷酸位點50-369）和 LOC105616228（XR_001043211，核苷酸位點190-494）野生型序列；以及它們分別對應(yīng)的突變型（MUT）序列克隆至pmirGLO雙熒光素酶miRNA靶向表達載體（Promega, 美國）的XhoI和SalI位點。上述序列均由金唯智生物科技有限公司（蘇州）合成。miR-760-3p、miR-127-5p和 miR-382-5p的模擬物（mimic）及其陰性對照物（mimic NC）由吉瑪制藥技術(shù)有限公司（上海）合成。復蘇購自北京北納生物的 HEK-293T細胞，以 1.0×105/孔的密度接種于 24孔板中，使用含10% FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基，在5% CO2、37℃恒溫箱靜置培養(yǎng)24 h后（匯合率為70%—80%），采用 LipofectamineTM 2000轉(zhuǎn)染試劑盒（Invitrogen, 美國），按照操作說明將構(gòu)建的野生型及突變型重組雙熒光素酶報告載體分別與對應(yīng)的mimics或 mimic NC 共轉(zhuǎn)染 293T 細胞。48 h 后收集細胞，采用 E1910雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒（Promega, 美國）分析相對熒光素酶活性，結(jié)果以螢火蟲熒光素酶活性與海腎素熒光素酶活性的比值來表示。每個試驗設(shè)置3個重復。

1.13 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采 用 2–ΔΔCt法 （ ΔCt=CtmRNAcircRNA/lncRNA/miRNACtβ-actin/U6）對 qRT-PCR 結(jié)果進行計算。用 SPSS21.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析，結(jié)果用均值±標準差（Mean±SD）表示。采用 Duncan多重檢驗比較各組間的差異，P＜0.05和P＜0.01分別表示組間差異顯著和極顯著。

2 結(jié)果

2.1 藏綿羊BOLL完整CDS區(qū)序列特征

綿羊BOLL位于2號常染色體上，總長為63 155 bp，由11個外顯子和10個內(nèi)含子組成（圖1-A）。1%瓊脂糖凝膠電泳顯示，PCR擴增的cDNA片段大小位于預(yù)期位置（圖1-B）。對該cDNA片段進行克隆并測序，獲得了長度為888 bp的核苷酸序列，對應(yīng)的序列信息已提交至 GenBank（Accession No. MT424763）。經(jīng)與NCBI中的核苷酸序列數(shù)據(jù)庫進行Blast檢索比對發(fā)現(xiàn)，與設(shè)計克隆引物所用綿羊BOLLCDS區(qū)序列（XM_004004798.4）完全一致。該克隆序列存在14個ORF，其中全長開放閱讀框ORF1（即完整CDS區(qū)）為888 bp，可編碼295個氨基酸（圖1-C、D）。藏綿羊BOLL編碼蛋白的分子量、等電點（pI）和分子式分別為32.43 kD、6.07和C1459H2217N379O440S10。該蛋白序列不含信號肽和跨膜區(qū)域。

2.2 藏綿羊與其他哺乳動物BOLL的同源性比較和結(jié)構(gòu)域分析

不同哺乳動物BOLL的氨基酸序列多重比較結(jié)果發(fā)現(xiàn)：藏綿羊與山羊的序列相似度最高（100%），其次為川南山地黃牛（99.66%）、牦牛（99.66%）、水牛（98.98%）、威德海豹（98.31%）、白尾鹿（97.97%）、非洲象（97.97%）、家貓（97.63%）、單峰駝（97.29%）、瘤牛（97.29%）、雙峰駝（97.29%）、灰熊（96.95%）、北極熊（96.95%）、家馬（96.95%）、野豬（96.95%）、北海獅（96.61%）、家犬（96.27%）和抹香鯨（95.93%），與兔的序列相似度最低（94.92%）（圖2-A）。結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)，在藏綿羊 BOLL氨基酸序列靠近 N端43—123位點處（核苷酸序列位點127—369）和172—196處（核苷酸序列位點514—588）分別存在RNA識別基序（RNA recognition motif，RRM）結(jié)構(gòu)域和DAZ重復基序，并且對應(yīng)的核苷酸和氨基酸序列在不同哺乳動物間具有高度保守性（圖2-B—E）。用系統(tǒng)進化樹對來自20種哺乳動物的BOLL氨基酸序列進行分析發(fā)現(xiàn)，藏綿羊與山羊聚為一支，在進化上與山羊、水牛、牦牛和川南山地黃牛的親緣關(guān)系較近，這與氨基酸同源性比較結(jié)果基本一致（圖3）。

圖1 藏綿羊BOLL CDS區(qū)克隆及序列分析Fig. 1 Cloning and sequence analysis of Tibetan sheep BOLL CDS region

圖2 不同哺乳動物BOLL CDS區(qū)序列特征比較分析Fig. 2 Comparative analysis of BOLL CDS sequence features among different mammals

圖3 基于鄰接算法的BOLL蛋白氨基酸序列系統(tǒng)進化樹Fig. 3 Phylogenetic tree for amino acid sequences of BOLL protein based on Neighbor-joining algorithm

2.3 藏綿羊BOLL蛋白空間結(jié)構(gòu)分析

藏綿羊BOLL蛋白的二級結(jié)構(gòu)由無規(guī)則卷曲、延伸鏈、α螺旋和β轉(zhuǎn)角4種結(jié)構(gòu)組成，分別占64.07%、18.64%、13.56%和3.73%（圖 4-A）。BOLL蛋白的三級分子結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果與其二級結(jié)構(gòu)組成相似，主要含無規(guī)則卷曲、延伸鏈、α螺旋和β轉(zhuǎn)角4種結(jié)構(gòu)類型（圖4-B）。

2.4 與綿羊BOLL蛋白互作蛋白分析

由蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果（圖 5）可知，綿羊BOLL編碼蛋白與10個蛋白可能存在相互作用，包括細胞質(zhì)多腺苷酸化元件結(jié)合蛋白 1（CPEB1）、細胞分裂周期蛋白 25A（CDC25A）、細胞分裂周期蛋白20B（CDC20B）、DEAD家族的RNA解螺旋酶4（DDX4，也稱VASA）、生長抑制蛋白家族成員2（ING2）、RNA結(jié)合基序蛋白25（RBM25）、核轉(zhuǎn)運蛋白2（KPNA2）、核轉(zhuǎn)運蛋白7（KPNA7）、鳥氨酸脫羧酶抗酶 2（OAZ2）、泛素樣修飾活化酶 5（UBA5）。BOLL蛋白處于網(wǎng)絡(luò)核心位置，且與CPEB1、UBA5和CDC20B蛋白間的相互作用具有更高的可信度。

2.5 BOLL的表達模式

由圖6可知：在mRNA和蛋白質(zhì)水平，3月齡藏綿羊睪丸中BOLL表達量均較低；與3月齡相比，1歲齡和3歲齡睪丸中的BOLL mRNA和蛋白表達量極顯著上調(diào)（P＜0.01）；相比1歲齡，3歲齡睪丸中BOLLmRNA表達呈上調(diào)趨勢，而蛋白呈現(xiàn)一定的下調(diào)趨勢。

圖4 藏綿羊BOLL蛋白的空間結(jié)構(gòu)Fig. 4 Spatial structure of Tibetan sheep BOLL protein

圖5 與綿羊BOLL蛋白互作蛋白網(wǎng)絡(luò)分析Fig. 5 Network analysis of the proteins interacting with ovine BOLL protein

2.6 BOLL蛋白的免疫熒光染色

由BOLL蛋白的陽性免疫染色結(jié)果（圖7）可知：在3月齡藏綿羊睪丸中，較弱的BOLL蛋白陽性信號定位于部分精原細胞；在1歲齡和3歲齡睪丸中，強的BOLL蛋白陽性信號主要定位于長形精細胞中，其次為圓形精細胞，也有較弱的陽性信號被發(fā)現(xiàn)存在于精原細胞和精母細胞中，并且隨著年齡的增加，在精原細胞和精母細胞中的陽性信號強度減弱。

2.7 綿羊BOLL潛在的ceRNA表達調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及功能注釋

通過對BOLL的功能注釋結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在分子功能方面，其主要涉及結(jié)合、翻譯調(diào)節(jié)活性等；在生物學過程方面，其主要參與組織細胞發(fā)育、生殖、配子生成、基因轉(zhuǎn)錄后及翻譯起始調(diào)控等過程（圖8）。ceRNA網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)：綿羊BOLL受到3個潛在的miRNAs（oar-miR-127-5p、oar-miR-760-3p 和 oar-miR-382-5p）靶向調(diào)控，并且 3個 lncRNAs（LOC105602204、LOC105603195和 LOC105616228）和 2個 circRNAs（circ-ECT2L和circ-SPHKAP）分子可與BOLL共同競爭性結(jié)合oar-miR-760-3p（圖8）。

2.8 潛在調(diào)控BOLL的非編碼RNAs在睪丸中的表達特征

實時熒光定量PCR結(jié)果（圖9-A）顯示：隨著年齡的增加，oar-miR-127-5p、oar-miR-382-5p和oar-miR-760-3p的表達量逐漸下降；LOC105616228和circ-ECT2L的表達量逐漸上調(diào)；LOC105602204、LOC105603195和circ-SPHKAP的表達量先上調(diào)而后呈現(xiàn)不同程度的下調(diào)趨勢。由圖9-A可知，qRT-PCR與RNA-seq獲得的各非編碼RNAs在睪丸中的表達模式基本一致：相比3月齡，在1歲齡和3歲齡睪丸中各 miRNAs的表達量極顯著下調(diào)（P＜0.01），而lncRNAs和circRNAs的表達量極顯著上調(diào)（P＜0.01）。

2.9 BOLL-miRNAs及miRNAs-circRNAs/lncRNAs靶向關(guān)系驗證

由雙熒光素酶報告基因檢測結(jié)果（圖9-B）可知，相比對照組，oar-miR-127-5p和oar-miR-760-3p模擬物均顯著降低了293T細胞中的BOLL3′UTR野生型報告者的熒光素酶活性（P＜0.01），并且oar-miR-760-3p模擬物顯著降低了野生型Circ-ECT2L（P＜0.05）以及LOC105616228（P＜0.01）報告者的熒光素酶活性，但對相應(yīng)的突變型報告者均無明顯影響。oar-miR-382-5p模擬物對BOLL3′UTR野生型報告基因的熒光素酶活性無明顯影響（P＞0.05），oar-miR-760-3p模擬物對野生型 circ-SPHKAP、LOC105602204和LOC105603195報告基因的熒光素酶活性也無明顯影響（P＞0.05；結(jié)果未顯示）。這些結(jié)果表明，綿羊BOLL是oar-miR-127-5p和oar-miR-760-3p共有的直接作用靶標，并且 circRNA Circ-ECT2L和 lncRNA LOC105616228作為ceRNAs, 可與BOLL共同競爭性靶向結(jié)合oar-miR-760-3p。

圖6 發(fā)育的藏綿羊睪丸中BOLL mRNA和蛋白的表達規(guī)律Fig. 6 Expression patterns of BOLL mRNA and protein in developmental Tibetan sheep testes

圖7 藏綿羊睪丸中BOLL蛋白的免疫熒光染色Fig. 7 Immunofluorescence staining of BOLL protein in Tibetan sheep testis

圖8 綿羊BOLL的功能注釋及潛在的ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)Fig. 8 The functional annotation and potential ceRNA regulatory network for ovine BOLL

3 討論

首先通過克隆并測序獲得了藏綿羊BOLL的完整 CDS區(qū)，由 888 bp的核苷酸組成，可編碼 295個氨基酸，這與 NCBI中提供的綿羊預(yù)測序列（XM_004004798.4）完全一致，并且與在山羊[19]、川南山地黃牛[12]和牦牛[20]上報道的該基因 CDS區(qū)長度一致。通過氨基酸序列比對發(fā)現(xiàn)，藏綿羊BOLL編碼區(qū)對應(yīng)的氨基酸序列與山羊、川南山地黃牛和牦牛的相似度均在99%以上，與其他哺乳動物的序列相似度也高于95%（兔除外）。在進化上，其與山羊、牦牛、川南山地黃牛也具有比較近的親緣關(guān)系。這些結(jié)果表明，藏綿羊BOLL同其他哺乳動物具有高度的序列同源性和進化保守性。

DAZ家族成員（包括BOLL）所編碼蛋白中均含有一個 RRM 結(jié)構(gòu)域和至少一段 DAZ重復基序[6]。RRM結(jié)構(gòu)域作為真核生物細胞中最豐富的RNA結(jié)合元件，可通過與其他核酸或蛋白質(zhì)相互作用，以調(diào)節(jié)mRNA的轉(zhuǎn)錄、翻譯和衰變等環(huán)節(jié)而參與基因表達的精細調(diào)控（尤其轉(zhuǎn)錄后調(diào)控），進而發(fā)揮相應(yīng)的生物學功能[21]。但對于DAZ重復基序，其在DAZ家族基因編碼蛋白中所承擔的具體功能目前仍不清楚。YEN等[22]依據(jù)自己的研究結(jié)果推測，DAZ重復基序可能參與RNA結(jié)合，也可能參與與其他蛋白質(zhì)的相互作用。EWIS等[23]研究發(fā)現(xiàn)，DAZ重復基序的缺失可造成男性生精能力下降。綜上所述，DAZ重復基序可能具有與 RRM結(jié)構(gòu)域相似的功能，即通過與其他蛋白質(zhì)分子結(jié)合從而貢獻于DAZ家族各成員自身的功能維持。與其他哺乳動物一樣，本研究通過氨基酸序列分析表明，藏綿羊BOLL蛋白也具有一個RRM結(jié)構(gòu)域（靠近N端）以及一段由25個氨基酸殘基組成的DAZ重復基序，并且二者對應(yīng)的氨基酸序列在不同物種中高度相似。由此推測，藏綿羊BOLL蛋白所含的RRM結(jié)構(gòu)域和 DAZ重復基序在進化和功能上是非常保守的，并且可能是其執(zhí)行并維持正常的生物學功能所必需的。

圖9 潛在調(diào)控BOLL的非編碼RNAs的時間表達模式及靶向關(guān)系驗證Fig. 9 Temporal expression patterns of potential regulatory non-coding RNAs for BOLL gene and verification of the target relationship

鑒于BOLL蛋白可通過結(jié)合相應(yīng)的蛋白質(zhì)而發(fā)揮作用，本研究進一步借助STRING數(shù)據(jù)庫對潛在的與綿羊BOLL蛋白互作的基因編碼蛋白進行分析發(fā)現(xiàn)，CDC25A、CDC20B 等 10個蛋白質(zhì)分子與 BOLL蛋白可能存在相互作用。其中，CDC25A和CDC20B作為細胞周期相關(guān)蛋白，被報道在哺乳動物精子發(fā)生中廣泛參與生殖細胞的有絲分裂和減數(shù)分裂等過程[24-25]。在成年雄性小鼠睪丸中發(fā)現(xiàn)，BOLL可與CDC25AmRNA靶向結(jié)合以調(diào)節(jié)其翻譯過程，從而對精母細胞的減數(shù)分裂進行調(diào)控[9]。LI等[11]在山羊上研究發(fā)現(xiàn)，過表達BOLL可通過上調(diào)減數(shù)分裂相關(guān)基因CDC25A的表達，進而啟動山羊生殖干細胞的減數(shù)分裂過程。與細胞周期蛋白所發(fā)揮的功能類似，OAZ2和DDX4也被報道在雄性哺乳動物生殖細胞中表達并參與調(diào)控細胞的增殖與分化[26-27]。在女性原始生殖細胞中過表達BOLL可增加DDX4的表達，進而促進生殖細胞的減數(shù)分裂進程及單倍體卵子的形成[15]。同DAZ家族成員一樣，CPEB1也是一種RNA結(jié)合蛋白，已被報道在小鼠卵母細胞成熟過程中，可靶向調(diào)控DAZ家族中另一成員DAZL的mRNA翻譯和蛋白積累，并且CPEB1和DAZL可通過調(diào)節(jié)共同靶標mRNA的翻譯表達從而對卵母細胞的減數(shù)分裂進行正向調(diào)控[28]。CPEB1的缺失不僅造成雌性小鼠不育，也可導致雄鼠精子發(fā)生停滯在減數(shù)分裂階段而嚴重損害其生育力[29]。類似于CPEB1在睪丸中的調(diào)節(jié)功能，ING2可通過與相應(yīng)的靶標結(jié)合參與精子發(fā)生過程，其缺失也可導致精子生成異常甚至雄性不育[30]。UBA5是泛素激活酶 E1的主要成員之一，而KPNA2和KPNA7均屬于核轉(zhuǎn)運蛋白。泛素化作為廣泛存在于真核生物細胞內(nèi)的一種蛋白質(zhì)翻譯后修飾，在精子發(fā)生過程中可將泛素分子結(jié)合到靶蛋白上，以參與調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性和功能[31-32]。同樣，在雄性生殖細胞發(fā)育的特定階段，核轉(zhuǎn)運蛋白通過與不同的轉(zhuǎn)錄因子或蛋白質(zhì)結(jié)合以轉(zhuǎn)運其穿過核孔參與調(diào)控生殖細胞分化和精子發(fā)生[33]。RBM25作為RNA結(jié)合基序蛋白家族中的一員，被報道在小鼠睪丸精子細胞中特異表達[34]。綜上，這些潛在與綿羊BOLL互作的蛋白分子均在雄性動物精子發(fā)生過程中表達并扮演不同的角色，且大多已被報道具有結(jié)合并調(diào)節(jié)其他蛋白質(zhì)分子的能力。這為深入理解BOLL在哺乳動物，尤其綿羊睪丸發(fā)育期間的分子作用機理提供了新的見解和思路，但這些蛋白是否與BOLL存在相互作用并且通過何種機制貢獻于生精細胞的表型維持及精子生成，仍有待進一步探索。

本研究發(fā)現(xiàn)，在性成熟后藏綿羊睪丸中BOLL在轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)水平的表達均顯著上調(diào)，這與以前研究報道其在具有正常生精能力（性成熟后）的哺乳動物睪丸中高表達[35-36]的結(jié)果相符，表明BOLL可能主要在性成熟后藏綿羊睪丸中發(fā)揮作用。盡管BOLL是一個減數(shù)分裂相關(guān)基因，但在睪丸中的表達不僅僅局限于減數(shù)分裂階段的精母細胞中。如在成年小鼠睪丸中，BOLL蛋白不僅存在于精母細胞中，也在圓形和長形精細胞、精子及部分精原細胞中分布[37]。在地鼠睪丸中，BOLL蛋白除了在精原細胞、精母細胞和圓形精細胞中表達外，在睪丸間質(zhì)細胞中也有分布[10]。為了明確BOLL蛋白在發(fā)育的藏綿羊睪丸細胞中所呈現(xiàn)的表達特征及發(fā)揮的生物學功能，本研究進一步通過免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)，BOLL蛋白在性成熟前睪丸中存在于部分精原細胞中，而在性成熟后主要分布于精細胞中，在精母細胞和精原細胞中也有較弱的陽性信號且隨著年齡的增加信號強度更加弱化。這與在小鼠睪丸中[9]，研究發(fā)現(xiàn)該基因在圓形精細胞中高表達并發(fā)揮作用的結(jié)果類似，提示BOLL可能主要在藏綿羊精子發(fā)生中參與調(diào)控減數(shù)分裂后的單倍體精子細胞進一步向成熟精子發(fā)育。這也與在小尾寒羊（低海拔、性成熟早、繁殖力高）[36]和地鼠[10]上報道BOLL蛋白在睪丸生殖細胞中的分布特征基本一致，但與在小尾寒羊上研究結(jié)果不同的是，BOLL蛋白在性成熟后小尾寒羊睪丸中主要表達于精母細胞和圓形精細胞中。此外，有趣的是，在藏綿羊睪丸中，隨著年齡的增加，BOLL在轉(zhuǎn)錄水平的表達逐漸上調(diào)，而在翻譯水平的表達先（性成熟）上調(diào)而后（成年）出現(xiàn)下調(diào)，這與在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平都發(fā)現(xiàn)BOLL在成年小尾寒羊睪丸中表達上調(diào)（相比性成熟階段）[36]的結(jié)果不一致。這些差異可能是由于基因的表達調(diào)控機制和表觀遺傳機制因品種的繁殖力和生存環(huán)境不同而異所造成的。已有研究報道，在具有不同繁殖力的綿羊品種卵巢中許多基因的表達及調(diào)控作用存在差異[38]。正如在雄性不育的人[18]和犏牛[20]睪丸中發(fā)現(xiàn)的BOLL表達很微弱甚至不表達，在發(fā)育的綿羊睪丸中，相比同處于成年期（精子產(chǎn)生旺盛期）的具有高繁殖力的小尾寒羊[36]，藏綿羊睪丸內(nèi)BOLL蛋白的表達呈現(xiàn)一定的下降趨勢，這可能與其繁殖力較低有關(guān)，但其具體作用機制的差異性還需進一步研究與證實。這為從細胞和分子水平探究不同繁殖力的種公羊品種在睪丸發(fā)育分子遺傳機理方面的差異提供了思路。

在藏綿羊睪丸中BOLL mRNA和蛋白的表達趨勢及表達改變倍數(shù)存在差異，這可能是由于基因的表達受到轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后等水平的嚴格調(diào)控所造成的。非編碼 RNAs（lncRNAs、miRNAs、circRNAs等）作為轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，在轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后、表觀遺傳等層面參與調(diào)控基因的表達[39]。同樣，哺乳動物精子發(fā)生過程也受到許多非編碼RNAs的調(diào)控[40-41]。有研究發(fā)現(xiàn)，在斑馬魚原始生殖細胞中miR-430可靶向抑制DAZL（與BOLL屬同一家族）的mRNA表達[42]，但有關(guān)靶向調(diào)控BOLL的miRNAs研究仍處于空白階段。本研究基于前期有關(guān)藏綿羊睪丸組織的全轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)并借助相關(guān)數(shù)據(jù)庫對潛在調(diào)控BOLL的非編碼RNAs，即ceRNAs作用網(wǎng)絡(luò)進行了鑒定與分析，并通過qRT-PCR和雙熒光素酶報告實驗對其表達特征和靶向關(guān)系進行了驗證。發(fā)現(xiàn)，oar-miR-127-5p和 oar-miR-760-3p可直接靶向調(diào)控藏綿羊BOLL的表達并且 circRNA Circ-ECT2L和lncRNA LOC105616228可通過競爭性結(jié)合 oar-miR-760-3p而調(diào)控BOLL的表達。為了進一步理解ceRNA介導調(diào)控綿羊BOLL所涉及的生物學功能，對BOLL參與的生物學過程和功能進行了詳細注釋，發(fā)現(xiàn)其主要參與配子生成、細胞分裂、基因轉(zhuǎn)錄后及翻譯起始調(diào)控等生物學過程。以上結(jié)果表明，在藏綿羊睪丸中，BOLL的表達受miRNAs及ceRNAs調(diào)控，進而可能與可激活下游信號或事件的蛋白分子相互作用，以響應(yīng)生精細胞的發(fā)育及精子生成。該研究填補了在綿羊睪丸中有關(guān)BOLL表達與調(diào)控作用認識的空白，豐富了對其在綿羊甚至其他哺乳動物精子發(fā)生中潛在的分子作用機制的理解，并為進一步的功能探究提供了新的理論視角。

4 結(jié)論

本研究成功克隆獲得藏綿羊BOLL完整CDS區(qū)序列，其在哺乳動物間具有高度進化保守性，并發(fā)現(xiàn)該基因主要表達于性成熟后藏綿羊睪丸精子細胞中，且在精母細胞和整個發(fā)育階段的精原細胞中也有表達。oar-miR-127-5p和oar-miR-760-3p直接靶向抑制綿羊BOLL的表達；circRNA Circ-ECT2L和 lncRNA LOC105616228作為ceRNAs，可與BOLL共同競爭性吸附oar-miR-760-3p而正向調(diào)控綿羊BOLL的表達，進而通過與下游分子相互作用以激活細胞增殖或分化相關(guān)信號事件來調(diào)控精子發(fā)生，尤其減數(shù)分裂后的單倍體精子細胞的進一步發(fā)育。