水稻灌漿期穗頸瘟發(fā)生對(duì)產(chǎn)量及莖節(jié)代謝產(chǎn)物的影響

潘爭(zhēng)艷，劉博，蔣洪波，姚繼攀，白元俊，徐正進(jìn)

（1遼寧省水稻研究所，沈陽(yáng)110101；2沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，沈陽(yáng)110161）

0 引言

【研究意義】水稻（Oryza sativa）是全球約50%人口的主糧[1]，由稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）引起的稻瘟病是世界各水稻產(chǎn)區(qū)普遍存在的一種病害[2]，對(duì)水稻造成大幅減產(chǎn)，嚴(yán)重時(shí)可減產(chǎn) 40%—50%[3]。稻瘟病在水稻的各個(gè)生育時(shí)期均可發(fā)生，穗頸瘟是其中危害最大的一種[4]。植物體內(nèi)代謝產(chǎn)物的變化是生物系統(tǒng)對(duì)遺傳和環(huán)境變異的最終反映[5]，代謝組學(xué)（metabonomics）可以對(duì)植物體內(nèi)代謝產(chǎn)物的整體組成進(jìn)行動(dòng)態(tài)分析[6]。應(yīng)用代謝組學(xué)方法分析穗頸瘟對(duì)水稻莖稈代謝產(chǎn)物的影響，可為解析穗頸瘟感病機(jī)理提供理論依據(jù)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】代謝組學(xué)是連接最上游基因功能和最下游表觀型變化的紐帶[5]，已廣泛應(yīng)用于水稻各個(gè)領(lǐng)域。ISHIKAWA等[7]利用代謝組學(xué)方法研究發(fā)現(xiàn)，氧化脅迫促使水稻細(xì)胞的中樞代謝途徑耗竭和氨基酸積累；SANA等[8]利用代謝組學(xué)方法研究細(xì)菌性白葉枯病菌（Xanthomonas oryzaepv.oryzae）與水稻的互作發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌性白葉枯病菌可以顯著影響水稻的苯丙氨酸代謝；PENG等[9]研究水稻葉鞘和褐飛虱（Nilaparvata lugens）互作發(fā)現(xiàn)，褐飛虱對(duì)抗/感品種的誘導(dǎo)方式不同，褐飛虱可以誘導(dǎo)感病品種脂肪酸氧化、乙醛酸循環(huán)、糖異生和GABA作用的增強(qiáng)，還可以誘導(dǎo)抗病品種糖酵解和莽草酸途徑的增強(qiáng)。稻瘟病菌是研究植物病原菌重要的模式生物，在全基因組、轉(zhuǎn)錄組以及抗病基因定位與克隆[10]等方面都對(duì)其有大量的研究，代謝組學(xué)方法也成功應(yīng)用到稻瘟病菌與水稻互作的研究中，JONES等[11]對(duì)稻瘟病菌侵染感病型與抗病型水稻葉片的代謝產(chǎn)物進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，感病型與抗病型水稻葉片差別最大的代謝產(chǎn)物為丙氨酸。水稻莖鞘中貯藏的可溶性糖等非結(jié)構(gòu)碳水化合物（nonstructural carbohydrate，NSC）和氮素是水稻增產(chǎn)的重要物質(zhì)[12-13]，抽穗前莖鞘中積累的NSC在后期被高效率轉(zhuǎn)運(yùn)到籽粒中是水稻產(chǎn)量提高的重要因素[14]，魏鳳桐等[15]研究表明，施氮后 NSC積累不足和轉(zhuǎn)移效率降低限制了千粒重和結(jié)實(shí)率的提高。稻瘟病菌侵染莖節(jié)后，葉片和莖中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不能運(yùn)輸?shù)阶蚜Ｖ衃16]，影響水稻植株?duì)I養(yǎng)物質(zhì)的積累、運(yùn)轉(zhuǎn)和分配[17]，導(dǎo)致水稻減產(chǎn)且無(wú)法補(bǔ)救[18]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】選用兩個(gè)感病品種遼星1號(hào)和C418，其中遼星1號(hào)為高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)常規(guī)稻品種，在遼寧省曾大面積種植，C418為通過(guò)“秈粳架橋”技術(shù)選育的粳型恢復(fù)系，因具有較高的配合力在全國(guó)范圍內(nèi)培育出較多強(qiáng)優(yōu)勢(shì)組合，隨著稻瘟病菌小種變化等原因，遼星1號(hào)和C418抗病性逐漸下降。代謝組學(xué)是研究水稻響應(yīng)生物脅迫和非生物脅迫的重要手段[19]，在稻瘟病方面的研究多集中在葉瘟與寄主之間的互作，而自然條件下穗頸瘟發(fā)生對(duì)莖節(jié)代謝產(chǎn)物的變化及其對(duì)產(chǎn)量的影響鮮見(jiàn)報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】以自然條件下遼星1號(hào)和C418感染穗頸瘟的莖節(jié)為研究對(duì)象，考察產(chǎn)量性狀并利用氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）非靶向代謝組學(xué)方法檢測(cè)莖節(jié)代謝產(chǎn)物，分析感病莖節(jié)與正常莖節(jié)之間的差異代謝產(chǎn)物種類，比較糖類物質(zhì)、氨基酸類物質(zhì)相對(duì)含量，從代謝物角度解析水稻品種感病和產(chǎn)量降低的原因，為感病機(jī)理研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試品種

選用水稻感病品種遼星1號(hào)和C418為材料，種子來(lái)源于遼寧省水稻研究所。

1.2 樣品采集

試驗(yàn)于2019年4—10月在遼寧省水稻研究所試驗(yàn)基地進(jìn)行。遼星1號(hào)和C418生育期田間正常管理，無(wú)藥劑防治。灌漿期間進(jìn)行穗頸瘟調(diào)查，計(jì)算發(fā)病率。選擇僅有穗頸瘟發(fā)生的植株進(jìn)行標(biāo)記，無(wú)任何病害的正常植株為對(duì)照（分別為L(zhǎng)X1-CK和C418-CK），因遼星1號(hào)和C418抽穗時(shí)期不一致，9月15日對(duì)遼星1號(hào)穗頸瘟發(fā)生的莖節(jié)（LX1-disease）和正常莖節(jié)進(jìn)行取樣，9月 18日對(duì) C418穗頸瘟發(fā)生的莖節(jié)（C418-disease）和正常莖節(jié)進(jìn)行取樣，莖節(jié)取樣后經(jīng)液氮冷凍研磨成粉末，-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩蓚€(gè)樣品均取樣完成后進(jìn)行代謝物檢測(cè)。每個(gè)處理4次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)20穗；另一部分成熟期取樣進(jìn)行產(chǎn)量及品質(zhì)構(gòu)成因素測(cè)定。

1.3 莖節(jié)代謝產(chǎn)物定量、定性分析

莖節(jié)代謝產(chǎn)物定量、定性測(cè)定委托具有資質(zhì)的專業(yè)第三方檢測(cè)機(jī)構(gòu)上海鹿明生物科技有限公司完成。

1.3.1 儀器設(shè)備 代謝產(chǎn)物測(cè)定所需儀器包括，超聲波清洗機(jī)（SB-5200DT），旋渦振蕩器（TYXH-I）、研磨儀（JXFSTPRP-24/32）、離心干燥器（LNG-T98）、高速冷凍離心機(jī)（TGL-16MS）、氣浴恒溫振蕩器（THZ-82A）、真空干燥箱（DZF-6021）、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（7890B-5977B）和色譜柱（HP-5MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm））。

1.3.2 樣品處理 精密稱取 60 mg 莖稈粉末樣本，放入 1.5 mL 的離心管中，加入 40 μL 內(nèi)標(biāo)（L-2-氯-苯丙氨酸，0.3 mg·mL-1，甲醇配置）和 360 μL 冷甲醇，在-20℃冰箱中放置2 min，冰水浴超聲提取30 min，加入 200 μL 的氯仿，漩渦機(jī)中渦旋 2 min，再加入 400 μL的水，漩渦機(jī)中渦旋2 min，冰水浴超聲提取30 min；-20℃靜置 30 min 后低溫離心 10 min，取 300 μL 的上清液裝入玻璃衍生瓶中，用離心濃縮干燥器揮干樣本，向玻璃衍生小瓶中加入 15 mg·mL-1的甲氧胺鹽酸鹽吡啶溶液80 μL，渦旋振蕩2 min后，于37℃振蕩培養(yǎng)箱中放置90 min進(jìn)行肟化反應(yīng)。將樣本取出后再加入80 μL BSTFA（含1%TMCS）衍生試劑、20 μL 正己烷和 11種內(nèi)標(biāo)（C8/C9/C10/C12/C14/C16，0.8 mg·mL-1；C18/C20/C22/C24/C26，0.4 mg·mL-1，均為氯仿配置）10 μL，渦旋振蕩2 min后，于70℃反應(yīng)60 min。取出樣本后，在室溫放置30 min，進(jìn)行GC-MS代謝組學(xué)分析。每6個(gè)樣品中插入1個(gè)質(zhì)控（quality control，QC）樣本，最后4個(gè)樣品插入1個(gè)質(zhì)控樣本，評(píng)價(jià)整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中系統(tǒng)質(zhì)譜平臺(tái)的穩(wěn)定性。

1.3.3 色譜條件 HP-5MS 毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm，Agilent J&W Scientific，F(xiàn)olsom，CA，USA），載氣為高純氦氣（純度不小于 99.999%），流速1.0 mL·min-1，進(jìn)樣口的溫度為260℃。進(jìn)樣量為1 μL，不分流進(jìn)樣，溶劑延遲5 min。柱溫箱的初始溫度為60℃，以8℃·min-1程序升溫至125℃，5℃·min-1升溫至 210℃，10℃·min-1升溫至 270℃，20℃·min-1升溫至305℃保持 5 min。

1.3.4 質(zhì)譜條件 電子轟擊離子源（EI），離子源溫度230℃，四級(jí)桿溫度150℃，電子能量70 eV。掃描方式為全掃描模式（SCAN），質(zhì)量掃描范圍：m/z 50-500。

1.3.5 數(shù)據(jù)分析 將GC-MS原始數(shù)據(jù)經(jīng)軟件轉(zhuǎn)換，導(dǎo)入MS-DIAL軟件進(jìn)行峰識(shí)別，與公共數(shù)據(jù)庫(kù)Fiehn匹配相似度實(shí)現(xiàn)化合物定性，每個(gè)物質(zhì)在質(zhì)譜中的響應(yīng)信息經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)換得到豐度值即為相對(duì)定量值。

1.4 產(chǎn)量及品質(zhì)性狀測(cè)定

水稻成熟后取樣，測(cè)定單穗產(chǎn)量性狀、外觀品質(zhì)和碾磨品質(zhì)，包括結(jié)實(shí)率、千粒重、粒長(zhǎng)、粒寬、糙米率、精米率、整精米率和堊白率等。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

運(yùn)用Excel軟件進(jìn)行產(chǎn)量性狀的方差分析。代謝產(chǎn)物數(shù)據(jù)通過(guò)在線軟件（http://www.metaboanalyst.ca/）進(jìn)行主成分分析（principal components analyses，PCA）、偏最小二乘法判別分析（partial least-squares discriminant analysis，PLS-DA）和差異代謝產(chǎn)物等分析。

2 結(jié)果

2.1 遼星1號(hào)和C418穗頸瘟發(fā)生調(diào)查

灌漿期對(duì)遼星1號(hào)和C418穗頸瘟發(fā)病率進(jìn)行調(diào)查，結(jié)果表明，C418的發(fā)病率和發(fā)病部位長(zhǎng)度均大于遼星1號(hào)。遼星1號(hào)穗頸瘟發(fā)病率為57.23%，穗頸瘟發(fā)病部位長(zhǎng)度介于1.10—2.35 cm。C418穗頸瘟發(fā)病率為82.94%，發(fā)病部位長(zhǎng)度介于1.52—3.64 cm。

2.2 穗頸瘟發(fā)生對(duì)遼星1號(hào)和C418產(chǎn)量構(gòu)成因素的影響

對(duì)遼星1號(hào)和C418產(chǎn)量構(gòu)成因素進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明穗頸瘟發(fā)生降低了遼星1號(hào)和C418的結(jié)實(shí)率和千粒重。遼星1號(hào)穗頸瘟發(fā)生極顯著（顯著）降低了一次枝梗結(jié)實(shí)率、二次枝梗結(jié)實(shí)率和千粒重，分別降低了2.91%、5.78%和 5.41%；一次枝梗的千粒重降低了2.95%，但差異不顯著。C418穗頸瘟發(fā)生極顯著（顯著）降低了一次枝梗千粒重、二次枝梗千粒重和結(jié)實(shí)率，分別降低了 5.93%、8.22%和 7.44%，一次枝梗結(jié)實(shí)率降低了3.17%，但差異不顯著（表1）。遼星1號(hào)和C418穗頸瘟發(fā)生的不同穗之間結(jié)實(shí)率和千粒重變化幅度較大，可能是由于穗頸瘟發(fā)生在不同時(shí)期造成的。

表1 穗頸瘟發(fā)生對(duì)遼星1號(hào)和C418產(chǎn)量構(gòu)成因素的影響Table 1 Effect of panicle neck blast on Liaoxing 1 and C418 yield components

2.3 穗頸瘟發(fā)生對(duì)遼星1號(hào)和C418外觀品質(zhì)和碾磨品質(zhì)的影響

對(duì)遼星1號(hào)和C418碾磨品質(zhì)和外觀品質(zhì)進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明遼星1號(hào)穗頸瘟發(fā)生顯著降低了一次枝梗和二次枝梗稻粒長(zhǎng)度，分別降低了1.51%和1.54%，稻粒寬度略有增加，差異不顯著。C418穗頸瘟發(fā)生顯著降低了一次枝梗和二次枝梗稻粒寬度，分別降低3.53%和3.27%，稻粒長(zhǎng)度差異不顯著。穗頸瘟發(fā)生顯著（極顯著）降低了遼星1號(hào)和C418的二次枝梗稻粒的長(zhǎng)寬比，分別降低了 8.68%和 4.83%。同時(shí)，穗頸瘟發(fā)生顯著增加了遼星1號(hào)的一次枝梗堊白率，堊白率增加了54.08%（表2）。

穗頸瘟發(fā)生降低了遼星1號(hào)和C418的糙米率、精米率和整精米率。糙米率和精米率與正常差異不顯著，整精米率顯著（極顯著）降低，一次枝梗整精米率分別降低了 7.93%和 8.79%，二次枝梗整精米率分別降低了5.15%和9.74%（表3）。

2.4 穗頸瘟發(fā)生對(duì)遼星1號(hào)和C418莖節(jié)代謝產(chǎn)物的影響

采用GC-MS對(duì)遼星1號(hào)和C418感病莖節(jié)和正常莖節(jié)代謝產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，均定性到358種代謝產(chǎn)物，遼星1號(hào)莖節(jié)感病后上調(diào)的代謝產(chǎn)物有263種，占檢測(cè)到的代謝產(chǎn)物總數(shù)的73.46%；C418莖節(jié)感病后上調(diào)的代謝產(chǎn)物有243種，占檢測(cè)到的代謝產(chǎn)物總數(shù)的67.88%。兩組分析均上調(diào)的代謝產(chǎn)物有220種，占檢測(cè)到的代謝產(chǎn)物總數(shù)的61.45%。

表2 穗頸瘟發(fā)生對(duì)遼星1號(hào)和C418外觀品質(zhì)的影響Table 2 Effect of panicle neck blast on appearance quality of Liaoxing 1 and C418

表3 穗頸瘟發(fā)生對(duì)遼星1號(hào)和C418碾磨品質(zhì)影響Table 3 Effect of panicle neck blast on milling quality of Liaoxing 1 and C418 (%)

采用 PCA分析來(lái)評(píng)估所有樣本的整體分布和整個(gè)分析過(guò)程的穩(wěn)定性。如圖1-A所示，PCA分析的兩個(gè)主成分解釋了總方差信息的 75.0%。所有的質(zhì)控樣品（QC）聚在一起，表明所有檢測(cè)具有良好的分析穩(wěn)定性和實(shí)驗(yàn)重現(xiàn)性。在PCA模型中，遼星1號(hào)和C418的感病莖節(jié)和正常莖節(jié)在第一個(gè)成分中被很好地分離，表明處理之間的代謝差異顯著。

對(duì)檢測(cè)到的代謝產(chǎn)物進(jìn)行PSL-DA分析，遼星1號(hào)和 C418的感病莖節(jié)和正常莖節(jié)的代謝產(chǎn)物均沿著第一主成分清楚的分開(kāi)，分別解釋了總變異的 78.9%（圖1-B）和82.0%（圖1-C）。遼星1號(hào)的模型累積解釋率R2=0.9947，Q2=0.9879；C418模型累積解釋率R2=0.99726，Q2=0.99063，數(shù)值均＞0.5，表明模型的擬合準(zhǔn)確性較好。結(jié)果表明，遼星1號(hào)和C418的感病莖節(jié)和正常莖節(jié)之間具有明顯不同的代謝產(chǎn)物表型，穗頸瘟發(fā)生嚴(yán)重影響了莖節(jié)的代謝物組成。

2.5 感病莖節(jié)與正常莖節(jié)之間差異代謝產(chǎn)物分析

利用PLS-DA分析的變量權(quán)重值（VIP＞1.0）進(jìn)行感病莖節(jié)與正常莖節(jié)之間差異代謝產(chǎn)物分析，明確促使分離的代謝產(chǎn)物。與正常莖節(jié)相比，遼星1號(hào)感病莖節(jié)誘導(dǎo)61種代謝產(chǎn)物顯著變化，其中49種代謝產(chǎn)物的相對(duì)含量顯著上調(diào)；C418感病莖節(jié)誘導(dǎo)47種代謝產(chǎn)物顯著變化，其中24種代謝產(chǎn)物的相對(duì)含量顯著上調(diào)。兩組處理共有的差異代謝產(chǎn)物30種，β-谷甾醇、二甲基尿酸、α-生育酚、正壬醇、香草酸和磷酸己酸在兩組分析的VIP值均＞2.0，表明這6種代謝產(chǎn)物在感病莖節(jié)和正常莖節(jié)的代謝產(chǎn)物分離中起到重要作用。

圖 1 穗頸瘟發(fā)生莖節(jié)與正常莖節(jié)之間代謝產(chǎn)物 PCA和PLS-DA分析Fig. 1 PCA and PLS-DA analysis of the metabolites between diseased stem nodes and normal stem nodes

根據(jù)代謝產(chǎn)物相對(duì)含量的變化可以將 30種代謝產(chǎn)物分為4組（圖2）。第1組19種代謝物，包括高絲氨酸、別嘌呤醇、D-紅鞘氨醇、阿拉伯糖醇、山梨醇、β-谷甾醇、半乳糖-6-磷酸、乙酰氨基葡萄糖、菊粉糖、羥基氨基甲酸酯、葡萄糖-6-磷酸、D-果糖-1,6-二磷酸、磷酸己糖酸、二甲基尿酸、2-單油酸、葡萄糖酸、尿囊酸、N-乙酰半乳糖胺和5-甲基尿苷。與正常莖節(jié)相比，遼星1號(hào)和C418穗頸瘟發(fā)生導(dǎo)致這19種代謝產(chǎn)物相對(duì)含量上調(diào)，分別上調(diào)了3.83—2 763.97和10.01—18 989.02倍。第2組9種代謝物，包括甲基α-呋喃硫醚、2,3-二羥基-2-丁烯二酸、亞甲基二磷酸鹽、脫氫抗壞血酸、香草酸、N-乙酰-d-甘露糖胺、三十烷醇、α-生育酚和大豆苷元。這一組代謝產(chǎn)物具有兩個(gè)特點(diǎn)，一個(gè)是與正常莖節(jié)相比，遼星 1號(hào)和C418穗頸瘟發(fā)生導(dǎo)致這組代謝產(chǎn)物相對(duì)含量下調(diào)，分別下調(diào)了73.87%—96.29%和73.02%—99.68%；二是正常莖節(jié)中這組代謝產(chǎn)物遼星 1號(hào)的相對(duì)含量大于C418的相對(duì)含量。第3組和第4組分別有一種代謝物，分別是 1,5-脫水葡萄糖醇和正壬醇，與對(duì)照相比，遼星1號(hào)和C418感病莖節(jié)中1,5-脫水葡萄糖醇分別上調(diào)了6.91倍和下調(diào)了86.23%，正壬醇分別下調(diào)了80.03%和85.22%。由于正常莖節(jié)中C418的正壬醇相對(duì)含量大于遼星1號(hào)的正壬醇相對(duì)含量，所以將正壬醇與第2組分開(kāi)，單獨(dú)獨(dú)立為一組。

圖2 差異代謝產(chǎn)物層次聚類分析生成的熱圖Fig. 2 Hierarchical cluster analysis of differential metabolites resulting in thermal energy maps

2.6 穗頸瘟發(fā)生對(duì)遼星1號(hào)和C418莖節(jié)糖類物質(zhì)的影響

GC-MS共檢測(cè)到糖類物質(zhì)30種，從熱圖中可見(jiàn)（圖3-A），與正常莖節(jié)相比，遼星1號(hào)穗頸瘟發(fā)生上調(diào)的糖類物質(zhì)有21種，占糖類物質(zhì)總數(shù)的70%；C418穗頸瘟發(fā)生上調(diào)的糖類物質(zhì)有22種，占糖類物質(zhì)總數(shù)的 73.33%。兩個(gè)品種中共有的上調(diào)糖類物質(zhì)19種，占糖類物質(zhì)總數(shù)的63.33%。分別為阿拉伯糖、葡萄糖、異麥芽糖、纖維二糖、D-核糖、蜜二糖、三糖、菊粉糖、酮己糖、D-木糖、β-龍膽糖、槐糖、松三糖、D-果糖、D-甘露糖、D-巖藻糖、哌啶-α-d-果糖、葡庚糖和赤鮮糖。與對(duì)照相比，這19種糖類物質(zhì)在遼星1號(hào)和C418感病莖節(jié)中分別上調(diào)了1.02—6.22和1.07—17.92倍。除赤蘚糖和葡庚糖，其余17種代謝產(chǎn)物在C418感病莖節(jié)中上調(diào)的幅度更大。與對(duì)照相比，兩個(gè)品種感病莖節(jié)中共有下調(diào)的代謝產(chǎn)物6種，包括左旋葡聚糖、棉子糖、D-塔格糖、D7-葡萄糖、海藻糖和6-脫氧葡萄糖，這6種糖類物質(zhì)在遼星1號(hào)和C418感病莖節(jié)中分別下調(diào)了2.16%—21.80%和7.15%—99.77%。

2.7 穗頸瘟發(fā)生對(duì)遼星1號(hào)和C418莖節(jié)氨基酸類物質(zhì)的影響

GC-MS共檢測(cè)到氨基酸類物質(zhì)38種，從熱圖中可見(jiàn)（圖 3-B），與對(duì)照相比，遼星 1號(hào)感病莖節(jié)中上調(diào)的氨基酸類物質(zhì)有31種，占氨基酸類物質(zhì)總數(shù)的 81.58%；C418感病莖節(jié)中上調(diào)的氨基酸類物質(zhì)有 29種，占氨基酸類物質(zhì)總數(shù)的 76.32%。兩個(gè)品種共有上調(diào)的氨基酸類物質(zhì)26種，占氨基酸類物質(zhì)總數(shù)的68.42%。上調(diào)的氨基酸有L-半胱氨酸甘氨酸、草氨酸、L-天冬氨酸、丙氨酸、β-丙氨酸、L-異亮氨酸、絲氨酸、L-苯丙氨酸、氰基丙氨酸、N-甲基丙氨酸、氧化谷氨酸、高絲氨酸、甘氨酸、L-纈氨酸、L-天冬酰胺、L-蛋氨酸、鳥(niǎo)氨酸、賴氨酸、鄰琥珀酰高絲氨酸、L-谷氨酸、谷氨酸、L-酪氨酸、L-谷氨酰胺、L-脯氨酸、亮氨酸和蘇氨酸。這些代謝物在遼星 1號(hào)感病莖節(jié)中上調(diào)了 1.05—7.98倍，在C418感病莖節(jié)中上調(diào)了1.10—13.12倍。兩個(gè)品種感病莖節(jié)中共有的下調(diào)代謝產(chǎn)物4種，包括 N-甘氨酰脯氨酸、D3-色氨酸、N-甲基谷氨酸和N-乙酰鳥(niǎo)氨酸，這4種氨基酸在遼星1號(hào)感病莖節(jié)中下調(diào)了8.96%—28.19%，在C418感病莖節(jié)中下調(diào)了2.78%—32.33%。

圖3 糖類物質(zhì)和氨基酸類物質(zhì)層次聚類分析生成的熱圖Fig. 3 Thermal energy maps of hierarchical cluster analysis of carbohydrate metabolites and amino acid metabolites

3 討論

次生代謝產(chǎn)物在植物應(yīng)對(duì)生物脅迫中起著重要防御作用[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，穗頸瘟發(fā)生誘導(dǎo)遼星1號(hào)和C418香草酸、N-乙酰-d-甘露糖胺、脫氫抗壞血酸、三十烷醇、α-生育酚和大豆苷元的相對(duì)含量顯著下調(diào)，這6種物質(zhì)均屬于次生代謝產(chǎn)物范疇。生育酚和脫氫抗壞血酸作為抗氧化物質(zhì)可以保護(hù)植物新陳代謝免受應(yīng)激損傷[21]。三十烷醇廣泛存在水稻等植物的蠟質(zhì)中[22-23]，能夠促進(jìn)碳氮代謝，加速莖中貯藏的有機(jī)物向籽粒運(yùn)輸[24]。大豆苷元未見(jiàn)水稻方面的報(bào)道，但是豆科植物中常見(jiàn)的次級(jí)代謝產(chǎn)物[25]，可以提高豆科植物對(duì)病原菌的抗性。香草酸作為化感類物質(zhì)在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程和抗逆中起到一定作用[26-27]。本研究還發(fā)現(xiàn)，遼星1號(hào)正常莖節(jié)中這6種次生代謝產(chǎn)物的相對(duì)含量分別是C418的2.64、2.39、2.39、2.27、3.09和2.56倍，穗頸瘟發(fā)病率調(diào)查結(jié)果與這一結(jié)果相反，遼星1號(hào)發(fā)病率和發(fā)病程度均小于C418。推測(cè)這6種次生代謝產(chǎn)物的相對(duì)含量與水稻莖節(jié)感染穗頸瘟有一定關(guān)系，稻瘟病菌可能誘導(dǎo)水稻莖節(jié)下調(diào)這些次生代謝產(chǎn)物相對(duì)含量降低莖節(jié)對(duì)稻瘟病菌的防御反應(yīng)。

禾谷類作物倒1節(jié)間主要發(fā)揮物質(zhì)運(yùn)輸通道的功能[28]，抽穗后水稻莖鞘中70%左右的非結(jié)構(gòu)性碳水化合物（NSC）通過(guò)倒1節(jié)轉(zhuǎn)運(yùn)到籽粒中，對(duì)最終產(chǎn)量的表觀貢獻(xiàn)率可達(dá) 24%—27%[29-30]。本研究發(fā)現(xiàn)，穗頸瘟發(fā)生上調(diào)了遼星 1號(hào)和 C418莖節(jié)中 70%和73.33%的糖類物質(zhì)，其中阿拉伯糖上調(diào)了 6.22%和7.45%，菊粉糖上調(diào)了5.68%和17.92%，葡萄糖上調(diào)了3.0和4.80倍，甘露糖上調(diào)了1.39和3.43倍，果糖上調(diào)了1.92和2.97倍。這些可溶性糖的上調(diào)表明水稻“源”向“庫(kù)”輸入的強(qiáng)度和“庫(kù)”將糖轉(zhuǎn)化為淀粉的能力降低，同時(shí)果糖的上調(diào)也預(yù)示著莖中蔗糖轉(zhuǎn)化酶異?；钴S[31]。本研究還發(fā)現(xiàn)，C418穗頸瘟發(fā)生有17種糖類物質(zhì)上調(diào)幅度大于遼星 1號(hào)，并且，C418穗頸瘟發(fā)生二次枝梗結(jié)實(shí)率和千粒重下降幅度也大于遼星1號(hào)，分析原因，可能是感病莖節(jié)碳水化合積累，降低了莖節(jié)光合作用，莖稈運(yùn)輸?shù)阶蚜Ｉ系奶妓衔锪繙p少，導(dǎo)致產(chǎn)量下降，尤其C418產(chǎn)量下降更多。

水稻籽粒的形成除了需要累積大量的碳水化合物外還需要大量的有機(jī)氮類代謝產(chǎn)物，莖鞘中的氮素對(duì)籽粒氮的貢獻(xiàn)率達(dá)到30%以上[32]。植物體內(nèi)游離氨基酸直接或是間接對(duì)生物脅迫和水稻生長(zhǎng)發(fā)育作出響應(yīng)[33-34]。本研究表明，穗頸瘟發(fā)生上調(diào)了遼星1號(hào)和C418莖稈中81.58%和76.32%的氨基酸類物質(zhì)，破壞了氮素在營(yíng)養(yǎng)器官和生殖器官的分配比例，降低了氮素向穗部的再運(yùn)轉(zhuǎn)量，導(dǎo)致產(chǎn)量的降低。有研究也表明，大量丙氨酸產(chǎn)生可能導(dǎo)致植物細(xì)胞死亡，促進(jìn)稻瘟病菌侵染[10]，本研究結(jié)果與這一結(jié)論一致，稻瘟病菌侵染誘導(dǎo)了遼星1號(hào)和C418莖節(jié)中丙氨酸上調(diào)了3.34和3.74倍。

穗頸瘟發(fā)生后，遼星1號(hào)和C418二次枝梗的結(jié)實(shí)率和千粒重較一次枝梗下降顯著，分析原因可能是強(qiáng)勢(shì)粒在不同環(huán)境下存在遺傳穩(wěn)定性，而弱勢(shì)粒灌漿受環(huán)境因素影響大[35]。穗頸瘟對(duì)精米率和糙米率沒(méi)有顯著影響，但對(duì)整精米率影響較大，可能是一方面碳水化合物合成受阻易造成籽粒充實(shí)不良[36]，另一方面，穗頸瘟發(fā)生造成“源”輸出不足，籽粒灌漿速率極慢，充實(shí)度差容重極輕，造成整精米率大幅度降低[37]。

4 結(jié)論

穗頸瘟發(fā)生顯著（極顯著）影響了遼星 1號(hào)和C418的二次枝梗結(jié)實(shí)率和千粒重，改變了莖節(jié)代謝產(chǎn)物組成，穗頸瘟可能通過(guò)下調(diào)脫氫抗壞血酸、α-生育酚、N-乙酰-d-甘露糖胺等次生代謝產(chǎn)物相對(duì)含量降低了水稻莖節(jié)對(duì)稻瘟病的防御反應(yīng)。感病莖節(jié)通過(guò)積累大量的糖類物質(zhì)和氨基酸類物質(zhì)，導(dǎo)致碳氮代謝受阻，降低了其向籽粒轉(zhuǎn)運(yùn)，從而抑制了水稻產(chǎn)量。