龍眼SPL基因家族全基因組鑒定及表達(dá)分析

路保順，朱永靜，張舒婷，呂煜夢(mèng)，李曉斐，宋雨洋，賴鐘雄，林玉玲

（福建農(nóng)林大學(xué)園藝植物生物工程研究所，福州 350002）

0 引言

【研究意義】SPL（squamosa promoter bindinglike）蛋白是一類參與植物眾多生長發(fā)育過程的轉(zhuǎn)錄因子。龍眼（Dimocarpus longanLour）富含豐富的磷質(zhì)和維生素，對(duì)人的大腦和脾臟具有良好的調(diào)節(jié)作用[1]。龍眼果實(shí)的產(chǎn)量和質(zhì)量取決于胚胎的發(fā)育狀況，因此，鑒定SPL家族基因并研究其在龍眼胚胎發(fā)育階段的表達(dá)，對(duì)龍眼果實(shí)質(zhì)量、產(chǎn)量的改善具有重要意義[2]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】SPL家族成員均含有一個(gè)SBP結(jié)構(gòu)域，其家族成員最先在金魚草（Antirrhinum majus）中被 KLEIN 等[3]鑒定出來，并命名為 SBP1和SBP2。SPL家族成員廣泛參與植物胚胎發(fā)育、葉片發(fā)育、發(fā)育階段轉(zhuǎn)變、花和果實(shí)發(fā)育、花青素積累等過程[4]。擬南芥中共有17個(gè)AtSPL成員[5]，AtSPL1參與調(diào)控?cái)M南芥低磷脅迫反應(yīng)以及誘導(dǎo)有關(guān)磷饑餓基因在根際酸化反應(yīng)的表達(dá)[6]；AtSPL1與AtSPL12雙突變體的花絮對(duì)熱脅迫有很高的敏感度，AtSPL1和AtSPL12過表達(dá)時(shí)明顯增強(qiáng)擬南芥的耐熱性；AtSPL8的突變體會(huì)造成花藥變小，花粉囊和花粉數(shù)目減少，從而導(dǎo)致不育，主要原因是AtSPL8突變體中花藥某些角隅處孢原細(xì)胞無法正常形成造孢細(xì)胞和花藥壁層細(xì)胞[7]。水稻中共有19個(gè)SPL家族成員[8]，OsSPL21的突變導(dǎo)致葉綠素含量顯著下降以及葉片的凈光合速率遠(yuǎn)低于野生型，而過表達(dá)OsSPL16D可以促進(jìn)水稻的細(xì)胞分裂，改變籽粒的大小和形狀等[9]。前期研究發(fā)現(xiàn)SPL蛋白通過與MADS-box的squamosa啟動(dòng)子結(jié)合，對(duì)植物花的早期發(fā)育進(jìn)行調(diào)控[10]。SPL基因家族在其他物種也有許多研究報(bào)道，例如葡萄VvSPL9和VvSPL10在不同組織中均有表達(dá)，尤其在營養(yǎng)器官和生殖器官的表達(dá)顯著[11]；牡丹PsSPL3在根中轉(zhuǎn)錄水平較高且響應(yīng)赤霉素誘導(dǎo)，低溫結(jié)合外施赤霉素可以解除花芽內(nèi)休眠[12]；白樺BpSPL在營養(yǎng)生長和生殖發(fā)育生長過程表達(dá)有顯著變化，尤其是在頂芽雄花序的生長發(fā)育過程中的作用尤為明顯[13]；陸地棉GhSPL10表達(dá)趨勢(shì)在脫分化前期與胚性再分化過程中完全相反，陸地棉胚性再分化提前發(fā)生是因?yàn)檫^表達(dá)GhSPL10能提高愈傷的增殖速率[14]。上述研究表明，SPL廣泛參與植物的生長發(fā)育等各個(gè)進(jìn)程?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前關(guān)于龍眼SPL（DlSPL）基因家族系統(tǒng)的分析尚未見報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究擬通過生物信息學(xué)方法鑒定出龍眼DlSPL所有成員，分析其基本結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，并通過qRT-PCR分析DlSPL成員在龍眼胚性培養(yǎng)物及非胚性培養(yǎng)物和不同激素處理下的胚性愈傷組織中的表達(dá)情況，為將來進(jìn)一步研究龍眼DlSPL基因家族成員的生物學(xué)功能提供依據(jù)。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2019年4—12月在福建農(nóng)林大學(xué)園藝植物生物工程研究所進(jìn)行。

1.1 材料

試驗(yàn)材料龍眼非胚性愈傷組織（nonembryonic callus，NEC）、胚性愈傷組織（embryoniccallus，EC）、不完全胚性緊實(shí)結(jié)構(gòu)（incomplete embryonic compact structure，ICpEC）、球形胚（globularembryo，GE），脫落酸（ABA，100 μmol·L-1）和茉莉酸甲酯（MeJA，100 μmol·L-1）處理的龍眼 EC[15-16]均由福建農(nóng)林大學(xué)園藝植物生物工程研究所提供，3次生物學(xué)重復(fù)。

1.2 方法

1.2.1 龍眼DlSPL家族成員的鑒定 從 GIGADB（http://gigadb.org）中獲取龍眼基因組[17]全長核苷酸序列及氨基酸序列。利用 Pfam從龍眼基因組數(shù)據(jù)庫中提取所有的SPL家族成員。采用HMMER在線軟件（https://www.ebi.ac.uk/ Tools/hmmer/search/phmmer）對(duì)候選序列進(jìn)行鑒定，篩選獲得具有完整保守結(jié)構(gòu)域的成員。初步鑒定出龍眼DlSPL家族16個(gè)候選成員。其中Dlo-026073.2具有重復(fù)的保守結(jié)構(gòu)域，另外發(fā)現(xiàn)有兩條序列的 CDS序列完全相同，因此刪除冗余序列，最終確定 14個(gè)龍眼DlSPL家族成員。把14個(gè)DlSPL成員注釋到擬南芥中，并對(duì)其命名。

1.2.2 龍眼DlSPL家族系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建 從NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）下載擬南芥的氨基酸序列，采用 MEGA5.0軟件，基于鄰近法（Neighbor-joining method）構(gòu)建龍眼、擬南芥2個(gè)物種SPL家族系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，并用自展法（Bootstrap）重復(fù)1 000次進(jìn)行檢驗(yàn)。

1.2.3 龍眼DlSPL家族基因結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)理化性質(zhì)及保守基序分析 利用 GSDS2.0（http://gsds.cbi.pku.edu.cn/）在線軟件對(duì)龍眼14條SPL基因家族成員進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)分析并繪圖。利用ExPASy和SignalP檢測(cè)14條DlSPL氨基酸序列的蛋白的等電點(diǎn)（PI）、分子量（MW）和氨基酸數(shù)目（aa）。采用 MEME（http://meme.nbcr.net/meme/cgi-bin/meme.cgi）對(duì)DlSPL家族成員進(jìn)行保守基序分析。

1.2.4 龍眼DlSPL家族成員啟動(dòng)子序列的獲得和分析 利用 TBtools軟件，從龍眼基因組數(shù)據(jù)庫中提取DlSPL起始密碼子ATG上游2 000 bp序列作為龍眼DlSPL的啟動(dòng)子，利用在線軟件 PlantCARE（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html）分析其啟動(dòng)子順式元件的種類和數(shù)量。

1.2.5 基于轉(zhuǎn)錄組的DlSPL家族FPKM值分析 從龍眼非胚性及胚性培養(yǎng)物各階段（NEC、EC、ICpEC、GE）轉(zhuǎn)錄組、胚性愈傷組織不同激素處理（D：加2,4-D 1.0 mg·L-1的 MS 培養(yǎng)基；D_KT：加 2,4-D 1.0 mg·L-1和 KT 0.5 mg·L-1的 MS 培養(yǎng)基；KT：加 KT 0.5 mg·L-1的MS培養(yǎng)基；MS：MS培養(yǎng)基，瓊脂濃度7 g·L-1，蔗糖濃度 20 g·L-1，MS 作對(duì)照）轉(zhuǎn)錄組及不同光質(zhì)（藍(lán)光、白光，暗處理作對(duì)照）處理下轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫[18]中提取DlSPL的基因表達(dá)水平（FPKM值），并利用TBtools軟件繪制熱圖。

1.2.6DlSPL家族的 qRT-PCR 分析 采用 TransZol Up試劑盒（http://www.transgen.com.cn/）提取龍眼非胚性培養(yǎng)物、胚性培養(yǎng)物及不同激素處理下胚性愈傷組的總RNA，參照 PrimeScriptTMIV 1st Strand cDNA Synthesis Mix 試劑盒（https://www.takarabiomed.com. cn/）進(jìn)行cDNA合成。DlSPL家族成員的qRT-PCR引物序列通過DNAMAN6 進(jìn)行設(shè)計(jì)（表1）。qRT-PCR 反應(yīng)體系（20 μL）包含：10 μL SYBR Premix Ex TaqTMII（TaKaRa）、7.4 μL ddH2O、上下游特異性引物各0.8 μL和1 μL cDNA 模板。反應(yīng)程序?yàn)?4℃預(yù)變性30 s；94℃變性5 s，退火時(shí)間 30 s，72℃延伸 10 s，40個(gè)循環(huán)。以 Eukaryotic elongation factor 1-alpha （EF-1α）作為內(nèi)參基因。

表1 qRT-PCR引物序列信息Table 1 qRT-PCR primers of DlSPL in this study

2 結(jié)果

2.1 龍眼DlSPL家族成員鑒定及基本理化性質(zhì)分析

利用Pfam軟件分析其結(jié)構(gòu)域，篩選出14個(gè)只含有一個(gè)SBP結(jié)構(gòu)域的DlSPL家族成員。在NCBI與TAIR在線網(wǎng)站通過Blast比對(duì)，通過注釋到擬南芥和水稻SPL家族，對(duì)14個(gè)DlSPL成員進(jìn)行系統(tǒng)命名。

ExPASy和SignalP對(duì)DlSPL家族成員基本理化性質(zhì)鑒定結(jié)果顯示（表 2），該家族的氨基酸長度在138—1 062 aa，只有DlSPL1和DlSPL14的氨基酸數(shù)大于 1 000 aa。蛋白分子量在 15.61—118.42 kD，其中DlSPL1、DlSPL12和DlSPL14的分子量超過 100 kD。等電點(diǎn)（pI）在5.81—9.22。

2.2 DlSPL基因家族的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

利用MEGA5.0對(duì)17個(gè)擬南芥SPL家族成員和14個(gè)龍眼DlSPL家族成員的氨基酸序列構(gòu)建進(jìn)化樹。參考擬南芥SPL的分類，根據(jù)DlSPL同源性分析,可將龍眼DlSPL家族成員分成6大類：第一類：DlSPL2、DlSPL9、DlSPL15；第二類：DlSPL6、DlSPL10、DlSPL13；第三類：DlSPL3、DlSPL4、DlSPL5；第四類：DlSPL1、DlSPL12、DlSPL14；第五類DlSPL8；第六類：DlSPL7（圖1）。

圖1 擬南芥、龍眼SPL 家族成員系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig. 1 Phylogenic tree of Arabidopsis thaliana and Dimocarpus longan SPL family members

2.3 DlSPL家族基因結(jié)構(gòu)及保守基序分析

龍眼DlSPL外顯子數(shù)目在2—10個(gè)。進(jìn)化樹聚集的成員外顯子數(shù)目大致相同，例如DlSPL3、DlSPL4、DlSPL5均含有 2個(gè)外顯子；DlSPL6、DlSPL10、DlSPL13均含有 3個(gè)外顯子；DlSPL1、DlSPL12和DlSPL14含有10個(gè)外顯子；另外，沒有同源聚集的成員中DlSPL8含有3個(gè)外顯子，DlSPL7含有10個(gè)外顯子（圖2）。

DlSPL共含有10個(gè)motif，14個(gè)龍眼DlSPL蛋白均有Motif1、Motif2和Motif3（圖3）。Motif5、Motif6、Motif8、Motif9只存在于 DlSPL6和DlSPL10；Motif7和 Motif10只存在于 DlSPL1、DlSPL12和 DlSPL14。另外，在進(jìn)化樹聚集的成員Motif大多相同，例如 DlSPL2、DlSPL9、DlSPL15的 Motif完全相同；DlSPL3、DlSPL4、DlSPL5的Motif完全相同；DlSPL6、DlSPL10的Motif完全相同。

2.4 龍眼DlSPL基因家族啟動(dòng)子元件分析

DlSPL啟動(dòng)子中含有大量激素應(yīng)答元件、脅迫響應(yīng)元件、光反應(yīng)元件、組織特異性調(diào)控元件等（圖4）。對(duì)DlSPL所有順式元件及其位點(diǎn)數(shù)進(jìn)行分類和統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，DlSPL9是含有啟動(dòng)子順式作用元件最多的成員；另外，DlSPL10只含有一個(gè)anaerobic元件，也是唯一一個(gè)不含有光響應(yīng)元件的成員，提示不同DlSPL成員對(duì)光的響應(yīng)程度可能有差別。

DlSPLs啟動(dòng)子序列預(yù)測(cè)到了多個(gè)激素響應(yīng)元件，包括赤霉素、水楊酸、ABA、生長素和 MeJA。含有赤霉素響應(yīng)元件的有DlSPL1、DlSPL2、DlSPL3、DlSPL4、DlSPL5、DlSPL7、DlSPL8、DlSPL9、DlSPL12、DlSPL13、DlSPL15；含有水楊酸響應(yīng)元件的有DlSPL1、DlSPL4、DlSPL6、DlSPL9、DlSPL12、DlSPL13、DlSPL14；含有ABA響應(yīng)元件的有DlSPL1、DlSPL3、DlSPL4、DlSPL5、DlSPL6、DlSPL7、DlSPL8、DlSPL9、DlSPL12、DlSPL15；含有生長素響應(yīng)元件的有DlSPL1、DlSPL2、DlSPL3、DlSPL4、DlSPL5、DlSPL6、DlSPL8、DlSPL12、DlSPL14；含有 MeJA響應(yīng)元件的有DlSPL4、DlSPL5、DlSPL7、DlSPL8、DlSPL9、DlSPL12、DlSPL13、DlSPL14?？梢?，多種激素參與調(diào)控DlSPL的表達(dá)，不同成員之間可能存在協(xié)同或拮抗作用。

表2 DlSPL家族基本理化性質(zhì)分析Table 2 Basic parameters analysis of DlSPL family

圖2 DlSPL家族基因結(jié)構(gòu)分布圖Fig. 2 Gene structural distribution map of DlSPL family

圖3 DlSPL家族蛋白motif分布圖Fig. 3 Protein motif distribution map of DlSPL family

圖4 龍眼DlSPL家族啟動(dòng)子序列順式作用元件分布Fig. 4 Distribution of cis-acting elements in promoter sequence of longan SPL family

DlSPLs啟動(dòng)子序列同時(shí)也預(yù)測(cè)到了厭氧誘導(dǎo)響應(yīng)元件ARE、低溫脅迫相關(guān)的應(yīng)答元件LTR、干旱相關(guān)的應(yīng)答元件MBS等響應(yīng)逆境脅迫的元件。此外還檢測(cè)到了許多與植物生長有關(guān)的元件例如分生組織表達(dá)相關(guān)的調(diào)控元件CAT-box、參與胚乳表達(dá)的Endosperm、以及參與莖特異表達(dá)元件Meristem等。上述結(jié)果表明，不同響應(yīng)元件共同調(diào)控DlSPL在龍眼中的作用。

2.5 DlSPL家族在不同光質(zhì)下、不同激素處理以及非胚性及胚性培養(yǎng)物的RNA-Seq表達(dá)分析

在不同光質(zhì)處理的胚性愈傷組織中，除了DlSPL4、DlSPL6、DlSPL10不表達(dá)外，其余的11個(gè)DlSPLs家族成員均檢測(cè)到表達(dá)。與黑暗處理對(duì)照組相比，11個(gè)DlSPL存在3種表達(dá)模式（圖5-A）：第一類在藍(lán)光和白光處理下呈上調(diào)表達(dá)趨勢(shì)的有DlSPL1、DlSPL2、DlSPL5、DlSPL7、DlSPL12、DlSPL13、DlSPL14；第二類在藍(lán)光、白光處理下呈下調(diào)表達(dá)趨勢(shì)的有DlSPL8；第三類在藍(lán)光、白光處理后表達(dá)程度與黑暗組相同的有DlSPL3、DlSPL9、DlSPL15?？梢?，一部分龍眼DlSPL基因家族成員在不同光質(zhì)處理下表達(dá)呈現(xiàn)上調(diào)趨勢(shì)，極少部分呈現(xiàn)下調(diào)表達(dá)趨勢(shì)。

在不同激素處理的胚性愈傷組織中，同樣除了DlSPL4、DlSPL6、DlSPL10不表達(dá)外，其余的11個(gè)DlSPL家族成員均檢測(cè)到表達(dá)。與對(duì)照組相比，11個(gè)DlSPL存在3種表達(dá)模式（圖5-B）：第一類在2,4-D處理下呈上調(diào)表達(dá)的有DlSPL12、DlSPL14。第二類在 KT處理下呈上調(diào)表達(dá)的有DlSPL1、DlSPL9和DlSPL14。第三類在 4種處理下表達(dá)趨勢(shì)相同的有DlSPL5和DlSPL15。由此可見，少部分DlSPL家族成員在激素處理下呈現(xiàn)上調(diào)表達(dá)趨勢(shì)。龍眼DlSPL家族成員在參與激素表達(dá)的情況下，對(duì)2,4-D和KT兩種激素處理中的一種呈現(xiàn)上調(diào)或下調(diào)或不表達(dá)的情況下，大多數(shù)對(duì)另一種激素處理呈現(xiàn)出相同的表達(dá)結(jié)果。

在非胚性及胚性培養(yǎng)物中，有13個(gè)DlSPL家族成員均檢測(cè)到表達(dá)，存在4種模式（圖5-C）：第一類有7個(gè)成員在NEC階段表達(dá)量最高，其中DlSPL1、DlSPL2、DlSPL5、DlSPL12、DlSPL14在NEC到GE階段表達(dá)量先下調(diào)后上調(diào)；DlSPL3、DlSPL9、在NEC到 GE階段表達(dá)量逐漸下調(diào)。第二類有 3個(gè)成員在GE階段表達(dá)量最高，其中DlSPL7在NEC到GE階段表達(dá)量逐漸上調(diào)；DlSPL13、DlSPL15在 NEC到GE階段表達(dá)量先下調(diào)后上調(diào)。第三類在EC階段表達(dá)量最高的只有DlSPL8，并且在NEC到GE階段表達(dá)量先下調(diào)后上調(diào)。第四類DlSPL6和DlSPL10兩個(gè)成員在4個(gè)階段表達(dá)程度幾乎相同?？梢姡堁跠lSPL家族成員大部分在體胚發(fā)生過程呈下調(diào)表達(dá)趨勢(shì)。

圖5 龍眼DlSPL家族在光質(zhì)（A）、激素（B）及非胚性培養(yǎng)物和胚性培養(yǎng)物（C）的表達(dá)分析Fig. 5 The specific expression of the DlSPL family in light quality (A), hormone (B) and non-embryogenic and embryogenic cultures (C) of longan

2.6 龍眼 DlSPL基因家族成員在非胚性及胚性培養(yǎng)物的中的qRT-PCR分析

除了DlSPL7表達(dá)趨勢(shì)與轉(zhuǎn)錄組相同外，其余 4個(gè)成員與轉(zhuǎn)錄組表達(dá)趨勢(shì)有較所差別（圖6）。其中，DlSPL7呈上升表達(dá)趨勢(shì)，DlSPL1、DlSPL5、DlSPL13呈先下降后上升趨勢(shì)。整體分兩種表現(xiàn)：一是ICpEC階段表達(dá)量最高，如DlSPL5、DlSPL7和DlSPL13。第二種是EC階段表達(dá)量最高，如DlSPL1和DlSPL14。

圖6 DlSPL 在龍眼非胚性和胚性培養(yǎng)物中的表達(dá)分析Fig. 6 Expression analysis of DlSPL in non-embryonic and embryogenic cultures of Dimocarpus longan

2.7 龍眼 DlSPL家族成員在 ABA和 MeJA處理下的qRT-PCR分析

因DlSPL1、DlSPL5、DlSPL13、DlSPL144 個(gè)成員含有至少響應(yīng)ABA或MeJA其中一種應(yīng)答元件。因此選用上述4個(gè)DlSPL成員探索ABA、MeJA處理0、4、12和24 h的胚性愈傷組織表達(dá)情況。qRT-PCR分析結(jié)果表明，與0 h對(duì)照相比，經(jīng)ABA處理4、12和 24 h處理后，DlSPL1、DlSPL5、DlSPL7和DlSPL13均顯著下調(diào)表達(dá)，可能DlSPL家族在響應(yīng)ABA元件應(yīng)答的過程表現(xiàn)出拮抗作用；經(jīng)MeJA處理4、12和24 h后，DlSPL1、DlSPL7和DlSPL13呈下調(diào)表達(dá)，其中DlSPL7各時(shí)間表達(dá)均顯著下調(diào)，只有DlSPL5經(jīng)MeJA 4 h和24 h處理后呈上調(diào)表達(dá)趨勢(shì)，猜測(cè)MeJA對(duì)DlSPL5在龍眼中的表達(dá)有促進(jìn)作用，并且抑制DlSPL1、DlSPL7、DlSPL13在龍眼中的表達(dá)（圖7）。

3 討論

3.1 龍眼DLSPL基因家族成員的分子特性

SPL家族成員參與調(diào)控許多植物的胚胎發(fā)育、葉片發(fā)育、發(fā)育轉(zhuǎn)變階段、花和果實(shí)發(fā)育、花青素積累等生長發(fā)育過程[19]。SPL家族成員的鑒定分析在多種植物中已有報(bào)道，但在龍眼中尚未進(jìn)行詳盡的研究。本研究從龍眼全基因組中鑒定得到 14個(gè)具有完整SBP結(jié)構(gòu)域的DlSPL，少于擬南芥（17個(gè)）[5]、水稻（19個(gè)）[8]、番茄（15個(gè)）[20]、銀杏（15個(gè)）[21]等物種中SPL基因家族成員數(shù)目。DlSPL家族成員的外顯子數(shù)目為2—10個(gè)，多于三葉裂薯ItSPL成員的2—4個(gè)[22]，和菠蘿AcSPL外顯子數(shù)目相同（2—10 個(gè)）[23]。

系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果表明，龍眼DlSPL家族分成6組。同一組成員的基因結(jié)構(gòu)和蛋白保守基序大體相同，具體表現(xiàn)在每一組成員的外顯子數(shù)目以及所含Motif種類大致一樣。但也有特殊，例如DlSPL2含有4個(gè)外顯子，同組DlSPL9、DlSPL15只有3個(gè)外顯子；DlSPL13只含有 Motif2、Motif3、Motif9，同組 DlSPL6、DlSPL10還含有Motif1、Motif5、Motif6、Motif8。在進(jìn)化樹中關(guān)系親近的成員在功能上可能具有相似性，例如，AtSPL8參與植物開花的過程[5]，可以猜測(cè)同源性最近的DlSPL8很大可能調(diào)控龍眼開花的過程；AtSPL9調(diào)控?cái)M南芥由營養(yǎng)生長向生殖生長的轉(zhuǎn)變，過表達(dá)AtSPL9的轉(zhuǎn)基因擬南芥植株葉片數(shù)量減少和葉片遠(yuǎn)軸面表皮毛增加[24-27]；在茶樹CsSPL9的研究中發(fā)現(xiàn)其可增加茶樹的耐高溫性[28]，這與AtSPL9減少表皮毛數(shù)量的作用相似，再根據(jù)同源性推斷DlSPL9可能提高龍眼的耐高溫性。

圖7 DlSPL家族成員在ABA和MeJA不同時(shí)長處理下的胚性愈傷組織中的表達(dá)情況Fig. 7 Expression of DlSPL family members in longan EC treated with abscisic acid and jamonic acid methyl ester for different durations

3.2 DLSPL家族成員可能參與龍眼體胚發(fā)生過程

SPL在植物組織特異性表達(dá)尤為顯著，8個(gè)菠蘿AcSPL成員在花芽、雄蕊、萼片中檢測(cè)到表達(dá)[15]；小麥TaSPL20不同成員在小麥穗部側(cè)芽、雌蕊[29]等部位大量表達(dá)，在小麥穗部的發(fā)育中起重要作用。SPL家族成員參與調(diào)控植物的胚胎發(fā)育。在前人的研究中發(fā)現(xiàn)柑橘CsSPL14與CsAKIN10互作增強(qiáng)了CsSPL14在柑橘愈傷組織系的體胚發(fā)生能力[30]。在銀杏胚胎休眠的3個(gè)階段中，少部分GbSPL成員全部呈下調(diào)表達(dá)模式；另一類GbSPL成員全部呈上調(diào)表達(dá)模式，總體來說，GbSPL家族在銀杏胚胎發(fā)育中的表達(dá)水平較高[31]。本研究發(fā)現(xiàn)5個(gè)DLSPL家族成員可能因?yàn)閭€(gè)別基因功能的差異導(dǎo)致其在龍眼 NEC、EC、ICpEC、GE 4個(gè)階段的表達(dá)模式存在很大差別。大部分DLSPL在 EC、ICpEC階段顯著高表達(dá)，在 NEC和GE階段都有下調(diào)表達(dá)趨勢(shì)。不同DLSPL成員在龍眼體胚發(fā)育不同階段表達(dá)量的明顯差異表現(xiàn)出DLSPL在體胚發(fā)育的表達(dá)中存在時(shí)空特異性。值得注意的是，SPL家族轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果與qRT-PCR結(jié)果的表達(dá)趨勢(shì)并不完全相同，且部分基因存在差異，這可能是由于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序時(shí)間較早，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序所使用的4個(gè)階段材料與qRT-PCR試驗(yàn)的材料為不同批次培養(yǎng)所得，非胚性及胚性培養(yǎng)物狀態(tài)可能由于批次效應(yīng)存在一定的差異，導(dǎo)致表達(dá)結(jié)果存在差異。今后將通過轉(zhuǎn)基因驗(yàn)證試驗(yàn)來進(jìn)一步鑒定SPL家族在龍眼體胚發(fā)育過程中的功能。

3.3 龍眼DlSPL家族響應(yīng)ABA和MeJA激素應(yīng)答

ABA調(diào)控許多植物生長的過程。例如ABA能夠緩解鹽分過多對(duì)植物造成的滲透斜坡，達(dá)到保持水分平衡的目的[32]，脫落酸對(duì)水稻產(chǎn)生誘抗效應(yīng)，顯著提高水稻對(duì)堿脅迫的抗性和蘇打鹽堿水田中水稻的產(chǎn)量[33]；胡蘿卜體細(xì)胞胚的研究中，適宜濃度的 ABA能使體胚發(fā)生提前一周，對(duì)其體胚的進(jìn)一步發(fā)育有調(diào)節(jié)作用[34]。本研究中，4個(gè)DlSPL成員的表達(dá)經(jīng)ABA處理后均呈下調(diào)表達(dá)，而DlSPL1、DlSPL5和DlSPL7均含有ABA的應(yīng)答元件，進(jìn)一步說明DlSPL能夠應(yīng)答ABA的處理；值得注意的是DlSP13雖不含ABA的應(yīng)答元件，但qRT-PCR結(jié)果顯示其也能響應(yīng)ABA處理并呈下調(diào)趨勢(shì)，提示其他SPL成員也有可能受ABA調(diào)控。前人對(duì)SPL的研究發(fā)現(xiàn)SPL與植物的開花過程密切相關(guān)[35]，ABA 可以加快番茄結(jié)實(shí)[36]的過程，結(jié)合qRT-PCR結(jié)果，DlSPL成員可能更多參與龍眼結(jié)實(shí)前的發(fā)育。

MeJA與植物的抗逆能力有著密切聯(lián)系，例如干旱脅迫下，外源MeJA可以增強(qiáng)玉米幼苗根系水通道蛋白的表達(dá)，提高根系的吸水能力[37]。另外，發(fā)現(xiàn)MeJA可以提高紫蘇種子SOD等保護(hù)酶的活性，有效降低高溫高濕等逆境對(duì)種子造成的氧化和損傷，保證紫蘇種子在高溫高濕脅迫下的正常萌發(fā)[38]。最新研究發(fā)現(xiàn)濃度1 μmol·L-1左右的 MeJA 能提高雜交鵝掌楸體胚發(fā)生率和體胚成熟率[39]。在橡膠樹的研究中發(fā)現(xiàn)MeJA是誘導(dǎo)橡膠樹體胚花青素積累的有效誘導(dǎo)劑[40]。qRT-PCR結(jié)果顯示只有DlSPL5在MeJA處理后呈上調(diào)表達(dá)，DlSPL1、DlSPL7和DlSPL13呈下調(diào)表達(dá)。DlSPL5、DlSPL7和DlSPL13均含 MeJA 元件，但DlSPL1不含該元件，卻也能響應(yīng)MeJA處理呈下調(diào)表達(dá)，提示SPL可能具有復(fù)雜的調(diào)控關(guān)系。

4 結(jié)論

本研究共鑒定出DlSPL成員14個(gè)，只含有一個(gè)高度保守的SBP結(jié)構(gòu)域成員；根據(jù)擬南芥AtSPL家族分類標(biāo)準(zhǔn)可把龍眼DlSPL成員分成6大類；多數(shù)DlSPL成員在非胚性愈傷組織和胚性愈傷組織階段高表達(dá)；龍眼DlSPL響應(yīng)ABA和MeJA的應(yīng)答。