轉(zhuǎn)錄因子KLF7對IL-6基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控分析

王 寧，尤 欣，徐海冬，婁 明，婁鈺琦，閆曉紅，李 輝

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，哈爾濱 150030；2.黑龍江省普通高等學(xué)校動(dòng)物遺傳育種與繁殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150030；3.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部雞遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150030）

轉(zhuǎn)錄因子Sp1/KLFs（Specificity protein1/KLF transcription factors）家族成員參與調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、凋亡、器官發(fā)育、代謝、體細(xì)胞重編程和腫瘤發(fā)生等生物學(xué)過程[1-2]。Sp1/KLFs家族成員羧基端具有3個(gè)高度保守的典型Cys2/His2鋅指結(jié)構(gòu)域，是Sp1/KLFs的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，Sp1/KLFs通過該DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域識(shí)別并結(jié)合靶基因啟動(dòng)子，增強(qiáng)子區(qū)的CACCC元件或富含GC的序列調(diào)控靶基因表達(dá)[3-4]。Sp1/KLFs氨基端各成員間差異較大，該區(qū)域主要包含轉(zhuǎn)錄調(diào)控結(jié)構(gòu)域，發(fā)揮激活或抑制靶基因作用[5]。

KLF7（Krüppel-like factor 7）是 Sp1/KLFs轉(zhuǎn)錄因子家族成員。KLF7在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和脂肪生成中發(fā)揮重要作用，是肥胖癥和Ⅱ型糖尿病等多種疾病相關(guān)基因[2]。基因表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，KLF7基因在鼠前脂肪細(xì)胞中高表達(dá)，細(xì)胞誘導(dǎo)分化后，KLF7基因表達(dá)迅速下降，但隨細(xì)胞分化繼續(xù)，KLF7表達(dá)逐漸回升[6]。體外研究發(fā)現(xiàn)，KLF7是脂肪細(xì)胞分化的負(fù)調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子[1]。

白細(xì)胞介素-6（Interleukin-6，IL-6）是一個(gè)由脂肪細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等多種細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，參與脂肪生長發(fā)育等多種生理學(xué)過程[7-8]。研究證實(shí)IL-6抑制人原代前脂肪細(xì)胞增殖和分化[9]。IL-6是一種重要遞質(zhì)，刺激下丘腦-垂體-腎上腺（HPA）軸，其表達(dá)水平與中樞型肥胖、Ⅱ型糖尿病及胰島素抵抗等相關(guān)[10-12]。成人肥胖患者和高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖大鼠內(nèi)臟脂肪組織基因表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，KLF7和IL-6高表達(dá)，且KLF7與IL-6表達(dá)呈顯著正相關(guān)[13]。Kawamura等發(fā)現(xiàn)，人脂肪細(xì)胞中過表達(dá)KLF7可上調(diào)細(xì)胞IL-6表達(dá)[6]。Zhang等發(fā)現(xiàn)，在293T中共轉(zhuǎn)染人IL-6啟動(dòng)子區(qū)熒光素酶報(bào)告基因和KLF7表達(dá)質(zhì)粒，KLF7過表達(dá)可顯著提高人IL-6啟動(dòng)子活性[14]。在成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)分化為成熟脂肪細(xì)胞過程中，高濃度棕櫚酸（PA）可促進(jìn)鼠脂肪細(xì)胞KLF7、IL-6表達(dá)；過表達(dá)KLF7促進(jìn)成熟脂肪細(xì)胞IL-6表達(dá)，而干擾KLF7抑制成熟脂肪細(xì)胞IL-6表達(dá)。以上報(bào)道提示，KLF7可能直接調(diào)控IL-6基因表達(dá)。

為驗(yàn)證這一推測，本文開展鼠轉(zhuǎn)錄因子KLF7調(diào)控IL-6基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究。研究證實(shí)KLF7直接調(diào)控IL-6基因表達(dá)，對了解KLF7在脂肪生成中作用機(jī)制以及肥胖癥等相關(guān)疾病發(fā)病機(jī)理具有重要理論與實(shí)踐意義。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

Phanta MaxSuper-fidelity DNA Polymerase、ClonExpress II One Step Cloning Kit均購自南京vazyme公司；pCMV-HA載體、pCMV-HA-KLF7、pGL3-basic、pGL3-basic-p21與pRL-TK Renilla載體由本實(shí)驗(yàn)室保存；DNA凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒購自Axygen杭州有限公司；限制性由切酶XhoⅠ、SmaⅠ購自大連寶生物工程有限公司（TaKaRa）；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒購自美國Promega公司；脂質(zhì)體LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑購自美國Invitrogen公司；DNA Marker、TransZol試劑購自北京全式金公司；FastStart Universal SYBR Green Master（Rox）購自德國 Roche公司；cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒Primer ScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）購自大連寶生物工程有限公司（TaKaRa）；HA標(biāo)簽抗體（貨號(hào)#3724）和IL-6抗體（貨號(hào)#12912）購自Cell Signaling Technology；KLF7抗體（貨號(hào)sc-398576）購自Santa Cruz Biotechnology。actin抗體（貨號(hào)AA132）和辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG（H+L）抗體（貨號(hào)A0208）購自上海碧云天生物科技研究所。IgG（H+L）/HRP山羊抗鼠二抗（貨號(hào)ZB-2305）購自北京中杉金橋。ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購自上海碧云天生物科技研究所（上海）。DMEM培養(yǎng)基、Opti-MEM培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶購自美國Gibco公司。胎牛血清購自美國BI公司。3T3-L1脂肪細(xì)胞（小鼠胚胎成纖維細(xì)胞）由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部雞遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 IL-6基因啟動(dòng)子區(qū)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)分析

從 NCBI數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）獲得小鼠IL-6基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游2 000 bp啟動(dòng)子序列，采用在線軟件JASPAR（http://jaspar.genereg.net/）、Mulan（https://mulan.dcode.org/）和Alibaba2（http://gene-regulation.com/pub/programs/alibaba2/index.html）分析轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。

1.3 IL-6基因啟動(dòng)子及其5'端截短突變體報(bào)告基因載體構(gòu)建

采用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)5條IL-6基因啟動(dòng)子擴(kuò)增引物，其中4條為上游引物（F1、F2、F3、F4）和1條下游引物R1。根據(jù)ClonExpress II One Step Cloning Kit試劑盒要求，各片段上游（F）和下游（R）引物5'端和3'端分別引入SmaⅠ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)和15 bp橋接堿基序列（見表1中斜體部分序列），以小鼠鼠尾和耳朵基因組DNA為模板，按照諾唯贊Phanta MaxSuper-fidelity DNA Polymerase說明書，具體PCR反應(yīng)體系為50 μL：1 μL Phanta MaxSuper-fidelity DNA Polymerase，25 μL 2×Phanta Max Buffer，1 μL dNTP Mix，5 μL基因組DNA模板，上下游引物各2 μL，14 μL ddH2O補(bǔ)足體系。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3 min；經(jīng)95℃15 s，退火60℃15 s，72℃延伸2 min，共35個(gè)循環(huán)；72℃徹底延伸5 min，4℃保存。PCR擴(kuò)增出IL-6基因4個(gè)不同長度啟動(dòng)子片段。采用1.2%瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物，利用DNA凝膠回收試劑盒純化PCR產(chǎn)物，送金唯智公司測序。測序正確的IL-6基因4個(gè)啟動(dòng)子片段，采用ClonExpress II One Step Cloning Kit試劑盒，反應(yīng)體系為20 μL：4 μL啟動(dòng)子片段，4μL線性化pGL3-basic載體，4μL5×CEⅡBuffer，2 μL ExnaseⅡ，6 μL ddH2O補(bǔ)足體系。37 ℃反應(yīng)30 min，與雙螢光素酶報(bào)告基因載體pGL3-basic連接、轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞。重組體經(jīng)菌落PCR鑒定和測序確認(rèn)無誤后，將得到IL-6基因4個(gè)5'端截短的啟動(dòng)子報(bào)告基因載體，分別命名為pGL3-IL-6（-1776/+70）、pGL3-IL-6（-483/+70）、pGL3-IL-6（-220/+70）和pGL3-IL-6（-143/+70）。

表1 小鼠IL-6基因啟動(dòng)子擴(kuò)增引物信息Table 1 Primer sequences used for cloning mouse IL-6 gene promoter

1.4 IL-6基因啟動(dòng)子區(qū)KLF7結(jié)合位點(diǎn)定點(diǎn)突變

針對IL-6基因啟動(dòng)子-143～+70 bp區(qū)段2個(gè)KLF7潛在結(jié)合位點(diǎn)CCCCACCCAC（結(jié)合位點(diǎn)1）、CCCCACCCCCACCCTCC（結(jié)合位點(diǎn)2），定點(diǎn)突變，共獲得3個(gè)不同突變型報(bào)告基因載體。其中2個(gè)KLF7結(jié)合位點(diǎn)同時(shí)突變的報(bào)告基因載體pGL3-IL-6（-143/+70）Mut1（CCCCACCCAC 突變?yōu)锳AAAACCCAC， 同時(shí) CCCCACCCCCACCCTC C突變?yōu)锳AAAACAAACAAAATCC），2個(gè)KLF7結(jié)合位點(diǎn)分別突變的報(bào)告基因載體pGL3-IL-6（-143/+70）Mut2（結(jié)合位點(diǎn) CCCCACCCAC 突變?yōu)锳AAAACCCAC）和 pGL3-IL-6（-143/+70）Mut3（結(jié)合位點(diǎn)CCCCACCCCCACCCTCC突變?yōu)锳AAAACAAACAAAATCC）。定點(diǎn)突變的啟動(dòng)子片段由金唯智公司合成。

1.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染與雙螢光素酶檢測

1.5.1IL-6基因啟動(dòng)子截短突變體報(bào)告基因活性檢測

將3T3-L1前脂肪細(xì)胞接種至24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)80%，采用轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000將4個(gè)5'端截短報(bào)告基因載體pGL3-IL-6（-1776/+70）、pGL3-IL-6（-483/+70）、pGL3-IL-6（-220/+70）、pGL3-IL-6（-143/+70）和陰性對照pGL3-basic載體各0.8 μg，分別與8 ng pRLTK Renilla載體轉(zhuǎn)染3T3-L1前脂肪細(xì)胞，轉(zhuǎn)染6 h后，換為含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基，48 h后裂解細(xì)胞，利用Promega公司Dual Luciferase Reporter Assay System雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒檢測海腎（內(nèi)參）和螢火蟲螢光素酶活性。采用化學(xué)單管檢測儀，每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

1.5.2 KLF7過表達(dá)對IL-6基因啟動(dòng)子報(bào)告基因載體活性分析

將3T3-L1前脂肪細(xì)胞接種至24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，用含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)80%，采用轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑，將pCMV-HA-KLF7及pCMVHA（NC）陰性對照載體各 0.4 μg，分別與 0.4 μgIL-6基因4個(gè)啟動(dòng)子報(bào)告基因載體pGL3-IL-6（-1776/+70）、pGL3-IL-6（-483/+70）、pGL3-IL-6（-220/+70）、pGL3-IL-6（-143/+70）以及陰性對照組pGL3-basic載體和陽性對照組pGL3-basic-p21載體，與8 ng pRL-TK Renilla載體共轉(zhuǎn)染3T3-L1前脂肪細(xì)胞，6 h后換含血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，48 h后裂解細(xì)胞，利用Promega公司Dual Luciferase Reporter Assay System雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒檢測海腎（內(nèi)參）和螢火蟲螢光素酶活性。采用化學(xué)單管檢測儀，每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

1.5.3 定點(diǎn)突變對KLF7調(diào)控IL-6啟動(dòng)子活性的影響

將IL-6基因啟動(dòng)子位點(diǎn)1（CCCCACCCAC）和位點(diǎn)2（CCCCACCCCCACCCTCC）分別定點(diǎn)突變，將位點(diǎn)1（CCCCACCCAC）突變?yōu)椋ˋAAAACCCAC）；將位點(diǎn)2（CCCCACCCCCACCCTCC）突變?yōu)锳AAA ACAAACAAAATCC，共獲得3個(gè)突變型報(bào)告基因載體，其中將位點(diǎn)1和位點(diǎn)2同時(shí)突變的啟動(dòng)子報(bào)告基因載體命名為pGL3-IL-6（-143/+70）Mut1；將位點(diǎn)1單獨(dú)突變的啟動(dòng)子報(bào)告基因載體命名為pGL3-IL-6（-143/+70）Mut2，將位點(diǎn)2單獨(dú)突變的報(bào)告基因載體命名為pGL3-IL-6（-143/+70）Mut3。將3T3-L1前脂肪細(xì)胞接種至24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，用含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)80%，采用轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑，將3個(gè)突變型報(bào)告基因載體pGL3-IL-6（-143/+70）Mut1、pGL3-IL-6（-143/+70）Mut2、pGL3-IL-6（-143/+70）Mut3 和 pGL3-IL-6（-143/+70）載體各0.4 μg，與0.4 μg小鼠pCMV-HA-KLF7和pCMV-HA（NC）陰性對照載體、8 ng pRL-TK Renilla載體分別共轉(zhuǎn)染3T3-L1前脂肪細(xì)胞，48 h后裂解細(xì)胞，利用Promega公司Dual Luciferase Reporter Assay System雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒檢測海腎（內(nèi)參）和螢火蟲螢光素酶活性。采用化學(xué)單管檢測儀，每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

1.6 KLF7基因siRNA設(shè)計(jì)和干擾效率檢測

根據(jù)文獻(xiàn)[14-15]設(shè)計(jì)2個(gè)鼠KLF7小干擾RNA片段（siRNA）以及陰性對照組（見表2），siRNA由百奧邁科生物技術(shù)有限公司合成。將合成siRNA分別用LipofectamineTM2000試劑轉(zhuǎn)染3T3-L1前脂肪細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24、36和48 h后提取細(xì)胞總RNA，采用實(shí)時(shí)定量PCR檢測，當(dāng)用小干擾RNA（siRNA）片段下調(diào)KLF7時(shí)，3T3-L1前細(xì)胞中KLF7和IL-6的mRNA表達(dá)水平，mRNA表達(dá)檢測引物見表3。

表2 小干擾RNA列表Table 2 List of small interfering RNAs

1.7 RNA提取、反轉(zhuǎn)錄和qRT-PCR

采用6孔板培養(yǎng)3T3-L1前脂肪細(xì)胞，待細(xì)胞匯合度達(dá)50%時(shí)，用LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑，50 mol·L-1小干擾RNA片段（si-KLF7-1和si-KLF7-2）以及陰性對照si-NC分別轉(zhuǎn)染3T3-L1前脂肪細(xì)胞，轉(zhuǎn)染6 h后換為添加10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染至24、36和48 h時(shí)，PBS洗滌2遍，按照全式金TransZol Up試劑裂解細(xì)胞，提取總RNA。使用分光光度計(jì)（Eppendorf，Hamburg，Germany）測定所得總RNA OD值，OD260/280在1.8～2.0即為合格。反轉(zhuǎn)錄參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒Primer ScriptTMRT reagentKit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）說明書操作，得到反轉(zhuǎn)錄cDNA。利用FastStart Universal SYBR Green Master（Rox）試 劑盒，反轉(zhuǎn)錄體系為：上、下游引物各0.2 μL，模板1 μL， FastStart Universal SYBR Green Master（Rox）5 μL，ddH2O 3.6 μL。使用 7500 Real-Time PCR System（ABI，Carlsbad，CA，USA）平臺(tái)，PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10 min；95℃變性15 s；60℃復(fù)性延伸60 s，共40個(gè)循環(huán)，每個(gè)樣品設(shè)3孔重復(fù)，設(shè)置檢測mRNA表達(dá)。以HPRT1基因作內(nèi)參基因，獲得數(shù)據(jù)作為Ct值，ΔCt=Ct目的基因-CtHPRT1，利用2-ΔΔCt計(jì)算目的基因相對表達(dá)量。Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)表達(dá)檢測引物，由金唯智公司合成（見表3）。

表3 基因表達(dá)檢測引物信息Table 3 Primers used for gene expression analysis

1.8 Western blot分析

采用6孔板培養(yǎng)3T3-L1前脂肪細(xì)胞，待細(xì)胞匯合度達(dá)50%時(shí)，LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑，50 mol·L-1小干擾RNA片段（si-KLF7-1和si-KLF7-2）以及陰性對照si-NC分別轉(zhuǎn)染3T3-L1前脂肪細(xì)胞，轉(zhuǎn)染6 h后換為添加10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染48 h后，PBS洗滌3遍，含1%PMSF的RIPA裂解緩沖液混勻，冰上裂解細(xì)胞40 min，期間每間隔5 min振蕩15 s，13 000 g離心15 min，收集上清液。蛋白樣按1∶5與6×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液充分混合，100℃煮沸10 min使蛋白充分變性。采用10%SDS-PAGE，100 V電泳1.5 h分離蛋白，將分離蛋白質(zhì)樣品轉(zhuǎn)至0.22 μm孔徑NC膜上，封閉液室溫下封閉2 h后，PBST洗去膜上封閉液，分別加入actin抗體（碧云天）、KLF 7抗體（Santa Cruz Biotechnology）、IL-6抗體（Cell Signaling Technology），4℃下孵育過夜，抗體稀釋比例分別為1∶1 000、1∶500和1∶1 000。PBST洗NC膜3次，每次10 min，加入相應(yīng)二抗（辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG（H+L）抗體和IgG（H+L）/HRP山羊抗鼠二抗），室溫下孵育1 h，稀釋比例為1∶3 000。PBST洗NC膜3次，每次10 min后，采用化學(xué)發(fā)光試劑（ECL）顯色，通過化學(xué)成像系統(tǒng)檢測。以Actin蛋白表達(dá)為內(nèi)部對照。采用Image J軟件分析蛋白灰度。

1.9 數(shù)據(jù)分析

采用GraphPad Prism 5軟件分析數(shù)據(jù)，Student'st-test檢驗(yàn)數(shù)據(jù)，以平均值（Means）±標(biāo)準(zhǔn)誤（SEM）表示。P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 IL-6基因啟動(dòng)子區(qū)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)分析

利用在線軟件JASPAR、Alibaba2、Mulan對獲得IL-6基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游2 000 bp啟動(dòng)子序列作轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)分析。基于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)（TSS）確定啟動(dòng)子區(qū)核苷酸位置，TSS位點(diǎn)確定為+1，TSS上游為負(fù)數(shù)，從-1開始倒數(shù)，下游為正數(shù)，IL-6基因翻譯起始位點(diǎn)（ATG）記為+78（見圖1）。生物信息學(xué)預(yù)測結(jié)果顯示，IL-6基因啟動(dòng)子區(qū)存在多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子潛在結(jié)合位點(diǎn)，其中Sp1/KLFs結(jié)合位點(diǎn)共5個(gè)（見圖1）。這5個(gè)潛在結(jié)合位點(diǎn)分別為 CCTCTCCCCA（-1 694～-1 685 bp）、GGGTGCTGGG（-531～ -522 bp）、CCCCTTCCTA（-171～-162 bp）、CCCCACCCAC（-98～-89 bp）和CCCCACCCCCACCCTCC（-84～-67 bp）?？拷D(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)CCCCACCCAC（-98～-89 bp）和CCCCACCCCCACCCTCC（-84～-67 bp）間隔僅5個(gè)核苷酸。

2.2 小鼠IL-6基因啟動(dòng)子報(bào)告基因載體構(gòu)建及活性分析

根據(jù)上述預(yù)測得到Sp1/KLFs的5個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，設(shè)計(jì)4條上游引物（F1、F2、F3、F4）和1條通用下游引物R1（見圖1），以鼠基因組DNA為模板，采用PCR分別擴(kuò)增出4個(gè)長短不等的IL-6基因啟動(dòng)子片段。1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果顯示，4個(gè)啟動(dòng)子PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與預(yù)期條帶長度一致（見表1）。測序分析顯示，所得4個(gè)啟動(dòng)子片段序列與NCBI數(shù)據(jù)庫序列相似性達(dá)100%，說明成功擴(kuò)增出IL-6基因啟動(dòng)子片段。采用諾唯贊一步克隆試劑盒，將這些IL-6基因啟動(dòng)子片段分別插入pGL3-basic報(bào)告基因載體，獲得4個(gè)啟動(dòng)子報(bào)告基因載體，分別命名為pGL3-IL-6（-1776/+70）、pGL3-IL-6（-483/+70）、pGL3-IL-6（-220/+70）和pGL3-IL-6（-143/+70）。采用SmaⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定各啟動(dòng)子報(bào)告基因載體。結(jié)果如圖2所示，各載體獲得預(yù)期長度片段，表明成功構(gòu)建IL-6基因系列啟動(dòng)子報(bào)告基因載體。

為分析IL-6基因啟動(dòng)子活性，采用轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000將4個(gè)5'端截短報(bào)告基因載體pGL3-IL-6（-1 776/+70）、pGL3-IL-6（-483/+70）、pGL3-IL-6（-220/+70）、pGL3-IL-6（-143/+70），分別與pRL-TK Renilla載體轉(zhuǎn)染3T3-L1前脂肪細(xì)胞，以pGL3-basic載體為對照組，轉(zhuǎn)染48 h后，收集細(xì)胞裂解液，測定雙熒光素酶報(bào)告基因活性。結(jié)果顯示，與pGL3-basic對照組相比，4個(gè)截短啟動(dòng)子 pGL3-IL-6（-1 776/+70）、pGL3-IL-6（-483/+70）、pGL3-IL-6（-220/+70）、pGL3-IL-6（-143/+70）均具有極顯著啟動(dòng)子活性（P＜0.01，見圖3），其中pGL3-IL-6（-483/+70）活性最強(qiáng)。推測IL-6基因啟動(dòng)子區(qū)-1 776～-483 bp區(qū)段存在一些負(fù)調(diào)控元件。

2.3 小鼠IL-6基因啟動(dòng)子區(qū)轉(zhuǎn)錄因子KLF7結(jié)合位點(diǎn)鑒定

為證實(shí)轉(zhuǎn)錄因子KLF7調(diào)控IL-6基因，采用Li-pofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑將pCMV-HA-KLF7及pCMV-HA（NC）陰性對照載體分別與IL-6基因4個(gè)啟動(dòng)子報(bào)告基因載體pGL3-IL-6（-1776/+70）、pGL3-IL-6（-483/+70）、pGL3-IL-6（-220/+70）、pGL3-IL-6（-143/+70）共轉(zhuǎn)染3T3-L1細(xì)胞，pRLTK Renilla載體作為內(nèi)參，以pGL3-basic和pGL3-basic-p21載體分別作為陰性和陽性對照組，48 h后測定雙熒光素酶報(bào)告基因活性，分析KLF7過表達(dá)對IL-6啟動(dòng)子活性的影響。細(xì)胞周期抑制因子p21已被證實(shí)是受KLF7直接調(diào)控的重要靶基因[16-18]。結(jié)果顯示，與預(yù)期一致，KLF7促進(jìn)p21基因啟動(dòng)子活性，與對照組相比，IL-6基因啟動(dòng)子及其截短突變體活性均被極顯著抑制（P＜0.01，見圖4），提示KLF7抑制IL-6基因啟動(dòng)子活性，且IL-6啟動(dòng)子-143～+70 bp區(qū)段至少存在KLF7結(jié)合位點(diǎn)。生物信息學(xué)分析顯示，IL-6基因啟動(dòng)子-143～+70 bp區(qū)段有兩個(gè)Sp1/KLFs結(jié)合位點(diǎn)，分別命名為位點(diǎn)1（CCCCACCCAC）（-98～-89 bp）和位點(diǎn) 2（CCCCACCCCCACCCTCC）（-84～-67 bp）。

為確認(rèn)KLF7是否通過結(jié)合于位點(diǎn)1（CCCCAC CCAC）和位點(diǎn) 2（CCCCACCCCCACCCTCC）發(fā)揮調(diào)控IL-6啟動(dòng)子作用，針對這兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)展開突變分析。將IL-6基因啟動(dòng)子位點(diǎn)1（CCCCACCCA C）和位點(diǎn)2（CCCCACCCCCACCCTCC）分別定點(diǎn)突變，將位點(diǎn)1（CCCCACCCAC）突變?yōu)椋ˋAAAACCC AC）；位點(diǎn)2（CCCCACCCCCACCCTCC）突變?yōu)锳AA AACAAACAAAATCC，共獲得3個(gè)突變型報(bào)告基因載體，其中將位點(diǎn)1和位點(diǎn)2同時(shí)突變的啟動(dòng)子報(bào)告基因載體命名為pGL3-IL-6（-143/+70）Mut1；將位點(diǎn)1單獨(dú)突變的啟動(dòng)子報(bào)告基因載體命名為pGL3-IL-6（-143/+70）Mut2，將位點(diǎn)2單獨(dú)突變的報(bào)告基因載體命名為pGL3-IL-6（-143/+70）Mut3。3個(gè)突變型報(bào)告基因載體與小鼠pCMV-HA-KLF7及pCMV-HA（NC）陰性對照載體、pRL-TK Renilla載體分別共轉(zhuǎn)染3T3-L1細(xì)胞，48 h后測定雙熒光素酶報(bào)告基因活性。結(jié)果顯示，與對照組相比，KLF7過表達(dá)喪失對pGL3-IL-6（-143/+70）Mut1、pGL3-IL-6（-143/+70）Mut2熒光素酶報(bào)告基因活性抑制作用（P＞0.05，見圖5）。但與對照組相比，KLF7過表達(dá)對pGL3-IL-6（-143/+70）Mut3熒光素酶報(bào)告基因活性抑制作用不變（P＜0.05，見圖5）。以上結(jié)果說明KLF7通過結(jié)合于位點(diǎn)1（CCCCA CCCAC）發(fā)揮調(diào)控IL-6作用。

2.4 沉默KLF7對IL-6表達(dá)的影響

為了進(jìn)一步驗(yàn)證KLF7調(diào)控IL-6基因，采用LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑將兩個(gè)已知的KLF7小干擾RNA片段（si-KLF7-1和si-KLF7-2）以及陰性對照si-NC分別轉(zhuǎn)染3T3-L1前脂肪細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24、36和48 h時(shí)，提取細(xì)胞總RNA，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real-time RT-PCR）檢測3T3-L1前脂肪細(xì)胞內(nèi)源性KLF7基因和IL-6基因mRNA表達(dá)水平。結(jié)果顯示，與si-NC對照組相比，轉(zhuǎn)染si-KLF7-1和si-KLF7-2兩組試驗(yàn)組，轉(zhuǎn)染24、36和48 h時(shí)均顯示一定程度的KLF7基因沉默；si-KLF7-2組沉默效率優(yōu)于si-KLF7-1組，轉(zhuǎn)染達(dá)48 h時(shí)KLF7 mRNA水平極顯著低于si-NC對照組（P＜0.01，見圖6A）。轉(zhuǎn)染24、36和48 h同時(shí)檢測IL-6 mRNA表達(dá)水平，與si-NC組相比，si-KLF7-2轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的內(nèi)源性IL-6表達(dá)顯著降低（P＜0.05，見圖6B）。

進(jìn)一步采用Western blot分析敲低KLF7對細(xì)胞內(nèi)源性IL-6蛋白表達(dá)的影響，結(jié)果顯示，當(dāng)KLF7下調(diào)時(shí)3T3-L1前脂肪細(xì)胞內(nèi)源性IL-6蛋白表達(dá)水平也顯著降低（P＜0.05，見圖6C-6D）。與KLF7基因沉默時(shí)細(xì)胞內(nèi)源性IL-6 mRNA水平同步下降結(jié)果一致，上述結(jié)果均提示KLF7調(diào)控IL-6基因表達(dá)。

3 討論與結(jié)論

本研究采用報(bào)告基因、定點(diǎn)突變、RNAi干擾及Western blot等技術(shù)證實(shí)KLF7直接調(diào)控IL-6基因表達(dá)。熒光素酶報(bào)告基因分析顯示，KLF7抑制IL-6基因啟動(dòng)子活性（見圖4）。5'截短啟動(dòng)子突變體報(bào)告基因分析提示，IL-6基因啟動(dòng)子-143～+70 bp區(qū)段至少存在KLF7結(jié)合位點(diǎn)，分析發(fā)現(xiàn)IL-6啟動(dòng)子-143～+70 bp區(qū)段存在兩個(gè)潛在的結(jié)合位點(diǎn)1（CCCCACCCAC）和位點(diǎn)2（CCCCACCCCCACCC TCC）與生物信息學(xué)分析結(jié)果一致。進(jìn)一步定點(diǎn)突變分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，KLF7通過結(jié)合位點(diǎn)1調(diào)控IL-6基因啟動(dòng)子活性（見圖5）。KLF7干擾分析結(jié)果支持KLF7調(diào)控IL-6基因表達(dá)。

生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，IL-6啟動(dòng)子區(qū)存在轉(zhuǎn)錄因子 Sp1/KLFs、C/EBPs、AP-1、CREB/NF-IL-6、NF-κB、GATA的潛在結(jié)合位點(diǎn)（見圖1）。目前已證實(shí)，C/EBPs家族轉(zhuǎn)錄因子通過與IL-6啟動(dòng)子區(qū)REs（Interleukin 6 response elements）相互作用調(diào)控IL-6基因表達(dá)[19]。兔IL-6基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄因子AP-1、NF-κB和CREB/NF-IL-6調(diào)控兔IL-6基因啟動(dòng)子活性[20]。Zhu等研究發(fā)現(xiàn)AP-1、NF-κB及CREB調(diào)控人IL-6啟動(dòng)子活性[21]。此外，巨核細(xì)胞系特異性轉(zhuǎn)錄因子GATA-1可阻斷IL-6誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞分化和鼠髓樣細(xì)胞系M1凋亡[22]。敲低C/EBP可抑制小鼠巨噬細(xì)胞表達(dá)IL-6和TNF-α[23]。前期研究提示，KLF7與IL-6可能存在調(diào)控關(guān)系[6,13-14]，本研究首次證實(shí)KLF7直接調(diào)控IL-6基因轉(zhuǎn)錄。

啟動(dòng)子雙熒光素酶報(bào)告基因分析結(jié)果與KLF7敲低分析結(jié)果不一致，啟動(dòng)子報(bào)告基因活性分析提示，KLF7抑制IL-6基因啟動(dòng)子活性，但KLF7敲低分析提示，KLF7促進(jìn)內(nèi)源性IL-6基因表達(dá)（見圖4～6）。差異原因可能是：①報(bào)告基因載體為裸露的環(huán)狀DNA分子，無染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，也不存在相應(yīng)DNA和組蛋白表觀遺傳修飾等，因此IL-6基因啟動(dòng)子報(bào)告基因載體無法反映細(xì)胞內(nèi)染色質(zhì)真實(shí)狀態(tài)；②本研究所用啟動(dòng)子并非IL-6基因完整啟動(dòng)子，不包含其遠(yuǎn)端啟動(dòng)子調(diào)控元件以及增強(qiáng)子、超級(jí)增強(qiáng)子、抑制子等，而體內(nèi)KLF7調(diào)控需KLF7與IL-6基因啟動(dòng)子近端、遠(yuǎn)端順式元件、上游增強(qiáng)子及其他轉(zhuǎn)錄因子共同作用，實(shí)現(xiàn)IL-6基因調(diào)控。因此，本研究報(bào)告基因分析可能未完全反映染色質(zhì)水平IL-6基因調(diào)控。

本研究報(bào)告基因分析發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)KLF7抑制IL-6啟動(dòng)子活性，但Zhang等在293T細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染分析發(fā)現(xiàn)，KLF7過表達(dá)顯著提高人IL-6啟動(dòng)子活性[14]。這一差異可能由研究所用啟動(dòng)子和細(xì)胞不同造成。本研究分析鼠IL-6基因啟動(dòng)子，所用細(xì)胞為鼠3T3-L1前脂肪細(xì)胞；而Zhang等分析人IL-6啟動(dòng)子，所用細(xì)胞為人293T細(xì)胞。人與鼠IL-6啟動(dòng)子序列不完全相同；鼠3T3-L1細(xì)胞和人293T細(xì)胞表達(dá)反式作用因子不完全相同。

本研究采用體外分析證實(shí)KLF7調(diào)控IL-6基因表達(dá)，未來有必要通過染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）分析體內(nèi)KLF7結(jié)合IL-6基因啟動(dòng)子位點(diǎn)；采用基因敲除、轉(zhuǎn)基因以及基因編輯技術(shù)開展體內(nèi)KLF7對IL-6基因表達(dá)的調(diào)控作用研究。深入開展KLF7調(diào)控研究將有助于揭示KLF7在脂肪生成和脂肪細(xì)胞表型維持中作用機(jī)制及其在肥胖癥等相關(guān)疾病發(fā)生中的作用。