蘋果屬小金海棠WRKY48基因克隆與功能初步分析

韓德果，周正一，杜 漫，李鐵梅，王 爽，楊國慧

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部東北地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150030）

鐵是植物生命活動(dòng)必需元素，在植物生理上發(fā)揮重要作用[1]。在葉綠素形成過程中十分重要，缺鐵導(dǎo)致葉綠素解體乃至葉片嚴(yán)重失綠。另外，鐵是一些關(guān)鍵氧化還原酶（如SOD、CAT和POD等）組分，位于血紅蛋白電子轉(zhuǎn)移鍵上的鐵在催化氧化還原反應(yīng)中可變成氧化態(tài)或還原態(tài)，即減少或增加一個(gè)電子，是植物生理反應(yīng)中重要的電子傳遞體[2]。鐵元素作為鐵蛋白組成部分，在光合作用、呼吸作用等過程中均發(fā)揮極為重要作用。植物在缺鐵或高鐵環(huán)境中形成一種自我保護(hù)機(jī)制抵御鐵脅迫危害，轉(zhuǎn)錄因子則在這一機(jī)制中發(fā)揮關(guān)鍵作用[3]。轉(zhuǎn)錄因子（Transacting factor，TF）可單獨(dú)或與其他相關(guān)蛋白形成復(fù)合體，以序列特異性結(jié)合方式與啟動(dòng)子區(qū)域中DNA序列結(jié)合調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄，調(diào)控植物生長發(fā)育及植株對各脅迫應(yīng)答反應(yīng)[4]。

WRKY類轉(zhuǎn)錄因子作為植物轉(zhuǎn)錄因子家族重要分支，其氨基酸序列中均有1～2個(gè)保守WRKY結(jié)構(gòu)域（氨基酸殘基為WRKYGQK），WRKY的DNA結(jié)合域一般包含一個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)域（C-X4-5-CX22-23-H-X1-H或 C-X7-C-X23-H-X1-C）[5]。WRKY調(diào)控因子僅存在于植物中，與下游基因啟動(dòng)子特異性結(jié)合，調(diào)控下游基因表達(dá)強(qiáng)度[6]。研究證實(shí)，模式植物擬南芥中有75個(gè)WRKY轉(zhuǎn)錄因子[7]，而禾本科作物水稻中RKY轉(zhuǎn)錄因子有109個(gè)[8]。在轉(zhuǎn)基因擬南芥中過表達(dá)甘薯IbWRKY2基因提高轉(zhuǎn)基因擬南芥在鹽脅迫和干旱脅迫下體內(nèi)脯氨酸含量和超氧化物歧化酶（SOD）活性，并使轉(zhuǎn)基因擬南芥耐旱性和耐鹽性增強(qiáng)[9]。在水稻中發(fā)現(xiàn)一種新ABA信號抑制因子OsWRKY29，通過直接下調(diào)OsABF1和OsVP1表達(dá)抑制種子休眠[10]。此外，擬南芥中某些WRKY基因也調(diào)控體內(nèi)水楊酸合成[11]。高溫誘導(dǎo)水稻OsWRKY11基因表達(dá)量上調(diào)，且過表達(dá)試驗(yàn)證明該基因提高轉(zhuǎn)基因植株對高溫脅迫耐受性[12]。

關(guān)于WRKY報(bào)道主要在高溫、高鹽、缺水等逆境脅迫方面，關(guān)于鐵脅迫研究較少。小金海棠是蘋果屬中鐵高效基因型植物，其鐵吸收機(jī)制遵循機(jī)理Ⅰ模式，因在四川省小金縣發(fā)現(xiàn)故而得名[13]，近年隨著鐵吸收與轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制研究深入，該物種已成為研究蘋果屬植物鐵運(yùn)輸模式植物[3]。目前已在小金海棠中克隆并研究多種耐鐵脅迫基因。小金海棠MxCS1-3基因參與檸檬酸合成酶生成并影響檸檬酸含量，而轉(zhuǎn)化MxCS1-3基因植株對鐵脅迫耐受性顯著上調(diào)[1,3]。小金海棠MxNAS1-2基因受鐵脅迫表達(dá)上調(diào)，轉(zhuǎn)MxNAS1-2基因明顯提高植株耐鐵脅迫能力[2]。因此以小金海棠為試驗(yàn)材料研究WRKY轉(zhuǎn)錄因子在鐵脅迫過程中作用機(jī)制具有重要意義。

本試驗(yàn)從小金海棠中分離得到一個(gè)WRKY家族基因，命名為MxWRKY48，借助農(nóng)桿菌侵染法將MxWRKY48轉(zhuǎn)化至模式植物擬南芥，通過測定模式植物各項(xiàng)生理指標(biāo)分析和鑒定其功能，從分子育種角度選育鐵脅迫抗性強(qiáng)新品種，為今后研究提供分子基礎(chǔ)和新備選基因。

1 材料與方法

1.1 材料

根據(jù)Han等方法[1]，將蘋果屬小金海棠組培苗在MS培養(yǎng)基上快速生長。待幼苗長至5 cm時(shí)，剪去小金海棠幼苗莖底部愈傷組織和底部多余葉片，僅留頂部3片葉，接種于1.0 mg·L-1IBA的MS生根培養(yǎng)基，培養(yǎng)40 d，至幼苗長出根系，挑選根系強(qiáng)壯小金海棠無菌苗轉(zhuǎn)至霍格蘭氏（Hoagland）培養(yǎng)液中再生長約35 d，幼苗10 cm時(shí)取材和脅迫處理。

提取RNA試劑盒為OminiPlant RNA Kit（DN-ase I）試劑盒，膠回收試劑盒使用Gel Extraction Kit，均購自康為世紀(jì)生物科技有限公司。cDNA第一鏈合成使用Trans Script?First-Strand cDNA Synthesis Super Mix試劑盒、Trans-T1感受態(tài)細(xì)胞和基因克隆試劑盒pEASY-T1 Simple Cloning Kit均購于北京全式金生物技術(shù)有限公司。擴(kuò)增引物與菌液測序均由北京擎科生物科技有限公司完成。實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析采用TB Green?Premix ExTaq? II（Tli RNaseH Plus）試劑盒，購自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司。農(nóng)桿菌感受態(tài)選用GV3101，購自上海唯地生物技術(shù)有限公司。

1.2 MxWRKY48基因克隆

參考蘋果屬金冠MdWRKY48基因組序列，利用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物MxWRKY48-F和MxWRKY48-R（見表1）擴(kuò)增MxWRKY48基因全長序列。CATB法提取小金海棠各部位總RNA[3]，Script?First-Strand cDNA Synthesis Super Mix試劑盒合成第一鏈cDNA。然后以該cDNA為模板作PCR反應(yīng)。膠回收目的條帶，將膠回收產(chǎn)物連接到pEASY-T1載體上，轉(zhuǎn)化Trans-T1感受態(tài)細(xì)胞后對陽性菌落挑菌測序。

表1 研究所用引物序列Table 1 Primers used in the study

1.3 MxWRKY48生物信息學(xué)分析

DNAMAN 6.0翻譯克隆得到MxWRKY48基因序列，使用ProtParam tool預(yù)測MxWRKY48總平均親水系數(shù)、相對分子質(zhì)量和理論等電點(diǎn)。利用NCBI的blast查找同源蛋白序列，再用DNAMAN 6.0比對同源蛋白，MEGA 7.0分析WRKY家族成員同源性。

1.4 MxWRKY48蛋白亞細(xì)胞定位

亞細(xì)胞定位方法參照宋毓峰等方法[14]。以反轉(zhuǎn)錄得到cDNA為模板，以MxWRKY48-F2和Mx-WRKY48-R2為引物，PCR擴(kuò)增MxWRKY48基因ORF。使用BamH I和SalI酶將PCR產(chǎn)物雙酶切，將酶切后產(chǎn)物連入含綠色熒光蛋白（GFP）的pSAT6-RFP-N1載體BamHⅠ和SalⅠ酶切位點(diǎn)。以空載體為對照，通過基因槍法將含MxWRKY48-GFP質(zhì)粒和對照質(zhì)粒分別導(dǎo)入洋蔥表皮細(xì)胞。使用共聚焦顯微鏡拍攝MxWRKY48-GFP融合和對照蛋白，4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色細(xì)胞核觀察并拍照。

1.5 MxWRKY48在不同組織及處理中表達(dá)模式分析

1.5.1 組織特異性分析

在25℃條件下，分別取未處理小金海棠水培苗莖、新葉、根和老葉材料，立即液氮冷凍，-80℃冰箱備用。提取上述材料RNA反轉(zhuǎn)錄，作實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR），分析其不同部位表達(dá)情況。

1.5.2 高鐵、低鐵、低溫及鹽脅迫處理

從培養(yǎng)好小金海棠水培苗中各取20株轉(zhuǎn)移至不同F(xiàn)e濃度4 μmol·L-1（低鐵）、40 μmol·L-1（正常）和 160 μmol·L-1（高鐵）霍格蘭氏營養(yǎng)液中培養(yǎng)24 h；將其中20株培養(yǎng)在高鹽（200 mmol·L-1NaCl）霍格蘭氏培養(yǎng)液中處理24 h；取20株在低溫（2℃）霍格蘭氏營養(yǎng)液處理24 h。分別在處理第0、1、3、6、9、12、24 h時(shí)試驗(yàn)材料水培苗根和新葉取材。上述材料液氮速凍后置于-80℃冰箱備用。CATB法提取RNA并反轉(zhuǎn)錄，Primer 5.0設(shè)計(jì)引物MxWRKY48-qF和MxWRKY48-qR（見表1），作qPCR，分析該基因定量表達(dá)情況。

1.5.3 數(shù)據(jù)分析與處理

內(nèi)參選用Actin基因，設(shè)計(jì)引物Actin-F和Actin-R（見表1）。利用實(shí)時(shí)定量PCR和2-ΔΔCT法計(jì)算分析目的基因表達(dá)量，試驗(yàn)設(shè)置3次重復(fù)。

1.6 擬南芥轉(zhuǎn)化和篩選

為構(gòu)建擬南芥超表達(dá)載體，通過PCR程序?qū)amHⅠ和SalⅠ酶切位點(diǎn)序列分別添加到Mx-WRKY48的cDNA 5'和3'端。將pCAMBIA2300質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和SalⅠ酶切，使用同源重組試劑盒（諾唯贊公司）將PCR產(chǎn)物與酶切后質(zhì)粒連接獲得pCAMBIA2300-MxWRKY48過表達(dá)載體，之后將其轉(zhuǎn)入GV3101。利用花序浸染法侵染野生型擬南芥獲得T0代轉(zhuǎn)基因植株。收取T0代成熟種子后將其播種在含50 mg·L-1Kana的MS篩選培養(yǎng)基中，選取長至2片真葉陽性植株轉(zhuǎn)移至營養(yǎng)土（營養(yǎng)土∶蛭石=3∶1）中培養(yǎng)，提取轉(zhuǎn)基因擬南芥葉片DNA，選取兩對引物Actin-F、Actin-R和Mx-WRKY48-F和MxWRKY48-R作PCR檢測，收獲驗(yàn)證為陽性種子。后繼續(xù)培養(yǎng)直至收獲T3代植株。

1.7 轉(zhuǎn)MxWRKY48擬南芥耐低鐵和高鐵脅迫性分析

將野生型擬南芥種子和隨機(jī)選取篩選好的S1、S4和S6 3個(gè)T3代轉(zhuǎn)MxWRKY48株系種子消毒后播種于MS培養(yǎng)基，待其長出4片真葉后，將這4個(gè)株系擬南芥植株均各取30株轉(zhuǎn)移至FeNa-EDTA濃度為4 μmol·L-（1低鐵水平）、100 μmol·L-1（正常鐵水平）、400 μmol·L-（1高鐵水平），其他濃度正常MS培養(yǎng)基上生長。第14天時(shí)對各株系拍照，測量植株主根長和鮮重，參照袁方等[15]和Liu等[16]方法分別測定葉片葉綠素和鐵元素含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 MxWRKY48基因序列分析

MxWRKY48基因ORF為1 116 bp。MxWRKY48蛋白含371個(gè)氨基酸，分子質(zhì)量約為41.143 ku，理論等電點(diǎn)約為5.80，平均親水系數(shù)為-0.852。DNAMAN 6.0序列分析顯示MxWRKY48氨基酸序列中包含1個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)C2H2（C-X4-C-X22-H-X-H）和1個(gè)WRKY結(jié)構(gòu)域，由此應(yīng)將MxWRKY48歸于II-c類。

2.2 MxWRKY48同源蛋白分析

DNAMAN 6.0多重序列比對結(jié)果如圖1A所示。圖中各序列均含有1個(gè)WRKY結(jié)構(gòu)域和1個(gè)C2H2類型鋅指結(jié)構(gòu)。如圖1B所示，系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明，MxWRKY48屬于WRKYs家族成員，MxWRKY48蛋白與蘋果屬金冠MdWRKY48親緣關(guān)系最近。

2.3 MxWRKY48蛋白亞細(xì)胞定位

在轉(zhuǎn)化MxWRKY48-GFP蛋白洋蔥表皮細(xì)胞時(shí)僅在細(xì)胞核上觀察到綠色熒光（見圖2E），而轉(zhuǎn)化GFP對照質(zhì)粒則可在洋蔥表皮細(xì)胞各部位觀察到綠色熒光（見圖2B）。同時(shí)DAPI染色照片藍(lán)色熒光確定細(xì)胞核位置與綠色熒光位置相同（見圖2C、F），因此判斷MxWRKY48定位在細(xì)胞核上。

2.4 MxWRKY48表達(dá)模式分析

利用qPCR測定小金海棠不同部位MxWRKY48基因表達(dá)水平。如圖3A所示，在新葉中MxWRKY48基因表達(dá)量顯著高于根、成熟葉和莖中。如圖3B所示，在不同脅迫處理下，MxWRKY48在根中表達(dá)量均隨時(shí)間增加而呈上調(diào)趨勢。在低溫脅迫下，根中MxWRKY48基因表達(dá)量在3 h時(shí)開始迅速增加，在6 h時(shí)上升至最高值，之后逐漸降低；在鹽脅迫下，根中MxWRKY48基因表達(dá)量在3 h時(shí)開始顯著增加，9 h時(shí)表達(dá)量升至最高，接下來呈下降趨勢；在低鐵脅迫下，根中MxWRKY48基因表達(dá)量在1 h時(shí)開始迅速增加，6 h時(shí)表達(dá)量最高，后呈下降趨勢；在高鐵脅迫下，根中MxWRKY48基因表達(dá)量在3 h時(shí)升高，9 h時(shí)達(dá)最高，隨后開始下降。如圖3C所示，在低溫處理時(shí)，MxWRKY48基因在葉中表達(dá)量在初期（1 h）升高，在3 h時(shí)達(dá)極值，是未處理時(shí)8倍，隨后逐步下降；在鹽、低鐵、高鐵處理時(shí)，該基因在葉中表達(dá)變化呈相似趨勢，9 h時(shí)達(dá)極值，其表達(dá)量分別為0 h時(shí)6.5、7.5、6.8倍。以上數(shù)據(jù)顯示，低鐵、高鐵、低溫和鹽處理均使Mx-WRKY48在該蘋果屬材料根和葉中顯著上調(diào)表達(dá)。

2.5 轉(zhuǎn)化MxWRKY48基因增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因擬南芥對低鐵和高鐵脅迫耐受能力

利用花序侵染法轉(zhuǎn)MxWRKY48基因擬南芥，T1代轉(zhuǎn)基因擬南芥鑒定結(jié)果顯示（見圖4A）在15個(gè)轉(zhuǎn)基因擬南芥株系中有6個(gè)株系（S1、S4、S5、S6、S14、S15）確定為轉(zhuǎn)基因擬南芥，隨機(jī)挑選S1、S4、S6株系開展脅迫試驗(yàn)。如圖4B所示，正常鐵水平處理時(shí)（100 μmol·L-1Fe），野生型株系WT和轉(zhuǎn)MxWRKY48株系（S1、S4、S6）間無明顯差異，株系均可正常生長。但在缺鐵處理（4 μmol·L-1Fe）下生長14 d后，野生型擬南芥葉片明顯黃化失綠，出現(xiàn)典型枯黃萎病癥狀，且長勢較弱。而轉(zhuǎn)基因擬南芥株系（S1、S4、S6）生長狀態(tài)顯著優(yōu)于野生型擬南芥WT。在高鐵濃度（400 μmol·L-1Fe）處理14 d后，野生型擬南芥植株葉片縮小出現(xiàn)高鐵毒害癥狀且根部短小，而轉(zhuǎn)基因植株葉片仍呈深綠色，生長狀態(tài)較好。

為確定低鐵和高鐵脅迫對不同植株生長狀況，測定野生型株系WT和轉(zhuǎn)MxWRKY48基因型株系（S1、S4、S6）葉片葉綠素含量、主根長度、植株鮮重和鐵含量。如圖5A所示，正常Fe濃度下，轉(zhuǎn)擬南芥和野生型擬南芥葉片中葉綠素含量處于同一水平。低鐵處理轉(zhuǎn)基因擬南芥與野生型14 d后，同對照處理相比，兩者葉片葉綠素含量均顯著降低，但轉(zhuǎn)MxWRKY48基因擬南芥葉片中葉綠素減少量低于野生型擬南芥葉片；高鐵處理野生型擬南芥與轉(zhuǎn)MxWRKY48基因擬南芥14 d后，同對照處理相比，兩者葉綠素含量分別下降52%和37%，此時(shí)轉(zhuǎn)基因植株葉綠素下降量少于野生型擬南芥。說明MxWRKY48基因在轉(zhuǎn)基因擬南芥中過表達(dá)使植株在受低鐵和高鐵脅迫時(shí)，減少體內(nèi)葉綠素分解。如圖5B所示，在正常處理14 d后，轉(zhuǎn)MxWRKY48株系（S1、S4、S6）和野生型擬南芥根長度無顯著差異。低鐵和高鐵處理14 d后，轉(zhuǎn)MxWRKY48株系（S1、S4、S6）根長均顯著高于野生型株系。

如圖5C所示，對照條件下，轉(zhuǎn)MxWRKY48基因擬南芥和野生型擬南芥中鐵含量無顯著差異。低鐵處理14 d后，野生型擬南芥和轉(zhuǎn)基因擬南芥鐵含量均受到影響，與對照處理相比分別下降43%和16%，此時(shí)野生型擬南芥鐵含量低于轉(zhuǎn)基因擬南芥；高鐵處理14 d后，野生型擬南芥和轉(zhuǎn)基因擬南芥鐵含量分別升高42%和71%，此時(shí)轉(zhuǎn)基因擬南芥鐵元素含量仍高于野生型擬南芥。如圖5D所示，在正常處理14 d后，轉(zhuǎn)MxWRKY48株系（S1、S4、S6）和野生型擬南芥鮮重?zé)o顯著差異。低鐵和高鐵處理14 d后，轉(zhuǎn)MxWRKY48株系（S1、S4、S6）鮮重均顯著高于野生型株系。以上結(jié)果表明，MxWRKY48基因在轉(zhuǎn)基因擬南芥中表達(dá)導(dǎo)致在低鐵和高鐵脅迫下植株、葉綠素含量、主根長度、鮮重和鐵含量增加，提高抵抗低鐵和高鐵脅迫能力。

3 討論與結(jié)論

WRKY轉(zhuǎn)錄因子在植物中廣泛存在，近年來在大豆[17]、水稻[18]、玉米[19]等植物出現(xiàn)相關(guān)報(bào)道。研究結(jié)果表明，WRKY在廣泛參與植物應(yīng)對生物和非生物脅迫等生理生化反應(yīng)過程調(diào)控過程[20]。主要集中在禾本科植物抗鹽和低溫脅迫等方面，關(guān)于果樹抗鐵脅迫方面研究報(bào)道較少。

本試驗(yàn)在小金海棠中克隆得到一條與金冠蘋果MdWRKY48基因相似性較高WRKY基因，命名為MdWRKY48。DNAMAN 6.0序列分析顯示Md-WRKY48氨基酸序列和選取的其他13種氨基酸序列均含有一個(gè)WRKY結(jié)構(gòu)域和一個(gè)C2H2（C-X4-CX22-H-X-H）型鋅指結(jié)構(gòu)，可將其歸類為WRKY基因家族中第II類基因。同源進(jìn)化樹也表明Mx-WRKY48屬于WRKY基因家族，與MdWRKY48相似性最高。研究表明，AtWRKY61[21]、CsWRKY50[22]、Sc-WRKY6[23]及GhWRKY40[24]均定位于細(xì)胞核。洋蔥亞細(xì)胞定位試驗(yàn)結(jié)果表明MxWRKY48蛋白定位于細(xì)胞核，與前人研究結(jié)果一致，以上結(jié)果表明Mx-WRKY48基因是WRKYs基因家族成員。

熒光定量PCR結(jié)果顯示MxWRKY48基因在蘋果屬小金海棠各部位均表達(dá)，在新葉中表達(dá)豐度高于根、成熟葉和莖，表明MxWRKY48可能在生理功能活躍的植物器官中發(fā)揮重要作用。在4種脅迫處理下，MxWRKY48在小金海棠新葉和根中表達(dá)量均呈初期增加，達(dá)到最大值后逐漸降低趨勢。在低鐵和高鐵脅迫處理時(shí)，MxWRKY48基因在根中表達(dá)量分別于6和9 h達(dá)最大值，顯著早于新葉中達(dá)到最大值時(shí)間（12 h），表明鐵脅迫時(shí)MxWRKY48基因首先在根中響應(yīng)，之后傳遞到葉中。對于Mx-WRKY48基因表達(dá)來說，鹽脅迫信號首先在根中響應(yīng)，再傳遞到葉；而低溫脅迫首先在葉中響應(yīng)，再傳遞到根。以上結(jié)果表明MxWRKY48基因可能廣泛參與蘋果屬小金海棠抵抗高鐵、低鐵、低溫和鹽脅迫信號傳導(dǎo)過程。因?yàn)殍F脅迫處理，特別是低鐵脅迫處理對MxWRKY48基因表達(dá)量影響最顯著，達(dá)極值時(shí)間最早，因此本試驗(yàn)著重研究Mx-WRKY48基因在鐵脅迫方面功能。

擬南芥轉(zhuǎn)化試驗(yàn)結(jié)果顯示，MxWRKY48基因在擬南芥中過表達(dá)顯著提高植株對高鐵和低鐵脅迫抵抗能力。在低鐵處理下，轉(zhuǎn)MxWRKY48基因擬南芥葉片黃化現(xiàn)象不明顯，而野生型擬南芥葉片失綠，出現(xiàn)明顯黃化。此時(shí)轉(zhuǎn)MxWRKY48基因擬南芥主根長度、鮮重、葉片中葉綠素和鐵含量均顯著高于野生型擬南芥。表明MxWRKY48基因在轉(zhuǎn)基因擬南芥中超表達(dá)提高擬南芥對低鐵脅迫抵抗能力。在高鐵脅迫下，轉(zhuǎn)基因擬南芥葉片黃化現(xiàn)象較輕；而野生型擬南芥葉片失綠變紫，生長情況嚴(yán)重受阻。同時(shí)轉(zhuǎn)MxWRKY48基因擬南芥葉片中葉綠素和鐵含量也顯著高于野生型擬南芥（見圖4、5）。表明在低鐵和高鐵脅迫時(shí)，轉(zhuǎn)基因擬南芥中MxWRKY48基因過表達(dá)促進(jìn)體內(nèi)鐵轉(zhuǎn)運(yùn)，減少葉綠素分解，從而增強(qiáng)植株對低鐵和高鐵脅迫耐受性。