UPLC-MS-MS法測定原料藥中對甲苯磺酸酯類遺傳毒性雜質(zhì)*

勾新磊，徐雙雙，趙 婷，張 梅，劉偉麗，高 峽，趙新穎，胡光輝

(北京市理化分析測試中心，有機(jī)材料檢測技術(shù)與質(zhì)量評價(jià)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 北京 100089)

硫酸氫氯吡格雷是一種具有抑制血小板聚集作用的藥物，臨床上主要用于預(yù)防或者治療中風(fēng)及心肌梗死、外周動(dòng)脈疾病等心血管系統(tǒng)疾病[1-3]。硫酸氫氯吡格雷的合成方法中會(huì)使用到對甲苯磺酰氯，若沒有在工藝中完全除去，會(huì)與后面使用的甲醇或乙醇發(fā)生反應(yīng)，生成對甲苯磺酸甲酯和對甲苯磺酸乙酯[4]。對甲苯磺酸酯類物質(zhì)均具有潛在的遺傳毒性，與人體的DNA有直接作用，導(dǎo)致DNA的損傷，會(huì)產(chǎn)生致癌、致畸或致突變等后果，因此有必要建立硫酸氫氯吡格雷中對甲苯磺酸酯類物質(zhì)的檢測方法。

目前報(bào)道的檢測方法主要有液相色譜法，氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法，液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法等[5-8]。液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)具有分析速度快、靈敏度高、結(jié)果準(zhǔn)確可靠的特點(diǎn)，能夠滿足遺傳毒性雜質(zhì)的檢測[9]。本文建立了硫酸氫氯吡格雷中對甲苯磺酸甲酯和對甲苯磺酸乙酯的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC-MS/MS)檢測方法，為硫酸氫氯吡格雷在生產(chǎn)監(jiān)控過程中提供技術(shù)支持和數(shù)據(jù)支撐。

1 儀器與耗材

超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀，美國沃特世公司； Milli-Q 超純水器，美國Millipore公司； XPE105電子天平，瑞士梅特勒托利多公司；ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)，沃特世公司。

對甲苯磺酸甲酯(純度>99.7%)、對甲苯磺酸乙酯(純度>99.8%)，均購于Alfa Aesar；乙腈、甲酸均為色譜級，默克公司；硫酸氫氯吡格雷原料藥。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜質(zhì)譜條件

2.1.1 質(zhì)譜條件

采用電噴霧正離子化(ESI+)測定2個(gè)遺傳毒性雜質(zhì)，優(yōu)化后的參數(shù)如下：毛細(xì)管電壓3.0 kV，離子源溫度150 ℃，脫溶劑氣溫度350 ℃，脫溶劑氣流速650 L/h，錐孔氣流速20 L/h，萃取電壓：5.0 V。多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式檢測，實(shí)驗(yàn)參數(shù)見表1。

表1 雜質(zhì)的質(zhì)譜條件

2.1.2 色譜條件

液相色譜柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)；0.1%甲酸水溶液為流動(dòng)相A，乙腈溶液為流動(dòng)相B；梯度洗脫(0～4 min，20%B → 80% B；4～6 min，80% B； 6～6.5 min，80%B → 20% B；6.5～8 min，20% B)；流速0.2 mL/min；柱溫35 ℃；進(jìn)樣體積5 μL?？傠x子流圖見圖1。

圖1 對甲苯磺酸甲酯(A)和對甲苯磺酸乙酯(B) 對照品溶液總離子流圖

2.2 溶液配制

2.2.1 雜質(zhì)對照溶液配制

分別準(zhǔn)確稱取適量上述2種雜質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品，乙腈溶解定容，制得質(zhì)量濃度均為1000 mg/L 的儲備液。準(zhǔn)確移取各標(biāo)準(zhǔn)儲備液，混于100 mL 容量瓶中，用乙腈定容，配制成目標(biāo)物濃度為1 mg/L 混合對照品儲備液。所有標(biāo)準(zhǔn)溶液在4 ℃下保存。

2.2.2 供試品溶液

取硫酸氫氯吡格雷原料藥約100 mg，置于10 mL 量瓶中，加入乙腈10 mL溶解，并稀釋至刻度，搖勻均勻，作為供試品溶液。

2.3 專屬性試驗(yàn)

在所建立的色譜和質(zhì)譜條件下，2種遺傳毒性雜質(zhì)的保留時(shí)間分別為4.20和4.55 min，2種物質(zhì)完全分離。供試品溶液、空白稀釋劑和雜質(zhì)對照溶液中各雜質(zhì)的檢查無干擾。

2.4 檢測限和定量限

取2種雜質(zhì)對照品儲備液，稀釋至各雜質(zhì)峰高約為基線噪音的10 倍，測得對甲苯磺酸甲酯和對甲苯磺酸乙酯的定量限濃度均為5.0 ng·mL-1。連續(xù)進(jìn)樣6 次，對甲苯磺酸甲酯和對甲苯磺酸乙酯峰面積的RSD 分別為2.4%和1.8%，表明定量限具有一定的精密度。

取定量限溶液，稀釋后進(jìn)樣測定至各雜質(zhì)峰高約為基線噪音的3 倍，測得對甲苯磺酸甲酯和對甲苯磺酸乙酯的檢測限濃度為1.667 ng·mL-1。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線

精密量取“2.2.1”項(xiàng)下雜質(zhì)混合溶液適量，稀釋后制成各雜質(zhì)的質(zhì)量濃度均分別約為20、50、100和200 ng·mL-1的系列溶液，與定量限溶液參照“2.1”項(xiàng)下條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。以質(zhì)量濃度X(ng·mL-1)為橫坐標(biāo)，主峰面積Y 為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸。對甲苯磺酸甲酯線性回歸方程分別為Y=72.6X+68.4，r=0.997；對甲苯磺酸甲酯線性回歸方程分別為Y=101.5X+83.1，r=0.998。結(jié)果表明，各雜質(zhì)線性關(guān)系良好。

2.6 回收率試驗(yàn)

取硫酸氫氯吡格雷原料藥樣品各9份，每份約100 mg，分別置于10mL容量瓶中，精密加入雜質(zhì)混合溶液，稀釋至刻度，配置80 ng·mL-1、100 ng·mL-1、120 ng·mL-13個(gè)濃度的供試品溶液各3份，進(jìn)樣分析，根據(jù)“2.5”項(xiàng)下線性方程計(jì)算，對甲苯磺酸甲酯的平均回收率分別為94.1%～100.5%，RSD分別為1.7%～3.7%，對甲苯磺酸乙酯的平均回收率分別為96.9%～105.3%，RSD分別為2.1%～4.4%，所以本方法回收率良好。

2.7 進(jìn)樣精密度和重復(fù)性試驗(yàn)

取“2.2.1”項(xiàng)下雜質(zhì)對照溶液，連續(xù)進(jìn)樣6 次，計(jì)算得對甲苯磺酸甲酯和對甲苯磺酸乙酯峰面積的RSD分別為1.7%、1.9%，表明進(jìn)樣精密度良好。

取硫酸氫氯吡格雷原料藥樣品適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法平行制備6 份供試品溶液，樣品均未檢出雜質(zhì)；另配制含雜質(zhì)均約為100 ng·mL-1的供試品溶液6 份，進(jìn)樣測定，計(jì)算得對甲苯磺酸甲酯和對甲苯磺酸乙酯峰面積的RSD分別為2.1%和1.8%，表明方法重復(fù)性良好。

2.8 樣品檢測

取3 批硫酸氫氯吡格雷原料藥樣品，按外標(biāo)法計(jì)算硫酸氫氯吡格雷中雜質(zhì)的含量。結(jié)果顯示，3 批樣品中均未檢出對甲苯磺酸甲酯和對甲苯磺酸乙酯。

3 結(jié) 論

本方法經(jīng)方法學(xué)試驗(yàn)驗(yàn)證，方法專屬強(qiáng)，靈敏度高，能夠滿足硫酸氫氯吡格雷中的對甲苯磺酸酯類遺傳雜質(zhì)測定要求，可作為硫酸氫氯吡格雷遺傳毒性雜質(zhì)的質(zhì)量控制方法。