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    CO2激光犬聲帶全切除后不同時間細胞外基質(zhì)表達△

    2020-11-15 03:51:08汪斌如張瑩瑩楊麗萍劉莉陳始明梁耕田
    聽力學(xué)及言語疾病雜志 2020年6期
    關(guān)鍵詞:喉鏡聲帶瘢痕

    汪斌如 張瑩瑩 楊麗萍 劉莉 陳始明 梁耕田

    聲帶固有層主要由細胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)組成,其組織結(jié)構(gòu)決定了聲帶的振動特性和粘膜波功能,是正常發(fā)聲的基礎(chǔ)[1,2]。正常情況下,ECM的合成和降解處于動態(tài)平衡,以維持聲帶的發(fā)聲功能;在手術(shù)、感染、外傷等病理情況下,ECM的動態(tài)平衡受到破壞,就會出現(xiàn)聲帶瘢痕而引起永久性聲嘶甚至失聲[3,4]。目前有關(guān)聲帶損傷后ECM中相關(guān)因子表達致聲帶瘢痕的具體發(fā)病機制尚不清楚,其可能是聲帶瘢痕形成和難以治愈的原因之一[2~4]。前期研究顯示,犬聲帶損傷后12 w時聲帶固有層ECM膠原纖維過度無序增生和彈性纖維減少,出現(xiàn)了聲帶瘢痕[5]。賴氨酰氧化酶(lysyl oxidase, LOX)、基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)和缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia inducible factor 1α, HIF-1α)在ECM的合成和傷口愈合中發(fā)揮重要作用[6~8],其中,LOX參與ECM膠原蛋白和彈性蛋白的翻譯后修飾過程,MMPs參與ECM各種蛋白的降解、血管形成,MMPs的異常表達是組織損傷后不能自我修復(fù)的重要原因;HIF-1α參與了組織損傷后的蛋白合成和微血管形成等過程。有關(guān)研究顯示,調(diào)節(jié)LOX基因和MMP基因的表達對韌帶和心肌損傷修復(fù)具有重要的影響[9~11]。目前有關(guān)LOX、MMPs和HIF-1α在聲帶修復(fù)中的研究較少,推測LOX、MMP-1可能在聲帶損傷后創(chuàng)面自身愈合及瘢痕形成中發(fā)揮著不同的作用。故本研究擬采用CO2激光切除犬雙側(cè)聲帶,觀察術(shù)前和術(shù)后不同時間段聲帶形態(tài)學(xué)、ECM中LOX、MMP-1和HIF-1α在聲帶創(chuàng)面愈合過程中的動態(tài)表達特點,探討聲帶損傷后的修復(fù)機制。

    1 材料與方法

    1.1實驗動物及分組 5只健康成年雄性中華田園犬(湖北省瑞科森試驗動物有限公司提供,體重12~15 kg),數(shù)字表法隨機分為實驗組(4只,8側(cè)聲帶)和對照組(1只,2側(cè)聲帶)。實驗組分別行支撐喉鏡下CO2激光雙側(cè)聲帶切除術(shù),于術(shù)后6 h、3 w、8 w和12 w分別處死1只犬于聲帶取材,對照組不做特殊處理。所有實驗操作均符合武漢市第三醫(yī)院動物倫理委員會要求。

    1.2主要器材及試劑 Lumenis型貝多芬智能CO2激光(美國科醫(yī)人),IX51型倒置顯微鏡和CX-21型普通光學(xué)顯微鏡(日本OLYMPUS),顯微喉鉗、支撐喉鏡、高清喉內(nèi)窺鏡及視頻記錄系統(tǒng)、冷光源、0°內(nèi)窺鏡鏡頭(德國karl Storz),anti-LOX抗體,anti-MMP-1抗體和anti-HIF-1α抗體(北京Bioss)。

    1.3CO2激光犬聲帶全切除術(shù) 實驗組動物術(shù)前禁食12 h,稱重,左后肢肌肉注射麻醉(速眠新0.1 mg/kg+戊巴比妥鈉0.8 mg/kg),在支撐喉鏡下暴露雙側(cè)聲帶,應(yīng)用CO2激光6焦耳/秒行雙側(cè)聲帶全切除深達肌層,清除創(chuàng)面碳化組織,充分止血。術(shù)后軟食,1 w后改正常飲食。對照組在支撐喉鏡下觀察聲帶形態(tài)后不作任何處理,清醒后正常進食。

    1.4犬聲帶形態(tài)學(xué)觀察 對照組和實驗組犬分別于術(shù)前及術(shù)后6 h、3 w、8 w和12 w肌肉注射麻醉(方法同上)后,于支撐喉鏡下觀察聲帶創(chuàng)面愈合情況,并于各時間點取一只犬實施安樂死,雙側(cè)聲帶多點取材進行HE染色和免疫熒光染色檢查。

    1.5HE染色 聲帶標(biāo)本用4%甲醛固定,石蠟包埋切片,片厚4 μm,HE染色。光學(xué)顯微鏡下觀察聲帶各層炎癥反應(yīng)、纖維結(jié)構(gòu)變化以及瘢痕形成情況。

    1.6免疫熒光染色 聲帶標(biāo)本石蠟切片,烘片脫蠟。PBS沖洗3次。EDTA緩沖液微波修復(fù)。PBS洗3次各5 min,甩干,5% BSA封閉20 min。去除BSA液,每張切片加50 μl一抗,覆蓋組織,4 ℃過夜。PBS洗三次,各5 min,加二抗,37 ℃孵育50 min;PBS 洗三次,各5 min;防淬滅劑封片。每個標(biāo)本隨機取1張切片,每張片任選2~3個視野,視野面積為0.51 mm×0.40 mm。熒光顯微鏡下觀察聲帶LOX、MMP-1和HIF-1α蛋白表達部位和量,以及聲帶瘢痕的形成情況。高倍鏡(×400)下取3個不重疊視野,矯正光密度后對各組圖像選色,采用Image-Pro Plus 6.0軟件分析系統(tǒng)測量圖像共定位區(qū)域累積光密度值(integrated optical density index, IOD值),反映共定位區(qū)域面積和熒光強度。

    1.7統(tǒng)計學(xué)方法 以IBM SPSS Statistics 22.0行統(tǒng)計學(xué)分析,圖像采集的IOD值用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。各組數(shù)據(jù)呈正態(tài)分布并經(jīng)方差齊性檢驗后,多組間比較用One-Way ANOVA中的LSD或Dunnett檢驗,采用Pearson進行相關(guān)分析,檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

    2 結(jié)果

    2.1對照組及實驗組犬聲帶形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果 支撐喉鏡下犬正常聲帶表面呈白色,可見血管紋,粘膜光滑,聲門閉合及發(fā)音功能良好(圖1a);CO2激光切除犬雙側(cè)聲帶至肌層(圖1b,術(shù)后6 h);術(shù)后3 w聲帶創(chuàng)面見較明顯的充血水腫及炎性分泌物(圖1c);術(shù)后8 w雙側(cè)聲帶充血水腫試驗,聲帶局部凹陷(圖1d);術(shù)后12 w雙側(cè)聲帶充血水腫消失,表面光滑,無粘連和肉芽,聲帶局部攣縮,雙側(cè)聲帶閉合不全,聲嘶明顯(圖1e)。

    2.2犬聲帶組織HE染色結(jié)果 術(shù)前聲帶分層清晰,由被覆復(fù)層鱗狀上皮層、結(jié)締組織層、肌層構(gòu)成(圖2a);術(shù)后6 h,聲帶創(chuàng)面大量紅細胞和炎性細胞浸潤,細胞充血水腫明顯(圖2b);術(shù)后3 w,聲帶創(chuàng)面上皮下固有層仍有炎癥細胞浸潤,新生微血管形成,成纖維細胞增生,無序排列,間質(zhì)水腫(圖2c);術(shù)后8 w,聲帶創(chuàng)面炎性細胞浸潤減少,無明顯紅細胞滲出,血管增粗,各層纖維組織增生,呈束狀或團狀紊亂排列(圖2d);術(shù)后12 w,聲帶上皮層大部分缺失,復(fù)層鱗狀上皮細胞層數(shù)增多;固有層血管或腺體減少或消失,腺體內(nèi)有黏蛋白積聚;固有層膠原纖維增厚、增多,纖維組織團狀或束狀紊亂排列,較多不規(guī)則纖維裂隙;肌層可見散在紊亂的膠原纖維束(圖2e)。

    2.3免疫熒光染色結(jié)果

    2.3.1ECM相關(guān)因子陽性細胞表達 由圖3可見,LOX、MMP-1和HIF-1α均定位于細胞核和細胞漿,術(shù)前(對照組)和術(shù)后(實驗組)聲帶均呈程度不一的陽性反應(yīng)。術(shù)前陽性細胞主要位于固有層全層,淺層含量略多。術(shù)后6 h和3 w,雙側(cè)聲帶創(chuàng)面上皮細胞和纖維層的炎性細胞、血管內(nèi)皮細胞和腺體內(nèi)陽性細胞表達較強烈;術(shù)后8 w和12 w,雙側(cè)聲帶創(chuàng)面陽性細胞逐漸減少,恢復(fù)至術(shù)前水平。

    2.3.2IOD值分析 術(shù)前及術(shù)后6 h、3 w、8 w和12 w各因子IOD值見表1,可見各時間點LOX、MMP-1比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);除術(shù)后12 w與術(shù)前比較外,其余各時間點HIF-1α比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

    表1 各相關(guān)因子在犬聲帶損傷不同時間段免疫熒光IOD值比較

    3 討論

    徐文等[12]報道聲帶損傷后3個月聲帶瘢痕基本形成。本研究實驗組犬CO2激光聲帶全切除后支撐喉鏡下顯示,CO2激光手術(shù)創(chuàng)面位于雙側(cè)聲帶,深達肌層,術(shù)后3 w,聲帶創(chuàng)面仍有充血水腫,術(shù)后8 w聲帶創(chuàng)面充血水腫減輕,表面凹陷,術(shù)后12 w聲帶創(chuàng)面不規(guī)則瘢痕基本形成。組織學(xué)觀察顯示聲帶損傷早期(術(shù)后3 w),創(chuàng)面較多炎性滲出,間質(zhì)充血水腫,新生血管形成;損傷中期(術(shù)后8 w),創(chuàng)面炎癥反應(yīng)明顯減少,纖維組織增生明顯;損傷后期(術(shù)后12 w),創(chuàng)面纖維組織大量增生,呈團狀或束狀排列紊亂,較多不規(guī)則間隙,排列結(jié)構(gòu)紊亂,提示聲帶瘢痕形成。

    LOX促進ECM膠原和彈性蛋白的翻譯后修飾過程,同時維持ECM內(nèi)環(huán)境免受金屬蛋白酶的降解,在ECM的生長、重塑、穩(wěn)定和傷口愈合中發(fā)揮重要作用[5,6];LOX過表達時,引起ECM的過度交聯(lián),引發(fā)不可逆的漸進性的組織纖維化。MMPs是膠原和彈性纖維降解的主要蛋白酶,參與ECM的降解、促進新生血管的形成、調(diào)節(jié)細胞間粘附等;MMP-1由成纖維細胞、巨噬細胞、內(nèi)皮細胞等多種細胞分泌,主要降解Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅵ、Ⅹ型膠原并促進新生血管形成[7,10]。本研究結(jié)果顯示,LOX、MMP-1和HIF-1α定位于細胞漿和細胞核,大多在炎性細胞,血管內(nèi)皮細胞和腺體內(nèi)表達較強烈。聲帶損傷早期(術(shù)后6 h)LOX表達稍有下降,此后其合成不斷增加,損傷中后期(術(shù)后3~12 w)時仍維持較高水平;MMP-1在聲帶損傷早期(術(shù)后6 h)表達較術(shù)前下降,聲帶損傷中期(術(shù)后3 w)升高達最高值,至聲帶損傷后期(術(shù)后12 w)達較低水平,這與部分學(xué)者報道前交叉韌帶損傷后成纖維細胞中LOX基因表達上升、MMP-1主要基因表達下降的結(jié)果一致[11,13]。即MMP-1主要在聲帶瘢痕形成早期發(fā)揮作用,而LOX主要在聲帶瘢痕形成中后期發(fā)揮作用,但MMP-1在聲帶瘢痕形成全程中的表達量明顯少于LOX,不足以對抗LOX的纖維化作用。低氧環(huán)境是瘢痕形成的重要因素,聲帶創(chuàng)傷早期,組織缺氧會影響成纖維細胞的活性,膠原的合成與降解、生長因子的分泌。HIF-1α是缺氧的特異感受因子,通過協(xié)助蛋白合成、血管再生促進創(chuàng)面愈合。文中結(jié)果顯示,聲帶損傷早期(術(shù)后6 h),HIF-1α迅速增加至峰值,中后期(術(shù)后3~12 w)逐漸恢復(fù)至正常水平;HIF-1α在術(shù)后12 w和術(shù)前相比未見明顯統(tǒng)計學(xué)差異,說明HIF-1α主要在聲帶損傷早中期(8 w內(nèi))發(fā)揮作用。需要指出的是,由于IOD值僅間接反映陽性目標(biāo)總的表達強度,加之本研究觀察標(biāo)本數(shù)量較少,損傷的程度和個體愈合的機制可能有所不同[14],這些因素均可能導(dǎo)致上述結(jié)果存在一定的誤差。

    較多學(xué)者認為聲帶術(shù)后15 d內(nèi)處于極度活躍增生狀態(tài),3個月后瘢痕組織趨于穩(wěn)定[1,15]。文中結(jié)果顯示術(shù)后6 h、3 w和8 w LOX、MMP-1和HIF-1α表達差異有統(tǒng)計學(xué)意義,即LOX、MMP-1和HIF-1α在術(shù)后早中期(<8 w)表達較活躍,至術(shù)后12 w時隨著創(chuàng)面基本愈合其表達也趨于穩(wěn)定。LOX、MMP-1在術(shù)前和術(shù)后不同時間段表達有統(tǒng)計學(xué)差異,尤其是術(shù)后12 w時仍未回復(fù)至術(shù)前水平,說明術(shù)后12 w時LOX、MMP-1仍處于較高表達狀態(tài),聲帶瘢痕仍未完全穩(wěn)定,也間接證實了部分學(xué)者報道的聲帶損傷后6~12個月時聲帶瘢痕中纖維蛋白表達量較術(shù)前仍有增加[12,16]。

    綜上所述,正常聲帶ECM中LOX、MMP-1和HIF-1α的表達很低,在創(chuàng)傷時,聲帶組織發(fā)生應(yīng)激反應(yīng),由成纖維細胞、巨噬細胞、內(nèi)皮細胞合成的MMP-1增加,促進ECM中各種膠原降解、細胞黏附[5,7],HIF-1α等物質(zhì)合成增加也會直接或間接參與微血管形成[8]。但由于MMP-1和HIF-1α在聲帶損傷早中期表達量較少,發(fā)揮的作用有限,對聲帶瘢痕的預(yù)防和治療效果尚不明顯。在聲帶損傷中后期,LOX過度表達,參與ECM纖維蛋白的翻譯后修飾過程,導(dǎo)致大量的膠原纖維過度分泌和無序沉積,以及彈性纖維減少,促進了聲帶瘢痕形成[9,14,17]。故探討靶向促進MMP-1和HIF-1α的表達,同時靶向抑制LOX的合成,可能為聲帶瘢痕的防治提供新的研究思路[9~11]。

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