Ca2+信號通路對大鼠舌黏膜鱗癌形成影響的實驗研究

雷 靂，凌永昌，聶智亮

（贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院口腔科，江西 贛州341000）

舌癌是臨床上常見惡性腫瘤之一，以鱗癌為最常見類型。由于口腔頜面部解剖結(jié)構(gòu)復(fù)雜，且毗鄰顱腦、食道、氣管等重要組織，該處發(fā)生惡性腫瘤容易侵犯顱腦、阻塞氣管食道，后果嚴重［1-2］。深入研究舌黏膜鱗癌形成發(fā)生機制，是更好防治舌黏膜鱗癌的必要基礎(chǔ)。近年發(fā)現(xiàn)Ca2+信號通路在多種腫瘤疾病中起著重要作用［3-5］，而目前國內(nèi)外關(guān)于Ca2+信號通路與舌黏膜鱗癌形成之間關(guān)系鮮有報道。本實驗旨在探討Ca2+信號通路對舌黏膜鱗癌形成的影響，了解其與舌黏膜鱗癌形成可能存在的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 動物造模及分組70只SPF級SD雄性大鼠，購于贛南醫(yī)學(xué)院實驗動物中心［許可證號：SCXK（贛）2014-0001］，體重（250±20）g，飼養(yǎng)于動物實驗中心，室溫18℃～25℃，濕度30%～50%，24 h自然光暗循環(huán)、通風(fēng)良好，自由進食、飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)2周后。參照文獻方法造模［6］，用蒸餾水將4-硝基喹-1-氧化物（4-nitroquinoline-1-oxid，4NQO）（Sigma，美國）溶液配置成0.1%的4NQO致癌劑儲存液，4℃避光保存?zhèn)溆谩Ｊ褂脮r以蒸餾水加入0.1%的4NQO致癌劑儲存液配制成0.002%4NQO溶液試驗用致癌口服溶液。64只SD大鼠分為對照組（A組隨機抽取8只大鼠）和模型組（分別分為B組4周；C組8周；D組12周；E組16周；F組20周；G組24周；H組28周；每組隨機分配8只大鼠）。A組（空白對照組）大鼠正常喂養(yǎng)，不進行特殊干預(yù)。各模型組大鼠，均將0.002%4NQO溶液試驗用致癌口服溶液置避光瓶內(nèi)作為飲用水自然喂養(yǎng)實驗組大鼠。以隨機數(shù)字法抽取8只SD大鼠納入空白對照組，不做任何處理。其余為實驗組，分別在第4周、8周、12周、16周、20周、24周、28周時在總實驗組中隨機抽取8只SD大鼠分別記錄為：B組（4周）、C組（8周）、D組（12周）、E組（16周）、F組（20周）、G組（24周）、H組（28周）進行試驗。

1.2 取材試驗大鼠以3%戊巴比妥鈉麻醉，滿意后頸椎脫臼處死，肉眼觀察以及切取舌標本，每個標本的1/2用4%中性福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋，4μm連續(xù)切片，常規(guī)HE染色，所有診斷均采用雙盲法，病理學(xué)診斷參照WHO 2005年標準［7］。另一半標本迅速放入凍存管置于液氮中，置入液氮罐保存。

1.2.1 基因表達譜芯片檢測TRIzol一步法提取液氮罐保存的各組SD大鼠舌組織標本總RNA，分別進行純化、質(zhì)檢。以各組標本編號并分別提取總RNA，并以其為模板合成雙鏈cDNA；體外轉(zhuǎn)錄生成生物素標記的cRNA，再次進行純化和片段化處理。取10μg cRNA與Affymetrix Genechip Rat Genome 230 2.0 Array進行雜交、洗脫、染色掃描檢測信號。

1.2.2 芯片圖像的采集與數(shù)據(jù)分析Affymetrix掃描儀掃描并采用5.0版芯片分析軟件進行分析。差異表達基因判斷標準：上調(diào)基因：change為I，Ratio≥1，實驗組Detection為P；下調(diào)基因：change為D，Ratio≤－1，對照組Detection為P。

1.2.3 pathway查詢分析對H/A組（24周組VS對照組）差異表達基因進行分析，在www.genome.jp/kegg/通過kegg pathway database查詢H/A組差異表達基因參與的信號通路情況。

2 結(jié)果

2.1 實驗動物情況與A組（空白對照組大鼠）相比，實驗組大鼠活躍程度、攝食量、飲水量和體重隨著實驗時間延長呈遞減趨勢。在16周時部分大鼠毛色干枯無光澤，精神萎靡，反應(yīng)遲鈍。實驗24～28周內(nèi)4只SD大鼠死于腫瘤惡病質(zhì)，實際可評價大鼠總共有66只。

2.2 大體標本觀察A組（空白對照組大鼠）：舌體柔軟，富有彈性，舌背黏膜呈粉紅色，乳頭分布均勻，HE染色顯示為正常黏膜（圖1）。H組大鼠：舌背人字溝附近可觀察到菜花狀黏膜新生物，局部糜爛，侵及黏膜深層，經(jīng)病理證實為高分化鱗癌（圖2）。

圖1正常黏膜（HE 200×）

圖2高分化鱗（HE 200×）

2.3 大鼠舌組織總RNA提取及電泳圖各組SD大鼠舌組織中提取的總RNA OD260/OD280介于1.8～2.0之間，瓊脂糖凝膠電泳顯示28S RNA和18S RNA條帶整齊，28S/18S吸光值之比約為2，表明各組大鼠舌組織提取制備的總RNA樣品完整性好、質(zhì)量高、無降解（圖3）。

圖3總RNA電泳圖

2.4 大鼠舌組織差異基因表達

2.4.1 概況二組對比，表達上調(diào)基因2 577個，下調(diào)基因1 613個，差異表達基因一共有4 190個。見表1。

表1差異表達基因統(tǒng)計概況/個

2.4.2 pathway查詢結(jié)果在舌黏膜鱗癌形成過程中，涉及Ca2+、MAPK、Wnt和凋亡等信號通路。圖中是H/A對比的差異表達基因映射入Ca2+信號通路的結(jié)果，紅色表示基因表達上調(diào)，藍色表示基因表達下調(diào)（圖4）。

圖4 Ca2+信號通路圖

3 討論

舌癌是臨床常見惡性腫瘤，以鱗狀細胞癌為其主要病理類型。舌癌治療效果差，復(fù)發(fā)率高、預(yù)后差，5年生存率不足50%［8］。近年來，由于吸煙、嚼食檳榔等多種原因舌癌人群總體發(fā)病率呈逐年上升趨勢，且年輕化趨勢明顯，預(yù)防及治療現(xiàn)狀不容樂觀。因此，很有必要深入探討舌癌的發(fā)病機制，這是提高舌癌臨床療效的基礎(chǔ)和關(guān)鍵所在。研究表明：舌癌的形成原因復(fù)雜，是一個涉及多基因的疾?。?-11］。這些基因相互作用，關(guān)系密切，形成龐大而復(fù)雜的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，影響著舌癌的形成。

近年來，針對Ca2+通道的分子生物學(xué)的研究方興未艾，研究表明［12］：Ca2+作為細胞內(nèi)重要的第二信使，密切參與細胞的生理病理過程，能激活介導(dǎo)各條信號通路，參與了分子重構(gòu)，從而使細胞結(jié)構(gòu)、功能、電活動發(fā)生一系列的變化，介導(dǎo)了腫瘤細胞的凋亡、增殖、耐藥和自噬等多個過程。也有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)［13］：使用鈣通道阻滯劑減少腫瘤細胞的鈣離子內(nèi)流，能明顯增強腫瘤細胞對抗腫瘤藥的敏感性。尤其值得注意的是，最近研究發(fā)現(xiàn)［14-15］，Ca2+能夠激活PI3K/AKT信號通路，而PI3K/AKT信號通路能夠介導(dǎo)腫瘤細胞逃避細胞凋亡，能使臨床療效降低。上述研究提示Ca2+在腫瘤的發(fā)生發(fā)展變化過程中起著重要作用，也為本研究提供了參考依據(jù)。

本研究收集不同時間段的舌癌和癌旁組織進行RNA提取、RNA測序（RNA-Seq），并分析差異表達的基因。根據(jù)分析要求對測序讀段進行定量和鑒定。分析了舌癌組織和癌旁癌組織的轉(zhuǎn)錄組，通過對基因樹和通路網(wǎng)絡(luò)的綜合分析顯示，大多數(shù)細胞周期基因被上調(diào)，而與細胞內(nèi)應(yīng)答，細胞粘附和細胞分化相關(guān)的大多數(shù)基因被下調(diào)。研究顯示，差異表達之基因呈上調(diào)趨勢的有GPCR、ROC、CD38、ADCY、SERCA、RYR、PKC；下調(diào)的有NCX、PLCβ、PLN、IP3R、CAMK。上述基因通過構(gòu)成復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)傳遞信息，相互協(xié)調(diào)、相互調(diào)控。NCX、GPCR、ROC、CD38等均為Wnt信號通路的上游基因，在機體受到外界的刺激后，呈現(xiàn)上調(diào)激活狀態(tài)，調(diào)控影響著下游基因，如PLCβ、PLN、IP3R、ADCY、SERCA、RYR等，而這些基因?qū)⒉煌盘杺鲗?dǎo)通路介導(dǎo)的信號加以整合，起著多種信號的交匯點或共同通路的作用。末端效應(yīng)基因如PKC、CAMK、NCX等基因表達異常，最終將導(dǎo)致機體細胞增殖、分化、凋亡等功能發(fā)生異常。有研究提示舌癌本體與細胞外基質(zhì)（ECM）組織，細胞黏附和膠原分解代謝過程相關(guān)的基因表達增加［16-17］。且差異表達的基因主要集中在粘著斑粘附途徑，ECM受體相互作用途徑，磷酸肌醇3激酶（PI3K）-Akt途徑和細胞粘附分子中［18］。GPCR控制的相關(guān)基因與其下游Wnt信號通路彼此密切相關(guān)，并在差異信號途徑中處于腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵位置。故本研究推測，Ca2+信號通路調(diào)控異常與舌癌的形成關(guān)系密切，機體有可能通過對Ca2+信號通路的調(diào)控作用進而影響舌癌形成。

綜上所述，本實驗提示Ca2+信號通路有可能通過上述途徑調(diào)控影響著舌癌的演變，如能調(diào)控其中的轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，就有可能預(yù)先中止舌癌的形成或者減輕舌癌的嚴重程度。但本研究仍需對相關(guān)基因進一步深入研究，如RNAi、基因敲除等，明確相關(guān)基因功能，以期為臨床上舌癌的有效防治提供新的方向。