樟幫法泡吳茱萸炮制工藝研究

溫慧玲，廖梅香，陳嬌婷，張道英，黃 浩

（贛南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，江西 贛州341000）

吳茱萸為蕓香科植物吳茱萸Euodia rutaecarpa（Juss.）Benth、石虎Euodia rutaecarpa（Juss.）Benth.Var.officininalis（Dodo）huang和疏毛吳茱萸Euodia Rutaecarpa（Juss.）Benth.Var.bodinieri（Dode）Huang的干燥近成熟果實［1］。吳茱萸是常用的溫里中藥，常用于治療厥陰頭痛、寒病腹痛、經(jīng)行腹痛、朊腹脹痛等癥。歷代中醫(yī)藥文獻均記載本品因其性溫燥有毒［2］，傳統(tǒng)中醫(yī)藥理論認(rèn)為吳茱萸通過合理的炮制能起到減毒增效的作用，故多以炮制品入藥。

樟幫傳統(tǒng)中藥炮制始于東漢時期，藥祖葛玄在樟樹閣皂山洗藥煉丹，守藥行醫(yī)，開創(chuàng)了樟幫藥業(yè)的先河，后經(jīng)南宋著名藥師侯逢丙來樟樹設(shè)藥加工，開店經(jīng)營，奠定了樟幫藥業(yè)的基礎(chǔ)，至明代逐漸形成了完整的樟幫藥業(yè)發(fā)展體系，該過程前后歷時1 800多年［3］。樟樹中藥炮制，不論炒、浸、泡、炙或烘、曬、切、藏均十分考究，獨樹一幟，成為南北藥材集散和炮制中心。樟樹藥幫的先賢通過千百年的努力，贏得了“藥不到樟樹不齊，藥不過樟樹不靈”的美譽，成為海內(nèi)外藥界同仁認(rèn)可的中國藥都，形成了獨具特色的樟幫法炮制飲片工藝［4］。樟幫法中藥炮制雖炒、浸、泡、炙或烘、曬、切、藏十分考究，但千百年來這些做法只是作為一種經(jīng)驗傳承下來，大部分只是停留于口頭，尚未形成科學(xué)可循的“炮制規(guī)范”。

吳茱萸藥材是江西省傳統(tǒng)的道地藥材之一。樟幫法炮制吳茱萸有別于中國藥典法，該炮制過程是以其獨特的泡制為其特色。吳茱萸的泡制方法始見于漢代著名醫(yī)家張仲景所著的幾部書中。如《金匱玉函經(jīng)》和《注解傷寒論》中都提到“洗”法，這是一個比較籠統(tǒng)和模糊的概念［5］。不過，在其同一時期成書的由后人輯錄的《新輯宋本傷寒論》中明注：“洗，湯洗七遍”為較具體方法。湯，古人稱熱水為湯。這也是張氏首次提出用熱水來炮制吳茱萸的方法。以后的晉、齊、梁等代都是承襲此法而無甚發(fā)展?？梢娬翈团輩擒镙欠v史悠久。如2008版《江西省中藥炮制規(guī)范》記載的泡吳茱萸炮制工藝為取吳茱萸，用開水泡約1 h至頂端開口，再置于鍋中炒熱，灑入鹽水至發(fā)香氣，焙干。每100 kg吳茱萸，用食鹽3 kg［6］。炮制工藝中雖然有些參數(shù)規(guī)定，但是不完全。為了使炮制更加具有可操作性，現(xiàn)對樟幫法炮制工藝進行優(yōu)化研究。以期為建立樟幫泡吳茱萸的最佳炮制工藝，為后續(xù)的炮制機理研究提供穩(wěn)定的樣品。

1 儀器與材料

戴安3000高效液相色譜儀（UV檢測器），UNICO-2000紫外可見分光光度（尤尼康檢測儀器有限公司），Sartorius BS214-D（萬分之一），Mettler AE240天平（十萬分之一），KQ3200超聲波清洗器（昆山超聲儀器廠），F(xiàn)W100高速萬能粉碎機（天津市泰斯特儀器有限公司），CFP-110X50型報喜龍電炒鍋（報喜龍電器廠），TN408LC型紅外測溫槍（上海儀迷杰光電技術(shù)有限公司），TDGC-2型接觸式調(diào)壓器（環(huán)宇集團公司），GZX-9146MBE型數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱（上海博訊實業(yè)有限公司），HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋（國華電器有限公司），自動雙重蒸餾水器（上海亞榮生化儀器有限公司）；吳茱萸堿，吳茱萸次堿和吳茱萸內(nèi)酯對照品（中國藥品生物制品檢定所提供110802-200504，110801-200505，110800-20040）；乙腈（色譜純，TEDIA），甲醇（色譜純，TEDIA），雙蒸餾水（自制），甲醇（分析純，上海振興化工廠一廠），其他試劑均為分析純。吳茱萸藥材購于江西省樟樹慶仁飲片公司，經(jīng)藥學(xué)院李加林副教授鑒定為吳茱萸Euodia rutaecarpa（Juss.）Benth。

2 方法與結(jié)果

2.1 吳茱萸堿、吳茱萸次堿和吳茱萸內(nèi)酯的含量測定

2.1.1 色譜條件色譜柱為Diamonsil ODS（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相為乙腈∶水=50∶50；檢測波長，225 nm；柱溫：室溫；流速：1 mL·min-1；進樣量為：20μL（見圖1）。

2.1.2 對照品溶液的配制取吳茱萸堿、吳茱萸次堿和吳茱萸內(nèi)酯對照品適量，精密稱定，分別加入甲醇制成質(zhì)量濃度分別為0.490、0.580、0.760 mg·mL-1的對照品儲備液。

2.1.3 供試品溶液的制備通過對提取溶劑、提取方式、提取時間提取容量的單因素考察，綜上確定了供試品的制備方法為：精密稱取吳茱萸炮制品粉末（粉碎，過40目篩）約0.2 g，置于錐形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，稱重，超聲提取60 min，放冷，加甲醇補重，搖勻，過濾，0.45μm的微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.1.4 線性關(guān)系考察精密吸取各對照品溶液適量，分別配制成不同濃度的對照品溶液，以色譜峰面積對進樣量進行回歸分析，得到回歸方法：Y吳茱萸堿=4.465 3X+0.983 8，r=0.999 7，Y吳茱萸次堿=1.916 7X－0.471 2，r=0.999 6，Y吳茱萸內(nèi)酯=0.061 8X+0.020 9，r=0.999 7。結(jié)果表明，吳茱萸堿、吳茱萸次堿和吳茱萸內(nèi)酯分別在2.45～34.08μg·mL-1、1.45～58μg·mL-1、22～760μg·mL-1范圍內(nèi)，與峰面積的值呈良好線性關(guān)系（見表1）。

2.1.5 精密度試驗分別精密的吸取吳茱萸內(nèi)酯，吳茱萸堿和吳茱萸次堿對照品溶液，重復(fù)進樣6次，測得吳茱萸內(nèi)酯的峰面積分別為1.363 8、1.371 2、1.410 8、1.401 7、1.375 2、1.380 7，RSD%為1.33%；吳茱萸堿的峰面積分別為40.910 0、42.249 0、42.244 4、41.162 2、41.115 7、41.209 5，RSD%為1.45%；吳茱萸堿的峰面積分別為8.396 7、8.652 4、8.678 4、8.496 4、8.569 7、8.808，RSD%為1.69%。結(jié)果表明精密度良好。

圖1吳茱萸供試品色譜圖

表1測定成分的線性關(guān)系和線性范圍

2.1.6 穩(wěn)定性試驗精密稱取同一批的吳茱萸（炮制品）樣品一份，按照“供試品溶液制備”項下方法制備樣品溶液，在0、2、4、6、12、24 h進樣，每次進樣20μL，結(jié)果吳茱萸內(nèi)酯含量分別為3.143%、3.062%、3.115%、3.143%、3.062%、3.115%，RSD%為1.20%；吳茱萸堿含量分別為0.445%、0.436%、0.446%、0.445%、0.436%、0.456%，RSD%為1.67%；吳茱萸次堿含量分別為0.147%、0.144%、0.144%、0.147%、0.144%、0.148%，RSD%為1.09%。結(jié)果表明，樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.7 重復(fù)性試驗精密稱取同一批的吳茱萸（炮制品）樣品6份，按照“供試品溶液制備”項下方法制備樣品溶液，準(zhǔn)確吸取20μL進樣分析，進行含量測定。計算得吳茱萸內(nèi)酯含量分別為2.543%、2.462%、2.542%、2.552%、2.554%、2.463%，RSD%為1.75%；吳茱萸堿含量分別為0.302%、0.303%、0.310%、0.301%、0.304%、0.302%，RSD%為1.05%；吳茱萸次堿含量分別為0.227%、0.230%、0.224%、0.228%、0.228%、0.230%，RSD%為0.98%。結(jié)果表明重復(fù)性良好。

2.1.8 加樣回收率試驗精密稱取樟幫炮制品粉末6份，每份約0.1 g，分別精密加入相當(dāng)于樣品中指標(biāo)成分量100%的3種成分對照品溶液即吳茱萸堿、吳茱萸次堿和吳茱萸內(nèi)酯，按“供試品溶液制備”方法處理并測定，計算回收率。結(jié)果顯示吳茱萸堿、吳茱萸次堿和吳茱萸內(nèi)酯的回收率均在95%～105%，RSD值均小于2%，符合加樣回收率要求（見表2）。

2.2 樟幫泡吳茱萸炮制工藝的優(yōu)選

2.2.1 凈選工藝取吳茱萸，揀凈果梗，篩去灰屑，備用。

2.2.2 正交表的設(shè)計通過樟幫法泡吳茱萸的預(yù)試驗，確定以吳茱萸內(nèi)酯、吳茱萸堿和吳茱萸次堿的含量為指標(biāo)，以開水泡制時間（注：指加入開水后放置涼處的時間），加鹽的量，炒制溫度及炒制時間為考察因素（因素水平表見表3），每個因素選取4個水平，按L16（45）正交表設(shè)計實驗（正交表設(shè)計見表4）。

2.2.3 樣品的炮制取大小均勻，色澤均一的吳茱萸16份，每份50 g，按照1∶4（1份藥材，4份水的量浸泡），按表4的工藝條件進行炮制，控制溫度和時間，出鍋后放涼，篩去灰屑，即得。

2.2.4 指標(biāo)測定選用正交表L16（45）安排試驗，以吳茱萸內(nèi)酯、吳茱萸堿和吳茱萸次堿的含量為指標(biāo)，引用綜合指標(biāo)“隸屬度”［7］，將各個指標(biāo)統(tǒng)一綜合考察。因試驗測定的三種成分指標(biāo)越大越好，故指標(biāo)隸屬度=（指標(biāo)值－指標(biāo)最小值）／（指標(biāo)最大值－指標(biāo)最小值），因為各指標(biāo)的重要性一樣，故綜合分?jǐn)?shù)（Y）就直接將各指標(biāo)隸屬度相加（Y=吳茱萸內(nèi)酯的隸屬度+吳茱萸堿的隸屬度+吳茱萸次堿的隸屬度）。以綜合指標(biāo)來優(yōu)選最佳炮制工藝參數(shù)。采用同樟幫泡吳茱萸（甘草水泡制）炮制品相同數(shù)據(jù)處理方法優(yōu)選最佳炮制工藝參數(shù)。炮制品按照“吳茱萸內(nèi)酯、吳茱萸堿和吳茱萸次堿含量測定方法的建立”項下的“供試品溶液的制備”方法制備樣品。精密吸取樣品20μL進樣進行含量測定。結(jié)果見表4。

表2吳茱萸堿、吳茱萸次堿、吳茱萸內(nèi)酯加樣回收率實驗結(jié)果

表3樟幫法泡吳茱萸（開水泡制）的因素水平表

表4 L16（45）樟幫法泡吳茱萸（開水泡制）的正交實驗及結(jié)果表

由表4得到A（開水泡的時間）對于吳茱萸內(nèi)酯、吳茱萸堿和吳茱萸次堿均有顯著性的影響，B（鹽水的量）對于3個指標(biāo)無顯著性的影響，C（炒的時間）對吳茱萸內(nèi)酯有顯著性的影響，D（炒的溫度）對于吳茱萸堿有顯著性的影響。由直觀分析得到最佳泡制工藝為：A2B4C4D3，考慮到鹽的用量對于指標(biāo)沒有顯著性的影響，還有成本考慮，故鹽水的用量定為水平一，即最佳泡吳茱萸工藝為：A2B1C4D3，即取凈吳茱萸一定量，用開水泡1 h（按照1份藥材，4份水的量浸泡），然后取出放入250℃的炒鍋中加鹽一定量，炒18 min，炒干后撈出，放冷，篩去灰屑。每100 kg吳茱萸，加鹽3 kg。

2.2.5 工藝驗證實驗取大小均勻，色澤均一的吳茱萸3份，每份500 g，按照2.2.4的優(yōu)選工藝制備3批樣品，分別測定各指標(biāo)成分的含量，求出綜合評價值Y′，結(jié)果見表5。

結(jié)果表明，驗證實驗樣品綜合評價值Y′與優(yōu)選結(jié)果Y相近，說明優(yōu)選工藝條件穩(wěn)定可行。

表5三批樣品驗證實驗各指標(biāo)含量測定結(jié)果

3 討論

泡吳茱萸為江西樟幫特色炮制飲片，尚未見其炮制工藝的報道。雖然對于吳茱萸其他炮制品的炮制工藝的研究報道較多［8-12］，但是對于樟幫法泡制吳茱萸的炮制工藝研究卻報道很少。2015年版《中國藥典》收載吳茱萸炮制品有吳茱萸和制吳茱萸。全國部分省市中藥飲片炮制規(guī)范均收錄了吳茱萸和制吳茱萸，其中僅廣東、福建和江西三個省份的中藥飲片炮制規(guī)范收載了泡吳茱萸的炮制方法［13］。有文獻研究表明吳茱萸經(jīng)過不同方法炮制后其酚酸類及黃酮類成分均有所減少。而生物堿類成分因炮制方法的不同有所差異。比如，甘草制吳茱萸中生物堿的含量大于生品中的含量。但是熱水浸泡吳茱萸中生物堿的含量低于生品中的含量［8］。其中甘草制吳茱萸中生物堿的含量大于生品中的含量，推測可能是因為甘草中甘草酸和甘草次酸等酸性成分能促進生物堿類成分的溶出［14］。而泡制對吳茱萸飲片中酚酸、黃酮和生物堿類成分均有降低的作用，可能提示泡制品獨特炮制的原因。該炮制工藝穩(wěn)定、可靠、可操作性強，為后續(xù)的樟幫泡吳茱萸炮制機理研究提供穩(wěn)定可靠的樣品。