人體腸道耐藥基因組的研究進(jìn)展

段宇婧，吳新顏，陳則友，陳穎,4，李林云，祝思源，毛大慶，羅義,2,*

1. 南開大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，環(huán)境污染過程與基準(zhǔn)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300350 2. 南京大學(xué)環(huán)境學(xué)院，污染控制與資源化國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210093 3. 南開大學(xué)醫(yī)學(xué)院，天津 300071 4. 遼寧大學(xué)環(huán)境學(xué)院，沈陽 110036

腸道微生物是人體最復(fù)雜的微生態(tài)系統(tǒng)，據(jù)估計(jì)人體腸道菌群數(shù)量是人體細(xì)胞總數(shù)的10倍之多[1-2]。作為20世紀(jì)最重要的醫(yī)學(xué)發(fā)現(xiàn)之一，抗生素在治療疾病、延長人類壽命方面發(fā)揮了重要作用，但是目前因抗生素濫用引發(fā)的耐藥性問題已十分嚴(yán)重。抗生素選擇性壓力能促進(jìn)耐藥細(xì)菌和耐藥基因(antibiotic resistance genes, ARGs)不斷被篩選和富集，耐藥基因還可以通過可移動(dòng)遺傳元件(mobile genetic elements, MGEs)在相同種屬或不同種屬的細(xì)菌之間進(jìn)行水平轉(zhuǎn)移，使更多的敏感菌成為耐藥菌[3-4]。人體服用的抗生素進(jìn)入腸道后形成的選擇性壓力可作用于腸道微生物并引起腸道菌群的改變。近年來，耐藥基因組(resistome)的概念應(yīng)運(yùn)而生，包括所有耐藥基因及其前體(隱匿性或原耐藥基因)，這反映出耐藥基因的復(fù)雜性[5-8]。腸道是耐藥基因的“儲(chǔ)存庫”，研究發(fā)現(xiàn)人體腸道中存在上千種耐藥基因，相較其他環(huán)境樣品，人類腸道耐藥基因組擁有較高的豐度和多樣性，并且與人體健康息息相關(guān)，具有非常重要的研究意義[9-10]。本文首先介紹了人體腸道耐藥基因組的研究方法，系統(tǒng)總結(jié)了腸道耐藥基因組的組成和來源以及傳播和進(jìn)化方面的最新進(jìn)展，在此基礎(chǔ)上對今后的研究重點(diǎn)提出了建議與展望，以期為腸道耐藥基因組的研究提供新思路，同時(shí)為臨床抗生素的合理使用提供理論依據(jù)。

1 人體腸道耐藥基因組的研究方法(The research methods of human gut resistome)

傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)技術(shù)對于獲得耐藥菌株并闡明其表型和基因型具有不可替代的作用，但目前近80%的腸道細(xì)菌仍不可體外培養(yǎng)，該技術(shù)無法全面研究腸道耐藥基因組(圖1)[11-13]。一些分子生物學(xué)手段包括傳統(tǒng)PCR技術(shù)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)(qPCR)、高通量熒光定量PCR技術(shù)、基因芯片技術(shù)(又稱DNA微陣列)和測序技術(shù)克服了分離培養(yǎng)技術(shù)存在的缺陷。其中，PCR技術(shù)和基因芯片技術(shù)可快速檢出樣品中耐藥基因并測得其豐度高低，但也存在一定的缺陷，這些技術(shù)不能提供耐藥基因的遺傳背景和宿主信息，同時(shí)常出現(xiàn)的假陽性結(jié)果也會(huì)影響人們對真實(shí)情況的認(rèn)知[13]?；驕y序技術(shù)可有效避免上述缺點(diǎn)，其中，二代測序技術(shù)(Next Generation Sequencing, NGS)憑借低成本和高通量，逐漸發(fā)展為目前的主流技術(shù)，但其存在序列讀長較短且拼接過程較為復(fù)雜等缺陷。三代測序無需模板擴(kuò)增，耗時(shí)較短并且讀長更長，但是因其高錯(cuò)配率、高成本和低通量的局限性而難以得到廣泛應(yīng)用，現(xiàn)今仍處于發(fā)展和完善階段。基因組測序、擴(kuò)增子測序、轉(zhuǎn)錄組測序和宏基因組測序等技術(shù)發(fā)展迅速，已得到廣泛應(yīng)用，并衍生出相應(yīng)的組學(xué)研究如基因組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)。宏基因組學(xué)(metagenomics)運(yùn)用基因組學(xué)的研究策略來分析全部微生物的遺傳信息，被廣泛應(yīng)用于探究環(huán)境或人體的微生物多樣性、種群結(jié)構(gòu)和功能基因等方面。可以通過比對數(shù)據(jù)庫來分析測序結(jié)果，考察耐藥基因的存在情況，目前可選用的相關(guān)數(shù)據(jù)庫主要有CARD數(shù)據(jù)庫(The Comprehensive Antibiotic Resistance Database)[14]、ARDB數(shù)據(jù)庫(Antibiotic Resistance Gene Database)[15]、MvirDB[16]、ARGO數(shù)據(jù)庫(Antibiotic Resistance Gene Online)[17]、Resfinder數(shù)據(jù)庫[18]、Resfams數(shù)據(jù)庫[19]和ARG-ANNOT數(shù)據(jù)庫等[13,20]。

近年來，一些新興的耐藥基因組研究技術(shù)和方法也不斷誕生，如基質(zhì)輔助激光解析電離-飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)(MALDI-TOF-MS)、微流控(microfluidic strategies)、拉曼光譜、單細(xì)胞測序和HiC-Meta技術(shù)等?；谪惾~斯算法建立的Source Tracker機(jī)器學(xué)習(xí)方法可以進(jìn)行耐藥基因溯源分析，如分析嬰兒的腸道菌群和耐藥基因是否來源于母體的腸道、陰道和皮膚菌群[21]。功能宏基因組(functional metagenomics)和培養(yǎng)組學(xué)(culturomics)的發(fā)展為深入探究腸道中耐藥基因的存在、傳播、機(jī)制、功能和健康風(fēng)險(xiǎn)提供了有效手段。功能宏基因組通過整合穩(wěn)定同位素標(biāo)記技術(shù)(DNA-SIP)或微流控技術(shù)來綜合探究耐藥基因的功能、活性和代謝產(chǎn)物，能夠用于發(fā)掘新型的耐藥基因[22-23]。但該技術(shù)也存在一定的缺陷，文庫構(gòu)建過程會(huì)發(fā)生基因丟失，宿主菌也不可能正確地表達(dá)全部插入的基因片段(圖1)[13]。隨著研究的不斷深入，對于未知腸道細(xì)菌的探究需求日益迫切，準(zhǔn)確獲取腸道耐藥菌株后，可繼續(xù)開展菌種鑒定、體外實(shí)驗(yàn)或者模式生物實(shí)驗(yàn)等，這對于耐藥基因的后續(xù)研究十分必要，而單純的測序技術(shù)無法滿足這一要求。目前，微生物培養(yǎng)技術(shù)整合基因測序技術(shù)經(jīng)過發(fā)展和改良逐步形成了培養(yǎng)組學(xué)，已經(jīng)將人體可培養(yǎng)細(xì)菌數(shù)目增加了上百種，為人類腸道細(xì)菌的培養(yǎng)和鑒定做出了巨大貢獻(xiàn)。培養(yǎng)組學(xué)通過多種培養(yǎng)條件來進(jìn)行大規(guī)模細(xì)菌培養(yǎng)，并結(jié)合MALDI-TOF-MS以及16S rRNA基因測序等技術(shù)來鑒定細(xì)菌物種[12]。MALDI-TOF-MS能夠快速進(jìn)行細(xì)菌物種鑒定，可以用于鑒定攜帶耐藥基因的細(xì)菌，并且該技術(shù)能夠進(jìn)行細(xì)菌耐藥表型的檢測，如檢測β-內(nèi)酰胺酶的產(chǎn)生[24]。

圖1 腸道耐藥基因研究的主要技術(shù)路線[13]Fig. 1 Major technical routes for the study of gut resistome[13]

2 人體腸道耐藥基因組的組成和來源(The composition and origin of human gut resistome)

2.1 人體腸道耐藥基因組的組成及影響因素

作為耐藥基因的“儲(chǔ)存庫”，腸道菌群的結(jié)構(gòu)與耐藥基因的組成密切相關(guān)[10]。人體腸道菌群和耐藥基因的組成是一個(gè)由少到多、由簡單到復(fù)雜、由不穩(wěn)定到穩(wěn)定的定植過程，二者都受年齡的影響[25-26]。Lu等[26]通過對124份4個(gè)不同年齡段的健康人群糞便樣本研究發(fā)現(xiàn),耐藥基因的多樣性和檢出數(shù)目隨著年齡升高而增加，依次為：學(xué)齡前兒童(3～5歲)<學(xué)齡期兒童(10～11歲)<高中青少年(15～17歲)<成年人(26～55歲)。成年人腸道耐藥基因組的種類較為豐富，有研究通過蛋白質(zhì)同源建模的方法預(yù)測人類腸道中存在6 095種耐藥基因[27]。Hu等[9]在來自3個(gè)國家的共162份成人糞便樣本中檢測到1 093種耐藥基因，分別屬于149種耐藥基因類型，并且同其他環(huán)境介質(zhì)如土壤、海洋和湖泊相比，成人腸道耐藥基因的豐度更高。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，四環(huán)素類、β-內(nèi)酰胺類、大環(huán)內(nèi)酯類、氨基糖苷類、萬古霉素類和桿菌肽類耐藥基因在全世界不同國家的人體腸道中均廣泛存在，耐藥基因tetW、tetM、tetO、tet32、ermF、aadE、acrB和vanS等在健康人群腸道中普遍檢出并且相對豐度較高[9,28-29]。四環(huán)素類耐藥基因是腸道細(xì)菌中最常見的類型，研究表明，腸道厭氧共生菌中普遍存在tetW，擬桿菌門中普遍能檢出tetQ[30]。

除年齡影響外，研究者發(fā)現(xiàn)腸道耐藥基因的組成還會(huì)受到藥物、國家或地區(qū)、飲食及生活方式、經(jīng)濟(jì)收入和環(huán)境等多種因素的影響[25,31-32]。很多藥物尤其是抗生素對腸道菌群以及耐藥基因有顯著影響。大量的研究證明，抗生素可降低腸道菌群的豐度和多樣性，增加耐藥基因豐度和數(shù)目，導(dǎo)致腸道菌群失調(diào)甚至難以完全恢復(fù)[11,33-36]。抗生素引起腸道菌群結(jié)構(gòu)的改變是引起耐藥基因組成發(fā)生變化的直接原因[29,34-35]。Palleja等[34]分析了12名健康成年男性在短期服用混合抗生素后的腸道菌群和耐藥基因的變化，發(fā)現(xiàn)腸道菌群多樣性變低，檢出攜帶β-內(nèi)酰胺類耐藥基因的細(xì)菌，并且在隨后的6個(gè)月恢復(fù)期內(nèi)仍有多種腸道細(xì)菌未能恢復(fù)。Raymond等[35]的研究證明，口服頭孢丙烯后，腸道β-內(nèi)酰胺類耐藥基因blacfx-6的突變增多，并且導(dǎo)致一些條件致病菌如陰溝腸桿菌的豐度增加。根據(jù)全球抗生素的消費(fèi)情況與細(xì)菌耐藥數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，人類腸道中，豐度最高的耐藥基因往往對應(yīng)著使用歷史更長久的抗生素，甚至一些獸用抗生素，這些獸用抗生素可能是通過食物鏈進(jìn)入人體來影響腸道耐藥基因組[37]。此外，非抗生素類藥物也會(huì)改變腸道菌群和耐藥基因，體外實(shí)驗(yàn)研究表明，許多藥物能夠像抗生素一樣抑制腸道細(xì)菌，并可能促進(jìn)細(xì)菌獲得抗生素抗性[38]。抗癲癇藥卡馬西平能促進(jìn)攜帶多重耐藥基因的質(zhì)粒在同屬和不同屬水平細(xì)菌間的水平轉(zhuǎn)移，抗菌劑三氯生可以通過誘導(dǎo)基因突變來使大腸桿菌獲得多重耐藥性[39-40]。

國家或地區(qū)的差異對人群的腸道耐藥基因也有影響，研究證實(shí)，不同國家的健康人群腸道耐藥基因組的組成和豐度存在區(qū)別。Feng等[28]分析發(fā)現(xiàn)，來自相同國家的人群腸道耐藥基因會(huì)傾向于相似，且不同國家人群擁有自己的代表性耐藥基因(representative/discriminative ARGs)。例如，ermF和tetQ是中國人群的代表性耐藥基因，萬古霉素類耐藥基因可同時(shí)作為奧地利、瑞典、日本和美國的代表性耐藥基因。目前，已有多個(gè)研究證實(shí)，同西班牙、丹麥、法國、德國、瑞典和美國等歐美國家相比，中國人群腸道擁有更高豐度的耐藥基因[9,28]。H?sler等[41]研究發(fā)現(xiàn)，2015年德國境內(nèi)來自敘利亞、阿富汗和伊拉克的難民人群腸道中耐藥基因與德國本地人群的腸道耐藥基因存在差異，耐藥基因vanC1、qnrB、blaOXA-1和blaCTX-M group 1在三國難民腸道中檢出較多，而在德國本地人群腸道中耐藥基因vanB普遍存在，qnrB和blaOXA-1則沒有檢出。

飲食及生活方式、經(jīng)濟(jì)收入和環(huán)境等因素也可能對腸道耐藥基因組的組成與多樣性有一定的影響[11]。非洲坦桑尼亞地區(qū)的哈扎人過著原始的生活，拒絕現(xiàn)代社會(huì)的生活方式，他們以狩獵采集為生，食譜包括猴面包樹果實(shí)、各種肉類、漿果和蜂蜜等，幾乎從未攝入過加工食品和抗生素。研究者發(fā)現(xiàn)，他們擁有更為豐富的腸道菌群，并且腸道中耐藥基因多樣性相較美國人要偏低，反映出飲食及生活方式對腸道耐藥基因的影響[42]。來自低收入國家和工業(yè)化程度較低國家的人群與西方工業(yè)化國家相比，腸道耐藥基因豐度傾向于更高，這說明，經(jīng)濟(jì)收入可能作為一種因素影響人體腸道耐藥基因組組成[43]。如今，環(huán)境污染對人體健康的影響備受關(guān)注，一些環(huán)境污染物如重金屬和抗生素等可通過食物鏈進(jìn)入人體腸道，影響腸道菌群和耐藥基因組的組成。此外，耐藥基因在水環(huán)境、土壤和大氣等介質(zhì)中普遍存在，形成一個(gè)天然的耐藥基因儲(chǔ)存庫，并且可能通過食物鏈進(jìn)入人體腸道進(jìn)一步影響腸道耐藥基因組[44-48]。

2.2 人體腸道耐藥基因組的來源

人體腸道微生物的來源與母體密切相關(guān)，從腸道、口腔、陰道和母乳來源的母體微生物可能通過母嬰傳播到達(dá)胎兒或新生兒的腸道并參與子代腸道菌群的早期定植，這些微生物也是子代腸道耐藥基因的來源[49-50]。研究表明，在正常妊娠過程中，胎盤屏障并不能阻止微生物在母-胎之間的垂直傳播[49]。長期以來人們認(rèn)為子宮是一個(gè)無菌環(huán)境，以保障胎兒的健康發(fā)育，因此，前期觀點(diǎn)認(rèn)為胎兒是在生產(chǎn)過程中以及出生后開始獲得腸道細(xì)菌的。近年來，隨著分子生物學(xué)的不斷發(fā)展以及測序技術(shù)的廣泛應(yīng)用，已開始有證據(jù)表明，孕婦子宮、羊水和胎盤中存在細(xì)菌，并且會(huì)直接影響胎兒腸道菌群的獲得與定植，然而這些細(xì)菌對孕婦及胎兒生理健康的影響仍有待探究[50-51]。胎兒在妊娠16周時(shí)就可以吞入羊水，經(jīng)過吸收后再通過尿液和胎便排出到宮腔中，胎便成分主要包括羊水、胎毛和掉落的細(xì)胞等。相關(guān)研究證實(shí)，胎便中存在細(xì)菌，并且有耐藥基因的檢出，如葡萄球菌、鏈球菌、腸球菌以及四環(huán)素類耐藥基因和β-內(nèi)酰胺類耐藥基因等[49,50,52]。目前，胎便菌群的具體來源還未能完全確定，已報(bào)道的來源主要有母體的腸道菌群、陰道菌群以及口腔菌群，這些菌群可能通過胎盤屏障進(jìn)入子宮和胎兒腸道中，其中，母體的腸道微生物可能是子代腸道菌群最重要的來源。研究表明，人類胎便中檢出的埃希氏菌屬和腸球菌屬就是腸道常駐菌群[50,53]。此外，一些免疫細(xì)胞如樹突狀細(xì)胞能夠攜帶微生物穿過腸道屏障進(jìn)入腸道淋巴系統(tǒng)并進(jìn)入血液當(dāng)中，使得母體一些腸道微生物可能傳播至胎盤和胎兒腸道中[54]。Jiménez等[50]將一株從人體獲得的屎腸球菌熒光標(biāo)記后讓孕鼠口服攝入，在剖宮產(chǎn)后的羊水和子代的胎便中能夠分離出該標(biāo)記菌，進(jìn)一步說明母體腸道中的細(xì)菌能夠通過胎盤屏障進(jìn)入子宮和胎兒腸道中。

新生兒的腸道菌群和耐藥基因除了前期從母體子宮內(nèi)獲得外，還受到分娩過程和母乳喂養(yǎng)的影響[32,55-56]。順產(chǎn)的新生兒在分娩過程中可以獲得母親的陰道菌群，如乳酸桿菌屬、雙歧桿菌屬和普氏桿菌屬等，剖宮產(chǎn)的新生兒腸道菌群與母體腸道菌群相似性較低，并且同順產(chǎn)嬰兒相比，剖宮產(chǎn)嬰兒的腸道菌群傾向于攜帶更大比例的耐藥基因，在醫(yī)院出生的新生兒還可能受到周圍環(huán)境中耐藥細(xì)菌的威脅[32,56]。在新生兒成長過程中，母乳喂養(yǎng)也會(huì)影響嬰兒的腸道菌群、耐藥基因組和可移動(dòng)遺傳元件。母乳中有檢出乳桿菌屬、葡萄球菌屬、腸球菌屬和鏈球菌屬，以及mecA和ermB等耐藥基因，并且可移動(dòng)遺傳元件的存在可能會(huì)促進(jìn)耐藥基因在母嬰之間的傳播擴(kuò)散[55,57]。

3 人體腸道耐藥基因組的傳播和進(jìn)化(The propagation and evolution of human gut resistome)

3.1 腸道耐藥基因組的傳播

人體腸道微生物及其攜帶的耐藥基因可以通過城市污水處理廠出水排放進(jìn)入環(huán)境，從而影響環(huán)境中的耐藥基因組[10,58-59]。傳統(tǒng)的糞便污染指示菌如大腸桿菌、擬桿菌屬和雙歧桿菌屬可以用來探究水環(huán)境的糞便污染。近期有文獻(xiàn)報(bào)道，噬菌體crAssphage也可以作為環(huán)境中人類糞便污染的示蹤標(biāo)記，借助該標(biāo)記的研究證明人類糞便的排放能夠影響環(huán)境中耐藥基因的組成[59]。此外，耐藥基因也可以通過動(dòng)物攜帶傳播、河流和風(fēng)力等自然作用傳播以及醫(yī)院和社區(qū)的人際傳播等途徑進(jìn)入人體[10]。一些在北極生活的候鳥遷徙路徑可橫跨六大洲，耐藥基因可能借助這些動(dòng)物進(jìn)行遠(yuǎn)距離傳播[4]。已有研究表明，在食品、飲用水和霧霾樣品中都檢出了耐藥基因，這些耐藥基因可能通過食物鏈和呼吸等暴露途徑進(jìn)入人體[44-48]。2016年，我國在零售肉類、養(yǎng)殖場及環(huán)境中發(fā)現(xiàn)分離的大腸桿菌質(zhì)粒上攜帶多粘菌素耐藥基因mcr-1，這是首次被發(fā)現(xiàn)的可以通過質(zhì)粒在不同菌屬之間傳播擴(kuò)散的多粘菌素耐藥基因[46]。目前，已證實(shí)該基因在全球35個(gè)不同國家和地區(qū)的人、動(dòng)物和環(huán)境源等的多種腸桿菌中廣泛傳播，引起世界范圍的廣泛關(guān)注。

在微觀分子水平上，耐藥基因的傳播方式可以分為垂直基因傳遞和水平基因轉(zhuǎn)移。垂直基因轉(zhuǎn)移是由親代將遺傳信息傳遞給下一代，水平基因轉(zhuǎn)移可以在同種屬和不同種屬之間交換遺傳物質(zhì)。細(xì)菌耐藥性可以分為固有耐藥/天然耐藥(intrinsic resistance)和獲得性耐藥(acquired resistance)。固有耐藥是由細(xì)菌染色體上位置保守的固有耐藥基因決定，賦予細(xì)菌對抗生素天然耐藥的特性，可以通過垂直基因傳遞將耐藥基因傳遞給子代[60-61]。獲得性耐藥是由于敏感菌發(fā)生基因突變或者獲得外源性耐藥基因而產(chǎn)生的。敏感菌可以通過質(zhì)粒(plasmid)、轉(zhuǎn)座子(transposon)、整合子(integron)和噬菌體(phage)等可移動(dòng)遺傳元件(MGEs)以轉(zhuǎn)化(transformation)、接合(conjugation)和轉(zhuǎn)導(dǎo)(transduction)等水平基因轉(zhuǎn)移的方式獲得外源性耐藥基因，從而成為耐藥細(xì)菌來抵抗外界抗生素的脅迫，給臨床抗感染治療帶來巨大的困難和挑戰(zhàn)(圖2)[3-4,62]。轉(zhuǎn)化是受體細(xì)菌可以從周圍環(huán)境中直接獲取DNA片段，并整合表達(dá)從而獲得耐藥性；接合是通過供體菌和受體菌的性菌毛接觸形成通道來進(jìn)行基因交流，接合轉(zhuǎn)移的載體多為可自主轉(zhuǎn)移的質(zhì)?；蚪雍闲赞D(zhuǎn)座子；轉(zhuǎn)導(dǎo)是噬菌體在脫離原宿主菌并重新組裝成子代噬菌體時(shí)，會(huì)攜帶部分原宿主菌基因如耐藥基因，在侵染新宿主菌同時(shí)將耐藥基因整合到宿主菌上，使其表現(xiàn)出耐藥性[62]。有報(bào)道指出，在哺乳動(dòng)物腸道中，耐藥基因更傾向于通過接合和轉(zhuǎn)導(dǎo)來進(jìn)行水平基因轉(zhuǎn)移，而不是轉(zhuǎn)化[13,63]。研究證明，腸道厚壁菌門的厭氧菌可以通過接合的方式將萬古霉素類耐藥基因vanB傳給條件致病菌[64-65]。擬桿菌屬腸道細(xì)菌能通過接合性轉(zhuǎn)座子CTnDOT傳播耐藥基因使得其他細(xì)菌獲得四環(huán)素和紅霉素耐藥性，并且低濃度四環(huán)素暴露可以進(jìn)一步促進(jìn)該轉(zhuǎn)座子對耐藥基因的接合轉(zhuǎn)移[66]。近年來，學(xué)者們發(fā)現(xiàn)噬菌體也是腸道微生物生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，與人類疾病和健康存在密切聯(lián)系，并且是耐藥基因水平轉(zhuǎn)移的重要元件[67]。針對80位健康志愿者的糞便樣品的研究證實(shí)，>70%的樣品中的噬菌體攜帶至少一種耐藥基因如blaTEM、blaCTX-M-1和qnrA等[68]。此外，研究者發(fā)現(xiàn)，口服抗生素能夠增高小鼠腸道噬菌體中耐藥基因的豐度，并促進(jìn)噬菌體對耐藥基因的水平轉(zhuǎn)移[69]。

圖2 水平基因轉(zhuǎn)移的3種主要方式[3,62]注：ARG表示耐藥基因。Fig. 2 Three main mechanisms of horizontal gene transfer [3,62]Note: ARG stands for antibiotic resistance genes.

3.2 腸道耐藥基因組的進(jìn)化

在1928年Alexander Fleming發(fā)現(xiàn)青霉素前，具有耐藥性的細(xì)菌早已在地球上出現(xiàn)，在距今約400萬年的洞穴斷層樣品和3萬年前的永久凍土中檢出了耐藥細(xì)菌和耐藥基因[8,70-71]。同時(shí)，Santiago-Rodriguez等[72]在11世紀(jì)的木乃伊腸道中發(fā)現(xiàn)了β-內(nèi)酰胺類、四環(huán)素類、氯霉素類和氨基糖苷類等耐藥基因，證明細(xì)菌耐藥現(xiàn)象在人類腸道中早已存在，腸道耐藥細(xì)菌并非都是因服用抗生素形成的選擇壓力而篩選出來的。綜合眾多人體腸道、土壤和冰川等不同生態(tài)系統(tǒng)中耐藥基因的研究成果，學(xué)者們推測所有耐藥基因都起源于遠(yuǎn)古時(shí)期環(huán)境中產(chǎn)抗生素細(xì)菌攜帶的前體耐藥基因(precursor-resistant genes)，這些基因在自然條件下不斷進(jìn)化和傳播，是一個(gè)緩慢并隨機(jī)的過程[5-7,73]?？股乇旧砭褪且恍┘?xì)菌和真菌等微生物的次級代謝產(chǎn)物，這些微生物同時(shí)也演化出相應(yīng)的耐藥機(jī)制來避免自身受到抗生素的脅迫，從而在生存競爭中具備一定的優(yōu)勢，這種耐藥性是自然界固有的一種特性[74]。固有耐藥基因可能是一些獲得性耐藥基因的來源，已有研究表明，固有耐藥基因能夠被可移動(dòng)遺傳元件捕獲進(jìn)而傳播至其他細(xì)菌中[75]。此外，獲得性耐藥也可以通過基因突變產(chǎn)生，當(dāng)耐藥基因編碼的蛋白發(fā)生個(gè)別氨基酸位點(diǎn)變化時(shí)，就可能導(dǎo)致新的變體(variants)出現(xiàn)，使酶的水解底物范圍產(chǎn)生差異。β-內(nèi)酰胺類抗生素為臨床最常用的一類抗菌藥物，到如今β-內(nèi)酰胺類耐藥基因的很多亞型已擁有眾多變體，如TEM(>200種)、SHV(>160種)和CTX-M類(>130種) (http://www.lahey.org/studies/webt.htm)。TEM-1在1960年首次被發(fā)現(xiàn)可以通過質(zhì)粒攜帶傳播，該酶可以水解青霉素和初代頭孢菌素，之后陸續(xù)發(fā)現(xiàn)該酶基因點(diǎn)突變后形成的變體，如TEM-2和TEM-3等[76]。TEM-3最初于1989年發(fā)現(xiàn)，并作為第一個(gè)可歸為超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(extended-spectrumβ-lactamases, ESBLs)的TEM耐藥基因。

雖然，細(xì)菌耐藥性并非因現(xiàn)代抗生素的應(yīng)用而產(chǎn)生，但近年來抗生素的濫用顯著加速了腸道耐藥基因的進(jìn)化和傳播。目前，抗生素在臨床和養(yǎng)殖業(yè)中都存在不合理使用及持續(xù)濫用的情況，大部分抗生素不能夠被人類或動(dòng)物充分吸收[77]。剩余抗生素形成選擇性壓力，一方面能殺滅或抑制敏感細(xì)菌，降低其對耐藥細(xì)菌的生存競爭，促進(jìn)耐藥基因和耐藥細(xì)菌不斷被篩選和富集；另一方面抗生素促進(jìn)了耐藥基因在不同細(xì)菌間的水平轉(zhuǎn)移和傳播，水平基因轉(zhuǎn)移不僅發(fā)生在同種細(xì)菌中，甚至發(fā)生在不同種屬的細(xì)菌中，使得部分敏感細(xì)菌獲得耐藥性，這在細(xì)菌耐藥性的進(jìn)化過程中起到重要作用。同自然環(huán)境相比，醫(yī)院中抗生素的使用劑量更高，加劇了腸道耐藥基因的進(jìn)化速度，在諸多壓力的“層層選拔”下，多重耐藥細(xì)菌的生存優(yōu)勢更為明顯，它們能夠?qū)追N抗生素同時(shí)耐藥，給臨床治療造成巨大的風(fēng)險(xiǎn)。研究者發(fā)現(xiàn)，超廣譜β-內(nèi)酰胺酶的大量出現(xiàn)與1980年后頭孢菌素在臨床上的普遍應(yīng)用有關(guān)，該類酶能夠?qū)η嗝顾仡惣俺醮?、二代和三代頭孢菌素耐藥，產(chǎn)ESBLs菌已經(jīng)成為醫(yī)院感染的重要因素[78-79]。通過對23個(gè)歐洲國家的抗生素使用與耐藥細(xì)菌分析后發(fā)現(xiàn)，歐洲的細(xì)菌耐藥情況與醫(yī)療中β-內(nèi)酰胺類抗生素和大環(huán)內(nèi)酯類抗生素廣泛使用有關(guān)[80]。對美國在1950—2002年間從人體和食用動(dòng)物的糞便、血液和尿液等中分離得到的大腸桿菌的耐藥性進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，耐藥性進(jìn)化與臨床新型抗生素市場化有直接關(guān)系[81]。

4 人體腸道耐藥基因組的研究展望(The future prospect of human gut resistome)

人類與病原微生物的斗爭是一場永恒的博弈，抗生素的濫用加速了腸道微生物耐藥基因組的進(jìn)化，導(dǎo)致了對多種抗生素耐藥的“超級細(xì)菌”的催生與傳播，其同埃博拉病毒、SARS冠狀病毒和最新發(fā)現(xiàn)的新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)等都對人類生命健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅。如今細(xì)菌耐藥形勢已經(jīng)非常嚴(yán)峻，人體腸道耐藥基因組及耐藥細(xì)菌研究的學(xué)術(shù)意義和應(yīng)用價(jià)值不言而喻，未來的研究重點(diǎn)應(yīng)集中在以下幾個(gè)方面：

(1)統(tǒng)一實(shí)驗(yàn)操作流程、實(shí)現(xiàn)人體腸道耐藥基因組的標(biāo)準(zhǔn)化分析對于該領(lǐng)域的研究具有非常重要的意義，相關(guān)分子生物學(xué)和生物信息學(xué)方法以及技術(shù)平臺也有待提升。

(2)有關(guān)人類腸道耐藥基因組的組成分布和影響因素的研究尚未完善，還有待全面深入的探究，新型耐藥基因仍在不斷被發(fā)現(xiàn)，耐藥基因數(shù)據(jù)庫仍需不斷補(bǔ)充和完善。全球人群類型眾多，加之影響腸道耐藥基因組的因素非常復(fù)雜，該領(lǐng)域大規(guī)模、多種類的人群樣品尤其是人群隊(duì)列樣品的研究數(shù)據(jù)仍十分缺乏，亟待建立大數(shù)據(jù)研究平臺。

(3)對腸道耐藥基因的具體傳播途徑仍缺乏足夠的認(rèn)識，耐藥基因在腸道菌群尤其是致病菌間的傳播機(jī)制、在母嬰之間的遷移規(guī)律以及在環(huán)境—?jiǎng)游铩梭w多介質(zhì)之中傳播擴(kuò)散的研究還有待新的進(jìn)展，只有了解各個(gè)環(huán)節(jié)的傳播途徑，才能有效遏制全球細(xì)菌耐藥性的傳播。

(4)關(guān)于人體腸道耐藥基因組健康風(fēng)險(xiǎn)的量化評估有待深入研究，從而為臨床耐藥菌感染的診治提供參考依據(jù)。在精準(zhǔn)醫(yī)療的推動(dòng)下，基于腸道耐藥基因組和耐藥細(xì)菌的個(gè)性化診療是未來的發(fā)展趨勢。

(5)為了應(yīng)對細(xì)菌耐藥性的威脅，在臨床耐藥監(jiān)測體系基礎(chǔ)上，進(jìn)一步加強(qiáng)全球環(huán)境耐藥性監(jiān)控體系建設(shè)是防控細(xì)菌耐藥危機(jī)和評估細(xì)菌耐藥性風(fēng)險(xiǎn)的重要手段。

(6)應(yīng)用“One Health”策略探究腸道耐藥基因是未來的研究重點(diǎn)，隨著腸道耐藥基因組研究規(guī)模的不斷擴(kuò)大，開展跨領(lǐng)域合作顯得愈加重要。全球生態(tài)環(huán)境在病原體的傳播中不容忽視，“One Health”的理念旨在建立一個(gè)跨學(xué)科、跨地區(qū)交流的全球合作策略，關(guān)注人類、動(dòng)物和環(huán)境三者的相互影響，從而讓全球更好地應(yīng)對新發(fā)傳染病、細(xì)菌耐藥、食品安全和環(huán)境污染等問題[82-84]。在面對世界公共衛(wèi)生問題和生態(tài)環(huán)境問題時(shí)，沒有一個(gè)國家能獨(dú)善其身，我們應(yīng)當(dāng)樹立“人類命運(yùn)共同體”意識，人類只有一個(gè)地球，全球的利益也是自身的利益。

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