基于IBR模型研究BDE-47和BDE-153對(duì)半滑舌鰨的毒性效應(yīng)

遲瀟，陳碧鵑，孫雪梅，朱琳，唐學(xué)璽，夏斌,*，曲克明

1. 中國(guó)海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院，青島 266071 2. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)部海洋漁業(yè)資源可持續(xù)發(fā)展重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東省漁業(yè)資源與生態(tài)環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青島 266071 3. 青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點(diǎn)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室，海洋生態(tài)與環(huán)境科學(xué)功能實(shí)驗(yàn)室，青島 266237

多溴聯(lián)苯醚(polybrominated diphenyl ethers, PBDEs)是一類常用的溴代阻燃劑，由于其阻燃效率高、熱穩(wěn)定性好、所需添加量小、對(duì)材料性能影響小及價(jià)格便宜等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于電子、化工、建筑、紡織和石油等生產(chǎn)生活領(lǐng)域中[1]。作為添加型阻燃劑，PBDEs不會(huì)和聚氨酯、樹(shù)脂或者聚苯乙烯等物質(zhì)形成穩(wěn)定化學(xué)鍵而緊密連接，因此，在各種產(chǎn)品使用、廢棄、填埋、老化和降解等過(guò)程中，容易從這些產(chǎn)品表面揮發(fā)脫離，釋放到環(huán)境中，隨后通過(guò)大氣沉降和地表徑流等方式進(jìn)入到海洋中[2-3]。如膠州灣養(yǎng)殖區(qū)海水中PBDEs含量范圍為ND～630.8 pg·L-1，其中，BDE-47為主要污染物[4]；中國(guó)香港附近海域水體中PBDEs的含量約為311～1 187 pg·L-1，達(dá)到ng·L-1水平[5]。研究表明，PBDEs屬于環(huán)境內(nèi)分泌干擾物，對(duì)生物作用的主要靶器官有甲狀腺、肝臟和腎臟等，其毒理學(xué)效應(yīng)主要表現(xiàn)為神經(jīng)毒性、內(nèi)分泌系統(tǒng)毒性、生殖發(fā)育毒性、免疫毒性和細(xì)胞毒性[6-8]。目前的研究主要集中于高濃度PBDEs對(duì)水生生物的毒性效應(yīng)，但是關(guān)于環(huán)境濃度PBDEs對(duì)海洋生物的毒性效應(yīng)研究還很少。

近年來(lái)，已在大量水生生物體內(nèi)檢測(cè)到PBDEs，包括魚(yú)類、白鯨(Delphinapterusleucas)、環(huán)斑海豹(Phocahispida)和北極熊(Ursusmaritimus)等海洋哺乳類生物[9-11]，特別是在魚(yú)體內(nèi)的富集情況尤為嚴(yán)重[12]。目前，已開(kāi)展6種PBDEs同系物(BDE-28、BDE-47、BDE-99、BDE-100、BDE-153和BDE-183)對(duì)斑馬魚(yú)(Barchydanioreriovar)的毒性效應(yīng)研究[13]。但是PBDEs對(duì)海洋經(jīng)濟(jì)魚(yú)類的毒性效應(yīng)研究較少，魚(yú)類是海洋生態(tài)系統(tǒng)中的頂級(jí)群落，在海洋生態(tài)系統(tǒng)中起著重要作用，因此，研究PBDEs對(duì)海洋魚(yú)類的毒性效應(yīng)具有重要意義。半滑舌鰨，屬鰈形目、舌鰨科、舌鰨屬，主要分布在我國(guó)渤海和黃海等近海海域，是我國(guó)重要的名貴海水魚(yú)類，也是近海增養(yǎng)殖品種，但是目前關(guān)于PBDEs對(duì)半滑舌鰨毒性效應(yīng)的研究還未見(jiàn)報(bào)道。

綜合生物標(biāo)志物響應(yīng)(integrated biomarker response, IBR)指數(shù)能夠綜合所有的生物標(biāo)志物對(duì)污染物的響應(yīng)，轉(zhuǎn)換成一個(gè)“壓力指數(shù)”值，已經(jīng)成功應(yīng)用于評(píng)估石油烴等多種污染物的生物毒性效應(yīng)研究中[14-15]。本文測(cè)定了不同暴露濃度下半滑舌鰨肝臟的超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、過(guò)氧化氫酶(catalase, CAT)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)、雌激素受體(estrogen receptor, ER)和7-乙氧基-3-異吩唑酮脫乙基酶(7-ethoxyresorufin-o-deethylase, EROD)的活性以及丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量，并運(yùn)用IBR模型來(lái)研究BDE-47和BDE-153對(duì)半滑舌鰨的毒性效應(yīng)，為客觀評(píng)價(jià)PBDEs的海洋生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供理論依據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 材料與儀器

1.1.1 實(shí)驗(yàn)生物及其馴養(yǎng)

半滑舌鰨購(gòu)于萊州市金益源水產(chǎn)公司，體長(zhǎng)為(3.0±0.5) cm，體重為(2.4±0.5) g。

實(shí)驗(yàn)前，暫養(yǎng)3～5 d，自然死亡率低于1%；暫養(yǎng)過(guò)程中水溫22 ℃，連續(xù)充氣，每天喂食1次，每天更換1/3水量。

1.1.2 儀器與試劑

2,2’,4,4’-四溴聯(lián)苯醚(BDE-47)、2,2’,4,4’,5,5’-六溴聯(lián)苯醚(BDE-153)均購(gòu)于AccuStandard公司(色譜純)。PBDEs微溶于水，以二甲基亞砜(DMSO)(色譜純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)為溶劑，配制每種PBDEs濃度為1 mg·L-1的母液，4 ℃下保存?zhèn)溆?。?shí)驗(yàn)前，用F/2培養(yǎng)基依次稀釋成所需濃度的實(shí)驗(yàn)溶液。

丙二醛試劑盒、超氧化物歧化酶試劑盒、谷胱甘肽試劑盒、谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶試劑盒、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶試劑盒、過(guò)氧化氫酶試劑盒、考馬斯亮藍(lán)總蛋白試劑盒和標(biāo)準(zhǔn)蛋白均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

本實(shí)驗(yàn)設(shè)置5、500和50 000 ng·L-1這3組實(shí)驗(yàn)濃度，并設(shè)有空白對(duì)照組、溶劑對(duì)照組，每組3個(gè)平行。其中，5 ng·L-1為環(huán)境濃度[16]。暴露時(shí)間為15 d，挑選體長(zhǎng)相近、健康的半滑舌鰨用于實(shí)驗(yàn)，每組放入半滑舌鰨幼魚(yú)15尾，實(shí)驗(yàn)期間每天早上適量投喂1次飼料，24 h不間斷微量充氣。采用半靜水接觸染毒法，每隔24 h換相同濃度的新鮮試驗(yàn)液。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始后，于1、5、7和15 d隨機(jī)選取一尾，將隨機(jī)撈取的樣本魚(yú)麻醉后在冰盤上進(jìn)行解剖，取出肝臟并去除表面附帶的結(jié)締組織，在4 ℃生理鹽水中漂洗干凈，用濾紙拭干表面水分，稱取適量樣品。生理鹽水作為勻漿介質(zhì)，在冰水浴條件下，用勻漿器制成10%的肝臟組織勻漿液。在4 ℃、2 000 r·min-1下離心15 min，上清液即為粗酶液，用于酶活性測(cè)定。測(cè)定用試劑盒均購(gòu)于南京建成生物工程研究所，并使用酶標(biāo)儀進(jìn)行測(cè)定。

1.3 測(cè)定方法

SOD通過(guò)黃嚷吟及黃嚷吟氧化酶反應(yīng)產(chǎn)生超氧陰離子自由基，后者與胺鹽可形成亞硝酸鹽，在顯色劑的作用下呈現(xiàn)紫紅色，在450 nm處可測(cè)定其吸光度值。SOD活性單位定義：每毫克組織蛋白在1 mL反應(yīng)液中，SOD抑制率達(dá)50%時(shí)所對(duì)應(yīng)的酶量。

GSH-Px可以促使H2O2與還原性谷胱甘肽(GSH)反應(yīng)生成H2O和氧化性谷胱甘肽(GSSG)，而GSH可與二硫代二硝基苯甲酸作用，生成的5-六代二硝基苯甲酸陰離子呈現(xiàn)黃色，在412 nm處測(cè)吸光度，從而得到GSH-Px活性。GSH-Px活性單位定義：每毫克蛋白質(zhì)每分鐘扣除非酶反應(yīng)，使GSH濃度降低1 μmol·L-1為一個(gè)酶活力單位。

CAT分解H2O2的反應(yīng)通過(guò)鉬酸銨而中止，剩余的H2O2與鉬酸銨作用產(chǎn)生淡黃色的絡(luò)合物，可在405 nm處測(cè)定其生成量，由此計(jì)算H2O2的反應(yīng)量，計(jì)算CAT活性。CAT活性單位定義：每毫克組織蛋白每秒鐘分解1 μmol的H2O2的量。

MDA與硫代巴比妥酸(TBA)反應(yīng)生成紅棕色產(chǎn)物，在532 nm處有最大吸收峰，可測(cè)定此波長(zhǎng)處的吸光值，從而確定MDA含量。

用純化ER捕獲抗體包被微孔板，制成固相抗體，微孔中加入ER，與辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的檢測(cè)抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，經(jīng)過(guò)徹底洗滌后加底物3,3’,5,5’-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)顯色，在450 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，從而確定ER含量。

EROD酶采用快速終止熒光光度法，在催化劑作用下，催化7-乙氧基-異吩噁唑酮轉(zhuǎn)化成為熒光代謝產(chǎn)物異吩唑酮，經(jīng)代謝后富集，異吩唑酮的量與EROD活性成正比，可以通過(guò)測(cè)定熒光密度得到EROD活性。EROD活性單位定義：用每分鐘每毫克蛋白產(chǎn)生的9-羥基-3-異吩唑酮相對(duì)量來(lái)表示。

1.4 IBR計(jì)算方法

(1)

式中：xi’為xi均一化后的值。

各階段生物標(biāo)志物的得分(Bi值)計(jì)算公式為：

Bi=Z+|xmin|

(2)

式中：|xmin|為各階段生物標(biāo)志物均一化處理后的數(shù)據(jù)最小值的絕對(duì)值，Bi值大小在星狀圖中以輻射線的長(zhǎng)度代表，星狀圖面積(即圖中由相鄰生物標(biāo)志物的輻射線圍成的星狀圖面積Ai之和)按照下式計(jì)算：

(3)

式中：

Ai=Bi/2sinβ(Bicosβ+Bi+1sinβ)

(4)

β=arctan(Bi+1sinα/Bi-Bi+1cosα)

(5)

式中：n為生物標(biāo)志物數(shù)量，β為相鄰兩輻射線圍成的三角形的夾角，α為相鄰的2條輻射線夾角，α=2π/n；Bn+1=B1。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

所有數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Means±SD)表示，應(yīng)用SPSS 16對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，采用One-way ANOVA對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，并用Duncan’s進(jìn)行顯著性差異，顯著性水平P<0.05。

2 結(jié)果與討論(Results and discussion)

2.1 BDE-47和BDE-153對(duì)半滑舌鰨肝臟SOD活性的影響

BDE-47和BDE-153對(duì)半滑舌鰨肝臟SOD活性的影響如圖1所示?？瞻讓?duì)照組半滑舌鰨肝臟組織中SOD活性在實(shí)驗(yàn)期間基本保持不變，溶劑對(duì)照組的SOD活性基本保持不變，與空白對(duì)照組沒(méi)有顯著差異。BDE-47暴露下，5 ng·L-1濃度組的SOD活性與對(duì)照組相比變化不大，在7 d時(shí)SOD活性略有升高但無(wú)顯著性差異；500 ng·L-1濃度組的SOD活性先升高后有所降低，在1 d和3 d時(shí)顯著升高，分別為45.62 U·mg prot-1和48.39 U·mg prot-1，在7 d和15 d時(shí)SOD活性雖然有所降低但仍高于對(duì)照組；而50 000 ng·L-1濃度組SOD活性在暴露之后迅速降低，在3 d以后，顯著低于對(duì)照組。BDE-153暴露下，5 ng·L-1濃度組的SOD活性略有浮動(dòng)但無(wú)顯著變化；500 ng·L-1濃度組的SOD活性在1 d時(shí)迅速升高，后逐漸降低；而50 000 ng·L-1濃度組SOD活性在暴露之后迅速降低，在7 d以后，顯著低于對(duì)照組。

圖1 BDE-47和BDE-153對(duì)半滑舌鰨肝臟超氧化物歧化酶(SOD)活性的影響(n=3)注：*表示顯著性差異，P0.05。Fig. 1 Effects of BDE-47 and BDE-153 on superoxide dismutase (SOD) activity in liver of Cynoglossus semilaevis Gunther (n=3)Note: * indicates significant differences, P0.05.

2.2 BDE-47和BDE-153對(duì)半滑舌鰨肝臟GSH-Px活性的影響

BDE-47和BDE-153對(duì)半滑舌鰨肝臟GSH-Px活性的影響如圖2所示。空白對(duì)照組半滑舌鰨肝臟GSH-Px活性基本保持不變，溶劑對(duì)照組的GSH-Px活性也基本保持不變，與空白對(duì)照組無(wú)明顯差異。在BDE-47暴露下，5 ng·L-1濃度組中GSH-Px活性無(wú)顯著變化；500 ng·L-1濃度組中GSH-Px活性迅速升高后逐漸降低，在1 d時(shí)GSH-Px活性為32.81 U·mg prot-1，顯著高于對(duì)照組，隨后逐漸降低至對(duì)照組水平；50 000 ng·L-1濃度組中GSH-Px活性隨時(shí)間增長(zhǎng)不斷降低，在7 d和15 d時(shí)分別為15.61 U·mg prot-1和13.60 U·mg prot-1，顯著低于對(duì)照組。在BDE-153暴露下，5 ng·L-1濃度組中GSH-Px活性無(wú)顯著變化；500 ng·L-1濃度組中GSH-Px活性先升高后降低，在1 d時(shí)GSH-Px活性為31.36 U·mg prot-1，顯著高于對(duì)照組，隨后逐漸降低；50 000 ng·L-1濃度組中GSH-Px活性逐漸降低，在7 d和15 d時(shí)分別為16.90 U·mg prot-1和16.62 U·mg prot-1，顯著低于對(duì)照組。

圖2 BDE-47和BDE-153對(duì)半滑舌鰨肝臟谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)活性的影響(n=3)注：*表示顯著性差異，P0.05。Fig. 2 Effects of BDE-47 and BDE-153 on glutathione peroxidase (GSH-Px) activity in liver of Cynoglossus semilaevis Gunther (n=3)Note: * indicates significant differences, P0.05.

GSH-Px是機(jī)體內(nèi)廣泛存在的一種重要過(guò)氧化物分解酶，它能催化GSH變?yōu)镚SSG，同時(shí)促進(jìn)H2O2的分解，分解產(chǎn)生的物質(zhì)可以清除在細(xì)胞呼吸代謝過(guò)程中產(chǎn)生的過(guò)氧化物和羥自由基，使有毒的過(guò)氧化物還原成無(wú)毒的羥基化合物，從而保護(hù)細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)及功能不受過(guò)氧化物的干擾及損害[23-24]。有研究發(fā)現(xiàn)，BDE-47和BDE-209對(duì)鯽魚(yú)(Carassiusauratusauratus)GSH-Px活性影響呈現(xiàn)顯著的劑量效應(yīng)[22]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，5 ng·L-1濃度組中GSH-Px活性無(wú)顯著變化，說(shuō)明環(huán)境濃度的BDE-47和BDE-153不會(huì)對(duì)半滑舌鰨GSH-Px活性產(chǎn)生顯著影響；500 ng·L-1濃度組中GSH-Px活性先升高后降低，這是由于低濃度刺激使得機(jī)體抗氧化系統(tǒng)清除體內(nèi)產(chǎn)生的自由基，從而迅速抵御外界環(huán)境的刺激；但是50 000 ng·L-1濃度組中GSH-Px活性逐漸降低，在后期顯著低于對(duì)照組，說(shuō)明在長(zhǎng)時(shí)間的高濃度脅迫下，機(jī)體抗氧化系統(tǒng)出現(xiàn)損傷，使得其GSH-Px活性不斷降低。

2.3 BDE-47和BDE-153對(duì)半滑舌鰨肝臟CAT活性的影響

BDE-47和BDE-153對(duì)半滑舌鰨肝臟CAT活性的影響如圖3所示。空白對(duì)照組與半滑舌鰨肝臟組織中CAT活性基本保持不變，溶劑對(duì)照組的CAT活性也基本保持不變，與空白對(duì)照組無(wú)明顯差異。在BDE-47暴露下，5 ng·L-1濃度組中CAT活性無(wú)顯著變化；500 ng·L-1濃度組中CAT活性在3 d內(nèi)逐漸升高，在3 d時(shí)CAT活性顯著高于對(duì)照組，隨后降低，CAT活性顯著低于對(duì)照組；50 000 ng·L-1濃度組中CAT活性在3 d內(nèi)隨時(shí)間增長(zhǎng)不斷升高，明顯高于對(duì)照組，隨后降低，顯著低于對(duì)照組。在BDE-153暴露下，5 ng·L-1濃度組中CAT活性無(wú)顯著變化；500 ng·L-1濃度組中CAT活性在3 d內(nèi)逐漸升高，但與對(duì)照組無(wú)顯著差異，隨后降低，顯著低于對(duì)照組；50 000 ng·L-1濃度組中CAT活性在3 d內(nèi)隨時(shí)間增長(zhǎng)不斷升高，顯著高于對(duì)照組，隨后下降，顯著低于對(duì)照組。

圖3 BDE-47和BDE-153對(duì)半滑舌鰨肝臟過(guò)氧化氫酶(CAT)活性的影響(n=3)注：*表示顯著性差異，P0.05。Fig. 3 Effects of BDE-47 and BDE-153 on catalase (CAT) activity in liver of Cynoglossus semilaevis Gunther (n=3)Note: * indicates significant differences, P0.05.

CAT是生物體內(nèi)重要的抗氧化酶，可以促使H2O2分解為O2和H2O，排除生物體內(nèi)的H2O2，從而保護(hù)細(xì)胞避免受到H2O2的損傷，是生物體內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)的重要組成部分[25-26]。CAT活性也經(jīng)常被用作監(jiān)測(cè)環(huán)境污染物的生物標(biāo)志物。研究表明，較低濃度的污染物對(duì)CAT產(chǎn)生誘導(dǎo)激活作用，可增強(qiáng)機(jī)體消除活性氧自由基的能力，高濃度污染物對(duì)CAT產(chǎn)生抑制是污染物對(duì)生物體的作用超過(guò)機(jī)體的適應(yīng)能力而產(chǎn)生的中毒反應(yīng)的前兆[27]；低濃度BDE-47可誘導(dǎo)黃孢原毛平革菌(PhanerochaetechrysosporiumBurdsall)細(xì)胞內(nèi)CAT活性的升高[28]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，5 ng·L-1濃度組中CAT活性無(wú)顯著變化，說(shuō)明環(huán)境濃度BDE-47和BDE-153不會(huì)對(duì)半滑舌鰨CAT活性產(chǎn)生顯著影響；500 ng·L-1濃度組中CAT活性先短暫升高后顯著降低，說(shuō)明短暫的PBDEs脅迫刺激了機(jī)體的抗氧化系統(tǒng)，使其發(fā)揮功能從而清除體內(nèi)的H2O2，但由于長(zhǎng)時(shí)間的暴露，抗氧化系統(tǒng)受到了嚴(yán)重?fù)p傷，使其CAT活性無(wú)法恢復(fù)。

2.4 BDE-47和BDE-153對(duì)半滑舌鰨肝臟MDA含量的影響

BDE-47和BDE-153對(duì)半滑舌鰨肝臟MDA含量的影響如圖4所示?？瞻讓?duì)照組半滑舌鰨肝臟MDA含量基本保持不變，溶劑對(duì)照組的MDA含量基本保持不變，與空白對(duì)照組無(wú)顯著差異。在BDE-47暴露下，5 ng·L-1濃度組MDA含量與對(duì)照組無(wú)顯著差異；500 ng·L-1濃度組中MDA含量先升高后逐漸降低，在1 d時(shí)達(dá)到8.6 nmol·mg prot-1，顯著高于對(duì)照組，后逐漸降低，在15 d時(shí)與對(duì)照組無(wú)顯著差異；50 000 ng·L-1濃度組中MDA含量與對(duì)照組相比顯著升高，在1 d達(dá)到對(duì)照組含量的2倍，后在15 d中逐漸降低，但都顯著高于對(duì)照組。在BDE-153暴露下，5 ng·L-1濃度組MDA含量與對(duì)照組無(wú)顯著差異；500 ng·L-1濃度組中MDA含量先升高后逐漸降低，在1 d時(shí)達(dá)到7.99 nmol·mg prot-1，顯著高于對(duì)照組，后逐漸降低，在15 d恢復(fù)至對(duì)照組水平；50 000 ng·L-1濃度組中MDA含量顯著升高，在1 d達(dá)到12.23 nmol·mg prot-1，后在15 d中逐漸降低，但均顯著高于對(duì)照組。

圖4 BDE-47和BDE-153對(duì)半滑舌鰨肝臟丙二醛(MDA)含量的影響(n=3)注：*表示顯著性差異，P0.05。Fig. 4 Effects of BDE-47 and BDE-153 on the content of malondialdehyde (MDA) in liver of Cynoglossus semilaevis Gunther (n=3)Note: * indicates significant differences, P0.05.

MDA含量是反映機(jī)體抗氧化潛在能力的重要參數(shù)，可以反映機(jī)體脂質(zhì)過(guò)氧化速率和強(qiáng)度，也能間接反映組織過(guò)氧化損傷程度[29]。已有研究發(fā)現(xiàn)，暴露于BDE-47的太平洋真寬水蚤(Eurytemorapacifica)和日本虎斑猛水蚤(TigriopusjaponicusMori)的MDA含量隨其濃度的升高而增加[30]；暴露于BDE-47的劍尾魚(yú)肝臟MDA含量隨濃度升高而增加[31]；暴露于BDE-209的雙葉杜鵑葉片的MDA隨其濃度升高而增加[32]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，5 ng·L-1濃度組中MDA含量無(wú)顯著變化，說(shuō)明環(huán)境濃度BDE-47和BDE-153不會(huì)對(duì)半滑舌鰨MDA產(chǎn)生顯著影響；500 ng·L-1濃度組中MDA含量迅速升高，說(shuō)明肝臟中抗氧化系統(tǒng)已不足以消除過(guò)量的自由基，肝臟受到損傷，導(dǎo)致MDA在肝臟中積累，含量迅速增加，但隨著暴露時(shí)間的延長(zhǎng)，體內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)被激活，MDA被逐漸清除，使得其含量降低到正常水平，但MDA含量在高濃度組中暴露15 d時(shí)仍顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，其原因可能是由于長(zhǎng)時(shí)間的高濃度暴露，使其體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)的解毒能力受損，導(dǎo)致MDA在肝臟中積累而無(wú)法清除。

2.5 BDE-47和BDE-153對(duì)半滑舌鰨肝臟ER含量的影響

BDE-47和BDE-153對(duì)半滑舌鰨肝臟ER含量的影響如圖5所示?？瞻讓?duì)照組半滑舌鰨肝臟ER含量基本保持不變，溶劑對(duì)照組的ER含量基本保持不變，與空白對(duì)照組無(wú)顯著差異。在BDE-47暴露下，5 ng·L-1濃度組ER含量在15 d內(nèi)無(wú)顯著變化，1 d中不同濃度組ER含量相差不大；隨時(shí)間增長(zhǎng)，500 ng·L-1濃度組中ER含量逐漸升高，在3 d后顯著高于對(duì)照組；50 000 ng·L-1濃度組中ER含量從1 d開(kāi)始隨時(shí)間逐漸升高，且顯著高于對(duì)照組。在BDE-153暴露下，5 ng·L-1濃度組ER含量在15 d內(nèi)無(wú)顯著變化，1 d中不同濃度組ER含量相差不大，但隨時(shí)間增長(zhǎng)，500 ng·L-1濃度組中ER含量逐漸升高，在7 d以后與對(duì)照組有顯著差異；50 000 ng·L-1濃度組中ER含量從3 d開(kāi)始與對(duì)照組有顯著差異。

ER主要有2種亞型，可通過(guò)參與雌性脊椎動(dòng)物中性腺組織基因的表達(dá)與調(diào)控，從而進(jìn)一步影響雌性的第二性征、繁殖周期、生殖力及妊娠[33]。ER選擇性激活劑注射實(shí)驗(yàn)證明，ER可以反饋抑制促性腺激素的表達(dá)[34]。目前，已有研究發(fā)現(xiàn)，BDE-47可以干擾細(xì)胞內(nèi)ER從而影響雌激素相關(guān)基因的表達(dá)，產(chǎn)生內(nèi)分泌毒性[35]；Dang等[36]也發(fā)現(xiàn)，BDE-47暴露可降低豬卵巢濾泡細(xì)胞中ER，從而加強(qiáng)了雌激素對(duì)卵巢的刺激作用，干擾動(dòng)物性激素的作用。

圖5 BDE-47和BDE-153對(duì)半滑舌鰨肝臟雌激素受體(ER)含量的影響(n=3)注：*表示顯著性差異，P0.05。Fig. 5 Effects of BDE-47 and BDE-153 on the content of estrogen receptor (ER) in liver of Cynoglossus semilaevis Gunther (n=3)Note: * indicates significant differences, P0.05.

2.6 BDE-47和BDE-153對(duì)半滑舌鰨肝臟EROD活性的影響

BDE-47和BDE-153對(duì)半滑舌鰨肝臟EROD活性的影響如圖6所示。空白對(duì)照組半滑舌鰨肝臟EROD活性基本保持不變，溶劑對(duì)照組的EROD活性基本保持不變，與空白對(duì)照組無(wú)顯著差異。在BDE-47暴露下，5 ng·L-1濃度組EROD活性在15 d內(nèi)無(wú)顯著變化，1 d中不同濃度組EROD活性相差不大，但隨時(shí)間增長(zhǎng)，500 ng·L-1和50 000 ng·L-1濃度組中EROD活性逐漸升高，在7 d時(shí)到達(dá)峰值，后在15 d時(shí)略有降低，均與對(duì)照組有顯著差異。在BDE-153暴露下，5 ng·L-1濃度組EROD活性在15 d內(nèi)無(wú)顯著變化，1 d中不同濃度組EROD活性相差不大，但隨時(shí)間增長(zhǎng)，500 ng·L-1和50 000 ng·L-1濃度組中EROD活性逐漸升高，在7 d時(shí)到達(dá)峰值，后在15 d時(shí)略有降低，但均與對(duì)照組有顯著差異。

圖6 BDE-47和BDE-153對(duì)半滑舌鰨肝臟7-乙氧基-3-異吩唑酮脫乙基酶(EROD)活性的影響(n=3)注：*表示顯著性差異，P0.05。Fig. 6 Effects of BDE-47 and BDE-153 on 7-ethoxyresorufin-o-deethylase (EROD) activity in liver of Cynoglossus semilaevis Gunther (n=3)Note: * indicates significant difference, P0.05.

海洋魚(yú)類混合功能氧化酶的典型反應(yīng)為包括芳烴羥化酶和EROD的反應(yīng)，其中，EROD的反應(yīng)更具代表性。在正常環(huán)境中，生物體內(nèi)混合功能氧化酶的活性相對(duì)較低，但在外來(lái)某些特定的化學(xué)污染物的誘導(dǎo)下，它的活性異常增高[37]。結(jié)果表明，5 ng·L-1濃度組EROD活性無(wú)顯著變化，說(shuō)明環(huán)境濃度劑量下的BDE-47和BDE-153不會(huì)對(duì)半滑舌鰨EROD活性產(chǎn)生顯著影響；500 ng·L-1和50 000 ng·L-1濃度組EROD活性都隨暴露時(shí)間的增長(zhǎng)而不斷升高。目前，有研究表明，PBDEs對(duì)生物體內(nèi)的EROD活性有影響，如McDonald[38]在研究BDE-71對(duì)雄性大鼠(Rattusnorvegicus)的毒性效應(yīng)時(shí)，發(fā)現(xiàn)大鼠體內(nèi)EROD活性增加。Eggens等[39]在研究紅鯔魚(yú)(Limandalimanda)體內(nèi)的EROD活性時(shí)發(fā)現(xiàn)，魚(yú)體肝臟內(nèi)多氯聯(lián)苯(PCB-28)的濃度與EROD活性存在良好的正相關(guān)關(guān)系。

2.7 IBR分析

由于各種酶活性在污染脅迫下，既有抑制，又有誘導(dǎo)，而且各種酶在生物毒性暴露響應(yīng)中具有不同步性，表明不同的酶對(duì)污染物刺激的敏感程度有所差異，所以單一的酶活性不能很好地定量評(píng)價(jià)污染狀況。應(yīng)該將各種酶以及其他的生物標(biāo)志物結(jié)合起來(lái)，運(yùn)用IBR指數(shù)消除隨機(jī)誤差和變化，才能準(zhǔn)確客觀地評(píng)估海洋環(huán)境的污染狀況[40-41]。IBR值越大，表明生物受到的影響越大[42]。本文選擇SOD、CAT、GSH-Px、MDA、ER和EROD這6個(gè)指標(biāo)進(jìn)行整合，進(jìn)行IBR分析。BDE-47和BDE-153暴露15 d時(shí)半滑舌鰨肝臟的星狀圖及IBR值如圖7所示，BDE-47和BDE-153的IBR值呈現(xiàn)出顯著的劑量效應(yīng)，濃度越高，IBR值越大，表明BDE-47和BDE-153對(duì)半滑舌鰨生物體產(chǎn)生的毒性越大。另外，不同濃度BDE-47的IBR值均大于BDE-153組，這表明低溴代的BDE-47的毒性要高于高溴代的BDE-153。謝嘉[43]運(yùn)用IBR模型評(píng)估BDE-47對(duì)牡蠣(Ostreagigasthunberg)的復(fù)合毒性效應(yīng)，發(fā)現(xiàn)不同站位的長(zhǎng)牡蠣組織中，生物標(biāo)志物的響應(yīng)值存在較大的空間差異。Kim等[44]運(yùn)用IBR模型評(píng)估全氟辛烷磺酸和全氟辛酸對(duì)魚(yú)類的毒性效應(yīng)，發(fā)現(xiàn)全氟辛烷磺酸的毒性效應(yīng)要高于全氟辛酸。Zheng等[14]運(yùn)用IBR對(duì)污染物進(jìn)行毒性效應(yīng)比較，發(fā)現(xiàn)鄰苯二甲酸二環(huán)己基酯毒性最大，鄰苯二甲酸二乙酯毒性最小。Xie等[45]研究了BDE-209及其與BDE-47和BDE-99的混合物對(duì)金魚(yú)(Carassiusauratus)的毒性效應(yīng)，并測(cè)定了暴露4 d后的SOD等酶活生物標(biāo)志物，運(yùn)用IBR模型將多個(gè)生物標(biāo)志物進(jìn)行整合計(jì)算，用于定量評(píng)估不同PBDEs同系物的毒性效應(yīng)：BDE-47>BDE-99>BDE-209。綜上所述，IBR模型能夠有效地對(duì)PBDEs的海洋環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行科學(xué)評(píng)價(jià)。

圖7 BDE-47和BDE-153暴露下半滑舌鰨的綜合生物標(biāo)志物響應(yīng)指數(shù)(IBR)星狀圖和數(shù)值Fig. 7 The integrated biomarker response (IBR) star-shaped diagram and values of Cynoglossus semilaevis Gunther after exposure to BDE-47 or BDE-153

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