食蚊魚(yú)P-糖蛋白基因克隆及三氯生對(duì)其mRNA表達(dá)的影響

宋曉紅，陸愛(ài)金，杜士林，陳雙鳳，陳旺光，梁延鵬，黃亮亮，曾鴻鵠,*

1. 桂林理工大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，桂林 541004 2. 廣西環(huán)境污染控制理論與技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，桂林 541004 3. 巖溶地區(qū)水污染控制與用水安全保障協(xié)同創(chuàng)新中心，桂林 541004

ATP結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)載體蛋白(ATP-binding cassette transporter, ABC)是一組細(xì)胞跨膜糖蛋白，主要功能是介導(dǎo)內(nèi)源和外源分子的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)。ABC家族具有很多結(jié)構(gòu)相似的成員，其中，與毒理學(xué)比較相關(guān)的成員，包括P-糖蛋白(P-glycoprotein, P-gp) (ABCB亞族)、多藥耐藥相關(guān)蛋白(multidrug resistance associated proteins, MRPs) (ABCC亞族)和乳腺癌耐受蛋白(breast cancer resistance protein, BCRP) (ABCG亞族)等[1-3]。其中，P-gp又叫MDR1(multidrug resistance protein 1)，作為能量依賴(lài)型的介導(dǎo)轉(zhuǎn)運(yùn)糖蛋白，具有通道、運(yùn)輸和調(diào)節(jié)功能，對(duì)外源性物質(zhì)的吸收、分布、代謝、排泄和毒性均起到重要作用[4]，可以將細(xì)胞內(nèi)的毒素、重金屬和藥物等物質(zhì)泵出胞外，以減少異源物質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的積累，降低潛在的毒害威脅[5]。P-gp廣泛存在于水生生物組織中，其與機(jī)體內(nèi)其他代謝系統(tǒng)組成完整的解毒和保護(hù)機(jī)制[6]。許多研究表明，生物體中P-gp的mRNA表達(dá)、蛋白水平和活性變化與外源污染物的攝入或暴露密切相關(guān)[2,7-8]，可作為環(huán)境污染物的有效生物標(biāo)志物[9-11]。

三氯生(TCS)是一種常用的廣譜高效抗菌劑，廣泛應(yīng)用于個(gè)人日常護(hù)理用品和醫(yī)療用品等。TCS具有醚類(lèi)和酚類(lèi)基團(tuán)，具有親脂性，易被生物體細(xì)胞吸收并在生物體內(nèi)富集累積[12-13]。近年來(lái)，在水環(huán)境和生物體內(nèi)均不同程度地檢出了TCS，質(zhì)量濃度通常在ng·L-1～μg·L-1和ng·kg-1～μg·kg-1水平[14-16]。TCS長(zhǎng)時(shí)間持續(xù)存在于水環(huán)境中，會(huì)影響水生生物的正常代謝[17]、行為[18]、生長(zhǎng)、繁殖和發(fā)育[19-20]，對(duì)生態(tài)環(huán)境和人類(lèi)健康的潛在風(fēng)險(xiǎn)不可忽視。

魚(yú)類(lèi)的生活與水環(huán)境息息相關(guān)，當(dāng)外源污染物進(jìn)入魚(yú)體時(shí)，機(jī)體會(huì)發(fā)生相應(yīng)的免疫防御反應(yīng)。檢測(cè)TCS暴露中P-gp表達(dá)的變化，有助于闡明TCS對(duì)魚(yú)體的毒性機(jī)理。食蚊魚(yú)(Gambusiaaffinis)是一種小型魚(yú)類(lèi)，具有生長(zhǎng)迅速、卵胎生和繁殖力強(qiáng)等特點(diǎn)，在水環(huán)境中廣泛分布，是重金屬、農(nóng)藥和環(huán)境激素等[21-23]環(huán)境污染物監(jiān)測(cè)的理想實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。本研究以食蚊魚(yú)為實(shí)驗(yàn)材料，通過(guò)克隆測(cè)序獲得了食蚊魚(yú)P-gpcDNA全長(zhǎng)序列，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法開(kāi)展了TCS脅迫與P-gp表達(dá)的時(shí)間-劑量效應(yīng)關(guān)系研究，探討相關(guān)的免疫機(jī)制，為T(mén)CS的生物監(jiān)測(cè)提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

本研究所用食蚊魚(yú)幼魚(yú)購(gòu)自廣西荔浦青山水產(chǎn)養(yǎng)殖場(chǎng)，于實(shí)驗(yàn)室水生生物養(yǎng)殖系統(tǒng)內(nèi)馴養(yǎng)2周，水溫(24 ± 1) ℃，光周期為14 h∶10 h(白晝/黑暗)，每日固定喂食2次小型魚(yú)類(lèi)專(zhuān)用飼料。選取健康、活潑和大小均勻的個(gè)體投入試驗(yàn)，平均體質(zhì)量為(0.10 ± 0.03) g，平均體長(zhǎng)為(2.0 ± 0.3) cm。

1.2 TCS暴露實(shí)驗(yàn)

三氯生(TCS)，純度≥97%，購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；二甲基亞砜(DMSO)，純度>99.8%，購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司。將TCS用DMSO配制成貯備液備用，暴露實(shí)驗(yàn)中DMSO的終濃度為0.01% (V/V)。本研究設(shè)置50、100和150g·L-13個(gè)TCS處理組和1個(gè)DMSO對(duì)照組(0.01%，V/V)，每組設(shè)置3個(gè)平行。

參照文獻(xiàn)方法[24]，在3 L燒杯中開(kāi)展暴露實(shí)驗(yàn)，每個(gè)燒杯中加入2 L實(shí)驗(yàn)溶液，各放入12尾食蚊魚(yú)。采用半靜態(tài)換水方式，實(shí)驗(yàn)用水均為曝氣2 d以上的自來(lái)水，pH為7.1～7.4，水溫(24 ± 1)℃，溶解氧≥5.0 mg·L-1，每日換1/2實(shí)驗(yàn)溶液，固定喂食2次并及時(shí)吸出殘餌和排泄物。分別于12 h、1 d、3 d、5 d、7 d和9 d采樣，每次采樣每個(gè)燒杯隨機(jī)取2尾魚(yú)，即每個(gè)濃度組取6尾魚(yú)，冰浴解剖采集內(nèi)臟團(tuán)樣品后，立即放入RNA保存液(TaKaRa)中，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 P-gp基因cDNA的克隆與序列分析1.3.1 總RNA提取及cDNA的合成

取約30 mg食蚊魚(yú)內(nèi)臟團(tuán)組織勻漿，用RNAiso Plus試劑盒(TaKaRa)參照說(shuō)明書(shū)提取總RNA。用瓊脂糖凝膠電泳和微量分光光度計(jì)(Quawell Q5000)檢測(cè)總RNA的質(zhì)量和完整度。用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser (TaKaRa)合成第一鏈cDNA，用于cDNA中間片段的擴(kuò)增和熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)。用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (Fermentas)合成3’ RACE cDNA模板。

1.3.2 cDNA克隆及測(cè)序

根據(jù)NCBI網(wǎng)站中光若花鳉(Poeciliopsislucida) (No. DQ842514.2)、劍尾魚(yú)(Xiphophorushellerii) (No. HQ829295.1)和羅非魚(yú)(Oreochromisniloticus) (No. DQ842514.2)的P-gp基因序列的保守區(qū)域，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物(表1)，以食蚊魚(yú)內(nèi)臟團(tuán)cDNA為模板擴(kuò)增中間片段。PCR產(chǎn)物經(jīng)回收、純化和克隆后送至深圳華大基因公司測(cè)序。以獲得的食蚊魚(yú)P-gp基因序列為模板，設(shè)計(jì)3’ RACE引物(表1)，通過(guò)特異性引物和3’ RACE試劑盒自帶通用引物開(kāi)展巢式PCR，擴(kuò)增目的基因并測(cè)序。

表1 實(shí)驗(yàn)所用引物序列Table 1 Nucleotide sequences of primers used in present study

1.3.3 序列分析

利用ContigExpress軟件對(duì)獲得的各中間片段與3’端擴(kuò)增片段進(jìn)行拼接。利用DNAStar軟件預(yù)測(cè)P-gp基因的ORF區(qū)域并推導(dǎo)出相應(yīng)的氨基酸序列，統(tǒng)計(jì)蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)氨基酸的含量。用ExPASy在線(xiàn)分析軟件中ProtParam預(yù)測(cè)其等電點(diǎn)和理論分子量等理化性質(zhì)。利用SOPMA在線(xiàn)工具預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)。用Swiss model在線(xiàn)軟件預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)。利用SignalP 5.0程序開(kāi)展信號(hào)肽分析。利用SMART和ExPASy中的PROSITE預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的功能結(jié)構(gòu)域和作用位點(diǎn)。利用Tmpred預(yù)測(cè)跨膜性質(zhì)。利用ESPript 3.0進(jìn)行氨基酸序列的多重序列比對(duì)分析，運(yùn)用BLAST軟件開(kāi)展氨基酸序列的同源性分析，利用MEGA5.0軟件，以鄰位相連法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，分支置信度采用自展法(Bootstrap analysis)重復(fù)檢驗(yàn)1 000次。

1.4 TCS暴露后P-gp基因mRNA表達(dá)量的測(cè)定

根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)獲得的P-gpcDNA序列設(shè)計(jì)qRT-PCR特異性引物(表1)，以食蚊魚(yú)GAPDH基因作為內(nèi)參基因[25]，參照SYBR?Premix Ex Taq Ⅱ (TaKaRa)試劑盒操作說(shuō)明，運(yùn)用CFX96 PCR儀(Bio-rad)開(kāi)展實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)。以各采樣時(shí)間點(diǎn)時(shí)各處理組和對(duì)照組的6個(gè)樣品cDNA為模板，每個(gè)樣品重復(fù)3次，并設(shè)置陰性對(duì)照。PCR反應(yīng)體系為SYBR?Premix Ex Taq Ⅱ 12.5 μL，cDNA模板2 μL，上下游引物(10 μmol·L-1)各1 μL，雙蒸水8.5 μL。反應(yīng)程序?yàn)轭A(yù)變性：95 ℃、30 s；40個(gè)循環(huán)：95 ℃、5 s，55 ℃、30 s；熔解曲線(xiàn)：95 ℃、10 s，65 ℃、5 s，95 ℃、0.5 s。反應(yīng)結(jié)束后，查看PCR的擴(kuò)增曲線(xiàn)和熔解曲線(xiàn)判斷PCR反應(yīng)的特異性。

采用2-△△CT法[26]計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量，△△CT=(CT目的基因-CT參考基因)TCS處理組-(CT目的基因-CT參考基因)對(duì)照組，結(jié)果采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差(Mean±SEM)表示，用SPSS 17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(One-Way ANOVA)，采用Tukey B檢驗(yàn)法開(kāi)展多重比較分析，不同濃度暴露組與空白對(duì)照組之間開(kāi)展配對(duì)t檢驗(yàn)。以P<0.05、P<0.01表示差異顯著。

2 結(jié)果(Results)

2.1 食蚊魚(yú)P-gp基因序列擴(kuò)增與分析

本研究克隆得到了食蚊魚(yú)P-gpcDNA序列，GenBank登錄號(hào)為MN628568。該基因的cDNA序列長(zhǎng)5 452 bp，包含87 bp 5’UTR、3 885 bp ORF和1 480 bp 3’UTR，其中包含31個(gè)堿基的poly(A)尾巴。編碼1 294個(gè)氨基酸，其中，疏水性氨基酸502個(gè)(38.79%)，極性氨基酸314個(gè)(24.27%)，堿性氨基酸141個(gè)(10.90%)，酸性氨基酸143個(gè)(11.05%)。該蛋白分子式為C6387H10145N1693O1885S48，分子量約為142.35 kDa，理論等電點(diǎn)(pI)為6.85。在哺乳類(lèi)紅細(xì)胞中表達(dá)的半衰期為30 h，在酵母和大腸桿菌體內(nèi)表達(dá)的半衰期分別為>20 h和>10 h，脂溶系數(shù)(aliphatic index)為92.87，親水指數(shù)(GRAVY)為-0.012，不穩(wěn)定系數(shù)為36.65，說(shuō)明該蛋白在溶液中性質(zhì)穩(wěn)定。

SignalP 5.0信號(hào)肽分析顯示，食蚊魚(yú)P-gp蛋白沒(méi)有信號(hào)肽酶切位點(diǎn)，是一種非分泌蛋白。食蚊魚(yú)P-gp跨膜性質(zhì)的預(yù)測(cè)結(jié)果表明，存在由內(nèi)向外和由外向內(nèi)的12個(gè)跨膜螺旋(表2)，具有典型的跨膜結(jié)構(gòu)。保守結(jié)構(gòu)功能域與基序分析顯示，該基因編碼蛋白具有ABC轉(zhuǎn)運(yùn)家族的典型功能區(qū)域和位點(diǎn)，包含2個(gè)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)膜區(qū)(transmembrane domains, TMD)和2個(gè)ATP結(jié)合區(qū)(ATP-binding cassette, ABC) (圖1)，具有ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體家族標(biāo)記序列、Walker A (P環(huán))、Walker B、ATP結(jié)合位點(diǎn)、D環(huán)、H環(huán)和Q環(huán)等保守序列，屬于A(yíng)BC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族成員，具有膜轉(zhuǎn)運(yùn)糖蛋白的典型特征。

圖1 PROSITE軟件預(yù)測(cè)的食蚊魚(yú)P-gp蛋白結(jié)構(gòu)域注：灰色ABC_TM1F表示ABC轉(zhuǎn)運(yùn)膜區(qū)，橙色ABC_TRANSPORTER_2表示ATP結(jié)合區(qū)。Fig. 1 The conserved domains prediction of P-gp coding protein from G. affinis using PROSITENote: ABC_TM1F indicates ABC transporter integral membrane type-1 fused domain profile; ABC_TRANSPORTER_2 indicates ATP-binding cassette, namely ABC transporter-type domain profile.

二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，食蚊魚(yú)P-gp的氨基酸序列包含647個(gè)α螺旋(50%)、228個(gè)延伸主鏈(17.62%)、337個(gè)無(wú)規(guī)則卷曲(26.04%)和82個(gè)β轉(zhuǎn)角(6.34%)。蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)主要由α螺旋、無(wú)規(guī)則卷曲、延伸主鏈和β轉(zhuǎn)角構(gòu)成(圖2)，與二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果一致。三級(jí)結(jié)構(gòu)顯示該蛋白有2個(gè)跨膜區(qū)和2個(gè)核苷酸結(jié)合區(qū)，每個(gè)跨膜區(qū)由6個(gè)α螺旋組成。

表2 食蚊魚(yú)P-糖蛋白(P-gp)跨膜區(qū)位置預(yù)測(cè)結(jié)果Table 2 The prediction of transmembrane domain sites in G. affinis P-glycoprotein (P-gp)

圖2 食蚊魚(yú)P-gp蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig. 2 The third structure prediction of P-gp coding protein from G. affinis

2.2 食蚊魚(yú)P-gp氨基酸序列的同源性分析

運(yùn)用BLAST軟件對(duì)食蚊魚(yú)P-gp氨基酸序列的同源性分析表明，食蚊魚(yú)P-gp氨基酸序列與同屬鳉形目的花斑劍尾魚(yú)(Xiphophorusmaculatus)、光若花鳉(Poeciliopsislucida)和底鳉(Fundulusheteroclitus)等魚(yú)類(lèi)的P-gp (MDR1)氨基酸序列具有較高的同源性(圖3)，分別為96.3%、96.0%和91.2%，而與人類(lèi)(Homosapiens)和小鼠(Musmusculus)的同源性相對(duì)較低，分別為63.2%和62.9%。

圖3 食蚊魚(yú)與其他魚(yú)類(lèi)P-gp (MDR1)的氨基酸序列比對(duì)注：完全一致的氨基酸殘基用紅底白字表示，結(jié)構(gòu)保守性氨基酸殘基用紅字加藍(lán)色方框表示。Fig. 3 P-gp (MDR1) amino acid sequences of G. affinis and other fishesNote: White letters with red shading indicate that residues are identical and red leters with blue-rim box mean conserved residues.

系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的研究結(jié)果表明(圖4)，食蚊魚(yú)P-gp與劍尾魚(yú)、光若花鳉和底鳉的親緣關(guān)系較近，遺傳進(jìn)化分析聚為一支，與巨魾(Bagariusyarrelli)、南亞野鯪(Labeorohita)和白邊鋸鱗魚(yú)(Myripristismurdjan)等魚(yú)類(lèi)的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

圖4 食蚊魚(yú)與其他魚(yú)類(lèi)P-gp (MDR1)的NJ進(jìn)化樹(shù)分析Fig. 4 NJ phylogenetic tree of P-gp (MDR1) amino acid sequences from G. affinis and other fishes

2.3 TCS暴露對(duì)食蚊魚(yú)P-gp基因mRNA表達(dá)的影響

不同濃度TCS暴露9 d后，食蚊魚(yú)內(nèi)臟團(tuán)中P-gp的表達(dá)變化如圖5所示。50g·L-1TCS暴露3 d后食蚊魚(yú)P-gp表達(dá)量最高(P<0.05)；100g·L-1TCS暴露組中，P-gp在1 d(P<0.01)和3 d(P<0.05)表達(dá)量較高，出現(xiàn)峰值，隨后減弱，呈現(xiàn)下降趨勢(shì)(P<0.05)；150g·L-1TCS暴露9 d，P-gp在不同時(shí)間段的表達(dá)差異不顯著(P>0.05)。配對(duì)t檢驗(yàn)結(jié)果顯示，TCS暴露1 d時(shí)，100g·L-1濃度組P-gp表達(dá)量與對(duì)照組差異顯著(P<0.05)；暴露5 d時(shí)，50g·L-1濃度組P-gp表達(dá)量與對(duì)照組差異顯著(P<0.05)。

圖5 三氯生(TCS)暴露對(duì)食蚊魚(yú)P-gp mRNA表達(dá)的影響注：*、**表示相同TCS濃度下不同暴露時(shí)間組間差異顯著性水平為P<0.05、P<0.01；?表示TCS暴露組與空白對(duì)照組之間差異顯著性水平為P<0.05。Fig. 5 The effects of triclosan (TCS) on the mRNA expression of P-gp in G. affinisNote: Asterisks indicate statistical significance among groups with different exposure time (*P<0.05, **P<0.01); ? indicates difference between TCS treatment against control by t-test (P<0.05).

3 討論(Discussion)

3.1 食蚊魚(yú)P-gp基因序列分析

本研究成功克隆了食蚊魚(yú)P-gp基因，對(duì)其編碼的氨基酸序列開(kāi)展了信號(hào)肽、跨膜性質(zhì)、保守功能區(qū)域與位點(diǎn)、蛋白質(zhì)一級(jí)、二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)分析，結(jié)合多序列比對(duì)、同源性比較與系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果，可以確定獲得的食蚊魚(yú)P-gp是ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族的P-糖蛋白基因。同源性分析顯示，食蚊魚(yú)P-gp與同屬鳉形目的其他魚(yú)類(lèi)氨基酸序列相似度較高，均達(dá)90%以上，且在系統(tǒng)進(jìn)化分析中也聚為一支，其進(jìn)化地位與傳統(tǒng)生物學(xué)分類(lèi)、系統(tǒng)演化基本吻合，說(shuō)明P-gp在進(jìn)化過(guò)程中具有較高的序列保守性和功能一致性，在不同物種的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中具有重要作用。

P-gp編碼的蛋白具有ABC家族的典型功能區(qū)域和保守作用位點(diǎn)，從N端到C端呈TMD-ABC-TMD-ABC排列，是典型的ABCB亞家族全轉(zhuǎn)運(yùn)子[6]。TMD是ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的跨膜通道，用于內(nèi)源、外源物質(zhì)的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，ABC區(qū)域主要起結(jié)合與水解ATP的功能，為物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)提供足夠的能量[4]，P-gp在這些結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上發(fā)揮運(yùn)輸、通道和和調(diào)節(jié)等功能。

3.2 TCS對(duì)P-gp基因mRNA表達(dá)的影響

多型異源物質(zhì)抗性系統(tǒng)(multixenobiotic resistance, MXR)和耐藥系統(tǒng)(multidrug resistance system, MDR)是水生生物體內(nèi)廣泛存在的對(duì)內(nèi)源和外源毒性物質(zhì)的重要細(xì)胞防御機(jī)制[10]。P-gp是與該機(jī)制密切相關(guān)的重要解毒蛋白之一，通過(guò)水解ATP或與ATP結(jié)合發(fā)揮外排泵作用，防止異源有害物質(zhì)與細(xì)胞內(nèi)的靶分子結(jié)合，降低異源物質(zhì)對(duì)細(xì)胞的傷害與毒性作用[27]。

TCS的辛醇水分配系數(shù)(logKow)為4.76[28]，能在魚(yú)體內(nèi)產(chǎn)生生物累積[29-30]，Escarrone等[13]比較了200g·L-1TCS暴露后孔雀魚(yú)不同組織中的TCS含量，結(jié)果表明，肝臟和性腺是TCS的重要生物累積部位。研究發(fā)現(xiàn)，P-gp在魚(yú)類(lèi)的肝臟、腸道、腎、性腺、心臟、腦和肌肉等多個(gè)組織中均有表達(dá)[6,31]，表現(xiàn)屏障功能，在環(huán)境毒性物質(zhì)對(duì)水生生物脅迫過(guò)程中發(fā)揮了重要的免疫作用。此外，藥物在魚(yú)類(lèi)的肝臟、腸道等組織中存在“首過(guò)效應(yīng)”，藥物通過(guò)這些器官時(shí)被部分分解或外排，使藥物進(jìn)入血液或其他靶器官的劑量減少[9]。

內(nèi)臟團(tuán)包含了魚(yú)體的肝臟、腸道、腎和性腺等組織，取樣快速方便，本實(shí)驗(yàn)以食蚊魚(yú)的內(nèi)臟團(tuán)為整體研究對(duì)象，對(duì)P-gp的表達(dá)情況開(kāi)展綜合評(píng)價(jià)，可以更快速地為T(mén)CS的環(huán)境監(jiān)測(cè)提供參考數(shù)據(jù)。結(jié)果表明，100g·L-1TCS暴露明顯促進(jìn)食蚊魚(yú)P-gp的表達(dá)，表達(dá)高峰在暴露1 d后，隨著時(shí)間的推移其促進(jìn)作用呈減弱趨勢(shì)；50g·L-1TCS暴露對(duì)P-gp表達(dá)的促進(jìn)高峰時(shí)間延遲至3 d，而150g·L-1濃度組P-gp表達(dá)變化不顯著，說(shuō)明TCS對(duì)P-gpmRNA表達(dá)的影響具有一定的時(shí)間-劑量效應(yīng)，其變化趨勢(shì)可能與食蚊魚(yú)體內(nèi)外源TCS有效劑量的變化與累積有關(guān)。

環(huán)境污染物對(duì)水生生物P-gp表達(dá)變化的影響因素較多，包括不同的暴露時(shí)間和濃度、不同的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物或不同的組織器官、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物所處的不同生長(zhǎng)發(fā)育階段或生理時(shí)期、個(gè)體差異、不同實(shí)驗(yàn)環(huán)境與實(shí)驗(yàn)方法、生物體內(nèi)其他解毒代謝機(jī)制等。例如，TCS暴露對(duì)雌性和雄性劍尾魚(yú)肝臟組織中P-gp的表達(dá)分別呈現(xiàn)抑制和誘導(dǎo)效應(yīng)[35]。此外，也有研究認(rèn)為P-gp的表達(dá)調(diào)控可能在翻譯水平而不是轉(zhuǎn)錄水平[27]，污染物暴露后P-gp在基因水平和蛋白質(zhì)水平具有不同的表達(dá)模式[36]。因此，TCS對(duì)P-gpmRNA表達(dá)的影響機(jī)制還需進(jìn)一步探究。

◆