低溫溶劑結(jié)晶法富集鴉膽子油不飽和脂肪酸乙酯

杜彥鵬，李進(jìn)偉，劉元法

(江南大學(xué) 食品學(xué)院，食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122)

鴉膽子為苦木科鴉膽子屬植物，是一種傳統(tǒng)的中藥，被用于治療瘧疾、痢疾、炎癥以及多種癌癥，多產(chǎn)于我國南方沿海的熱帶和亞熱帶地區(qū)[1-2]。

鴉膽子油是鴉膽子的干燥成熟果實(shí)經(jīng)石油醚萃取后得到的[3]。研究顯示，鴉膽子油具有抗癌活性，已廣泛用于肺癌、食管癌、肝癌、膀胱癌、胃癌、卵巢癌、前列腺癌等的治療中[4-6]。鴉膽子油的主要成分為不飽和脂肪酸，其中以油酸、亞油酸為主，含量約為86%，除此之外還含有約13%的飽和脂肪酸以及少量三萜類化合物[1,7]。

碘化油是肝癌治療手段肝動(dòng)脈栓塞化療術(shù)(TACE)中常用的栓塞劑，由碘加成不飽和脂肪酸乙酯而得，常用原料為罌粟籽油和核桃油等[8-9]。但傳統(tǒng)的碘化油并沒有抗癌活性，因此將鴉膽子油乙酯碘化制備具有抗癌活性的碘化油具有重要意義[10]。由于鴉膽子油乙酯直接碘化所制的碘化油碘含量低并且質(zhì)量不穩(wěn)定，為了提高碘化鴉膽子油的碘含量以及質(zhì)量穩(wěn)定性，需要將鴉膽子油乙酯中的飽和脂肪酸乙酯去除。

目前，國內(nèi)針對(duì)脂肪酸的分離與富集研究較多，而對(duì)于脂肪酸乙酯的分離、富集研究卻相對(duì)較少，且主要研究對(duì)象為魚油[11-12]，對(duì)于鴉膽子油脂肪酸乙酯的分離未見報(bào)道。本文利用在低溫條件下，飽和脂肪酸乙酯和不飽和脂肪酸乙酯在某些有機(jī)溶劑中的溶解度差異，去除鴉膽子油脂肪酸乙酯中的飽和脂肪酸乙酯，富集其不飽和脂肪酸乙酯，主要考察溶劑種類、結(jié)晶溫度、結(jié)晶時(shí)間、溶劑與脂肪酸乙酯體積比以及結(jié)晶次數(shù)等因素對(duì)低溫溶劑結(jié)晶過程中脂肪酸乙酯分離效果的影響，以期為不飽和脂肪酸乙酯的富集和分離提供一條新途徑。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 原料與試劑

鴉膽子購買于亳州中藥材市場(chǎng)，采用石油醚(60～90℃)浸提法從鴉膽子中提取得到鴉膽子油。乙醇、石油醚、甲醇鈉、異丙醇、丙酮均為分析純，由國藥試劑公司提供。

1.1.2 儀器與設(shè)備

RE-3000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；GA-5000A低噪聲空氣泵，北京中興匯利科技發(fā)展有限公司；RW20DS025攪拌器，上海翼悾機(jī)電有限公司；HH-02恒溫水浴鍋，金壇市精達(dá)儀器廠；XW80-A旋渦混勻器，江蘇秉宏生物科技有限公司；ME204E電子天平，梅特勒-托利多儀器有限公司；GC-2030Plus氣相色譜儀，日本島津公司；低溫反應(yīng)釜，德國LAUDA。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 鴉膽子油理化性質(zhì)及脂肪酸組成的測(cè)定

過氧化值的測(cè)定參考GB 5009.227—2016 《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中過氧化值的測(cè)定》；酸價(jià)的測(cè)定參考GB 5009.229—2016 《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中酸價(jià)的測(cè)定》；碘值的測(cè)定參考GB/T 5532—2008 《動(dòng)植物油脂 碘值的測(cè)定》；水分及揮發(fā)物含量的測(cè)定參考GB 5009.3—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中水分的測(cè)定》；相對(duì)密度的測(cè)定參考GB 5009.2—2016 《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品相對(duì)密度的測(cè)定》；脂肪酸組成的測(cè)定參考GB 5009.168—2016 《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中脂肪酸的測(cè)定》。

1.2.2 脂肪酸乙酯的制備[7]

稱取100 g鴉膽子油于夾層反應(yīng)器中，預(yù)熱至75℃，添加40 mL 無水乙醇和0.6 g甲醇鈉，75℃恒溫反應(yīng)2 h，將反應(yīng)液轉(zhuǎn)移至分液漏斗，充分靜置分層，取上層液體減壓蒸餾回收沒有反應(yīng)的無水乙醇，并用蒸餾水洗至中性并干燥，得到鴉膽子油脂肪酸乙酯。

1.2.3 低溫溶劑結(jié)晶法富集不飽和脂肪酸乙酯

將鴉膽子油脂肪酸乙酯與相應(yīng)溶劑按照一定比例混合均勻，轉(zhuǎn)移至低溫反應(yīng)釜中，低溫結(jié)晶一定時(shí)間后，于低溫下快速抽濾，取濾液于65℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，得富集后鴉膽子油脂肪酸乙酯。按下式計(jì)算不飽和脂肪酸乙酯得率。

(1)

式中：X為不飽和脂肪酸乙酯得率；m1為產(chǎn)品質(zhì)量，g；ω1為產(chǎn)品中不飽和脂肪酸乙酯含量，%；m0為鴉膽子油脂肪酸乙酯質(zhì)量，g；ω0為鴉膽子油脂肪酸乙酯中不飽和脂肪酸乙酯含量，%。

1.2.4 脂肪酸乙酯組成分析

參照文獻(xiàn)[13]采用氣相色譜法測(cè)定鴉膽子油脂肪酸乙酯組成。

氣相色譜分析條件：島津GC -2030Plus氣相色譜儀；FID檢測(cè)器；TR-FAME毛細(xì)管色譜柱(60 m × 0.25 mm × 0.25 μm)；進(jìn)樣口溫度250℃；檢測(cè)器溫度260℃；升溫程序?yàn)槌跏紲囟?80℃，保持2 min，以3℃/min速率升溫至220℃，保持15 min；進(jìn)樣量1 μL；分流比20∶1。根據(jù)各脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間與鴉膽子油脂肪酸乙酯樣品比較，確定各脂肪酸乙酯的組成，并根據(jù)峰面積歸一化法計(jì)算各脂肪酸乙酯的相對(duì)含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 鴉膽子油的基本性質(zhì)(見表1、表2)

鴉膽子油的酸價(jià)、碘值、過氧化值、相對(duì)密度、水分及揮發(fā)物含量如表1所示。鴉膽子油脂肪酸組成及含量見表2。

表1 鴉膽子油的基本性質(zhì)

由表1可知，鴉膽子油酸價(jià)(KOH)、碘值(I)、過氧化值分別為0.96 mg/g、97.32 g/100 g和1.59 g/100 g。由表2可知，鴉膽子油脂肪酸主要由棕櫚酸、硬脂酸、油酸和亞油酸組成，含量分別為7.22%、5.65%、66.16%和18.19%，不飽和脂肪酸含量為86.3%。

表2 鴉膽子油脂肪酸組成及含量

2.2 鴉膽子油脂肪酸乙酯組成(見表3)

表3 鴉膽子油脂肪酸乙酯組成及含量

參考仲晗實(shí)等[7]的方法，采用堿法催化進(jìn)行乙酯化，經(jīng)測(cè)定鴉膽子油脂肪酸乙酯得率為91.78%。由表3可知，鴉膽子油脂肪酸乙酯中飽和脂肪酸乙酯主要為棕櫚酸乙酯和硬脂酸乙酯，含量分別為7.32%、5.68%，不飽和脂肪酸乙酯主要為油酸乙酯和亞油酸乙酯，含量分別為66.52%、18.08%。飽和脂肪酸乙酯含量為13.18%，不飽和脂肪酸乙酯含量為86.49%。

2.3 低溫溶劑結(jié)晶法富集鴉膽子油不飽和脂肪酸乙酯工藝條件優(yōu)化

2.3.1 溶劑種類對(duì)分離效果的影響

在溶劑與鴉膽子油脂肪酸乙酯體積比3∶1、結(jié)晶溫度-20℃、結(jié)晶時(shí)間6 d、結(jié)晶次數(shù)1次條件下，考察溶劑種類對(duì)分離效果的影響，結(jié)果如圖1所示。

由圖1可知，不同溶劑種類對(duì)脂肪酸乙酯分離效果的影響較大，石油醚分離效果最差，乙醇分離效果最好，這由飽和、不飽和脂肪酸乙酯于低溫條件下，在不同溶劑中的溶解度差異導(dǎo)致[14]，不飽和脂肪酸乙酯的極性相對(duì)大于飽和脂肪酸乙酯的極性，因此適度增加溶劑的極性，將有利于提高分離效果。雖然以乙醇為溶劑時(shí)，不飽和脂肪酸乙酯的得率較其他溶劑稍低，但其不飽和脂肪酸乙酯含量較高，超過92%，并且乙醇毒性較低，價(jià)格低廉，所以綜合考慮，選取乙醇為溶劑。

圖1 溶劑種類對(duì)分離效果的影響

2.3.2 結(jié)晶溫度對(duì)分離效果的影響

以乙醇為溶劑，在溶劑與鴉膽子油脂肪酸乙酯體積比3∶1、結(jié)晶時(shí)間6 d、結(jié)晶次數(shù)1次條件下，考察結(jié)晶溫度對(duì)分離效果的影響，結(jié)果如圖2所示。

圖2 結(jié)晶溫度對(duì)分離效果的影響

由圖2可知，隨著結(jié)晶溫度的降低，鴉膽子油不飽和脂肪酸乙酯的含量逐漸增高隨后降低，在-20℃ 時(shí)為最高值。盡管得率持續(xù)下降，但是結(jié)晶溫度的降低有利于飽和脂肪酸乙酯的結(jié)晶沉淀，然而如果結(jié)晶溫度太低，則在體系中傾向于產(chǎn)生更多細(xì)小晶核，形成細(xì)軟、不穩(wěn)定的晶體，導(dǎo)致體系變成黏稠狀，致使分子難以移動(dòng)，不利于晶體的成長(zhǎng)，影響結(jié)晶度，并且大量細(xì)小晶體的存在會(huì)使過濾效果變差，導(dǎo)致得率的降低。因此，選取-20℃作為結(jié)晶溫度。

2.3.3 結(jié)晶時(shí)間對(duì)分離效果的影響

以乙醇為溶劑，在溶劑與鴉膽子油脂肪酸乙酯體積比3∶1、結(jié)晶溫度-20℃、結(jié)晶次數(shù)1次條件下，考察結(jié)晶時(shí)間對(duì)分離效果的影響，結(jié)果如圖3所示。

圖3 結(jié)晶時(shí)間對(duì)分離效果的影響

由圖3可知，隨著結(jié)晶時(shí)間的延長(zhǎng)，不飽和脂肪酸乙酯含量逐漸增加，并在7 d之后趨于穩(wěn)定，為93%以上，而得率先降低后增加，這是由于結(jié)晶時(shí)間不足時(shí)，體系中存在較多的細(xì)小晶體，其還未來得及形成較大穩(wěn)定晶體，在抽濾過程中，細(xì)小晶體可能再次融化，導(dǎo)致不飽和脂肪酸含量的降低，除此之外，細(xì)小晶體的存在還會(huì)導(dǎo)致體系黏度的增加，影響過濾效果，致使得率下降。當(dāng)結(jié)晶時(shí)間達(dá)到7 d以上時(shí)，不飽和脂肪酸乙酯含量和得率都趨于穩(wěn)定，所以選取結(jié)晶時(shí)間為7 d。

2.3.4 溶劑與脂肪酸乙酯體積比對(duì)分離效果的影響

以乙醇為溶劑，在結(jié)晶溫度-20℃、結(jié)晶時(shí)間7 d、結(jié)晶次數(shù)1次條件下，考察溶劑與脂肪酸乙酯體積比對(duì)分離效果的影響，結(jié)果如圖4所示。

圖4 溶劑與脂肪酸乙酯體積比對(duì)分離效果的影響

由圖4可知，不飽和脂肪酸乙酯含量隨著溶劑與脂肪酸乙酯體積比的降低先增加后降低，當(dāng)溶劑與脂肪酸乙酯體積比為3∶1時(shí)，不飽和脂肪酸乙酯含量最高，為93.2%，而不飽和脂肪酸乙酯得率先緩慢降低，然后迅速降低。當(dāng)溶劑用量較多時(shí)，盡管有利于分離，但會(huì)增加飽和脂肪酸乙酯的溶解，導(dǎo)致體系中飽和脂肪酸乙酯的殘留增加，從而降低產(chǎn)品中不飽和脂肪酸乙酯含量，而當(dāng)溶劑用量較少時(shí)，又會(huì)增加體系的黏度，造成分離困難，影響結(jié)晶效果和產(chǎn)品得率。因此，綜合考慮，選取溶劑與脂肪酸乙酯體積比3∶1為宜。

2.3.5 結(jié)晶次數(shù)對(duì)分離效果的影響

以乙醇為溶劑，在溶劑與鴉膽子油脂肪酸乙酯體積比3∶1、結(jié)晶溫度-20℃、結(jié)晶時(shí)間7 d條件下，考察結(jié)晶次數(shù)對(duì)分離效果的影響，結(jié)果如圖5所示。

圖5 結(jié)晶次數(shù)對(duì)分離效果的影響

由圖5可知，增加結(jié)晶次數(shù)有利于不飽和脂肪酸乙酯的富集，結(jié)晶2次時(shí)，不飽和脂肪酸乙酯含量可達(dá)95%左右，但再增加結(jié)晶次數(shù)，不飽和脂肪酸乙酯含量基本不會(huì)產(chǎn)生太大變化，反而會(huì)降低不飽和脂肪酸乙酯的得率，還會(huì)導(dǎo)致成本的增加。因此，適宜的結(jié)晶次數(shù)為2次。

2.3.6 驗(yàn)證試驗(yàn)

綜合上述結(jié)果，即以乙醇為溶劑，在溶劑與鴉膽子油脂肪酸乙酯體積比3∶1、結(jié)晶溫度-20℃、結(jié)晶時(shí)間7 d、結(jié)晶2次的條件下，對(duì)鴉膽子油不飽和脂肪酸乙酯進(jìn)行富集，產(chǎn)品中脂肪酸乙酯組成及含量見表4。

表4 產(chǎn)品中脂肪酸乙酯組成及含量

對(duì)比表3、表4可知，采用低溫溶劑法富集后，鴉膽子油脂肪酸乙酯中飽和脂肪酸乙酯含量由13.18%降至4.30%，不飽和脂肪酸乙酯含量由86.49%升至95.32%。其中，主要飽和脂肪酸乙酯棕櫚酸乙酯和硬脂酸乙酯含量分別由7.32%、5.68%降至3.46%、0.73%，主要不飽和脂肪酸乙酯油酸乙酯和亞油酸乙酯含量分別由66.52%、18.08%升至74.27%、20.13%。經(jīng)計(jì)算，富集后鴉膽子油脂肪酸乙酯得率為85.4%，符合預(yù)期水平。

3 結(jié) 論

本研究采用低溫溶劑結(jié)晶法對(duì)鴉膽子油脂肪酸乙酯中的不飽和脂肪酸乙酯進(jìn)行富集，得到低溫溶劑結(jié)晶法富集鴉膽子油不飽和脂肪酸乙酯的最佳條件為：以乙醇為溶劑，溶劑與鴉膽子油脂肪酸乙酯體積比3∶1，結(jié)晶溫度-20℃，結(jié)晶時(shí)間7 d，結(jié)晶次數(shù)2次。在最佳條件下，鴉膽子油脂肪酸乙酯中不飽和脂肪酸乙酯含量由86.49%升高至95.32%，得率為85.4%。采用低溫溶劑結(jié)晶法富集不飽和脂肪酸乙酯是一種行之有效的方法。本研究可為不飽和脂肪酸乙酯的富集和分離提供一定的理論基礎(chǔ)，也為其工業(yè)化生產(chǎn)提供了可能。