辣椒素體外釋放特性考察及劑型制備*

游國(guó)葉

(信陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院藥學(xué)院藥學(xué)實(shí)訓(xùn)中心，河南 信陽 464000)

辣椒是植物辣椒的干燥成熟果實(shí)，藥典記載其具有溫中散寒、開胃消食作用[1]。其提取物主要成分是辣椒素(capsaicin，CAP)，CAP亦稱辣椒堿，無色無味，微溶于二硫化碳[2]，能溶于乙醇、乙醚、苯及氯仿，水中溶解度差。在止癢鎮(zhèn)痛、減肥調(diào)脂、抗癌、抗炎抗疲勞、降血壓、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌系統(tǒng)及消化系統(tǒng)等方面都有應(yīng)用[2-4]。依據(jù)生物藥劑學(xué)分類系統(tǒng)CAP屬于Ⅳ類[5]，難溶于水，刺激性大，生物利用度低，限制了CAP的醫(yī)藥用途。固體分散體(solid dispersion，SD)是近幾年來研究較為熱門的一種新劑型。因SD中藥物粒子粒徑減小，表面自由能顯著增加，是改善難溶性藥物生物利用度最有效措施之一，目前已廣泛用于增加難溶性藥物的溶解度和溶出速率。SD可以是最終產(chǎn)品，也可以作為劑型中間體，如將齊拉西酮、頭孢地尼等難溶性藥物制備成SD均顯著提高了藥物的溶出度[6-8]，這對(duì)于本研究的CAP的產(chǎn)品化和后開發(fā)具有重要意義。

本研究采用固體分散技術(shù)，以表面活性劑類泊洛沙姆188(P188)及水溶性載體材料聚乙二醇(PEG)為載體，制備辣椒素固體分散體(CAP-SD)。通過體外釋放度考察不同制備方法、不同的載體用量、不同載藥量及制備時(shí)攪拌混合時(shí)間對(duì)藥物釋放的影響，最后通過差式掃描量熱法(DSC)探究CAP在SD中的分布形態(tài)。通過文獻(xiàn)查閱，目前尚無有關(guān)CAP-SD的報(bào)道。據(jù)文獻(xiàn)[5]報(bào)道，CAP對(duì)胃有刺激，故課題組以CAP-SD為中間體，后續(xù)將其制備成腸溶型膠囊，報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 分析天平(TG328A，上海精科儀器有限公司)、智能溶出儀(RC-6，上海巴玖實(shí)業(yè)有限公司)；高效液相色譜儀(LC-10AT，日本島津)、紫外檢測(cè)器(SPD-10AVP，日本島津)、色譜工作站(CBM-102，日本島津)；色譜柱(4.6 mm×250.0 mm，5.0 μm)(kromasil-C18，日本島)、數(shù)控型超聲波清洗器(昆山超聲波儀器有限公司，KQ5200DB)、電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(DHG-9140A，上海滬粵明科學(xué)儀器有限公司)、DSC 分析儀(diamond DSC，美國(guó) Perkin-Elmer 公司)；真空干燥箱(DZF-6210，上海滬粵明科學(xué)儀器有限公司)；磁力攪拌器(DJ-1，江蘇省金壇市佳美儀器有限公司)。

1.2 試藥 CAP(天津圣惠生物科技有限公司，20160928-015)；天然CAP(中國(guó)藥品生物制品檢定所，100829-201605)，PEG4000和P188(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：HTF20160112-006、20160203011)、CAP-SD(信陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)室自制，批號(hào)：20170525，CAP含量：36.82%)，甲醇為山東禹王色譜純，其余試劑為分析純。

2 方法和結(jié)果

2.1 分析方法的建立

2.1.1 溶液配制 對(duì)照品溶液的制備：精密稱取CAP對(duì)照品(天然CAP) 50 mg，置100 mL 量瓶中，加入無水乙醇超聲溶解，定容、搖勻，準(zhǔn)確量取1 mL置10 mL量瓶中，加流動(dòng)相定容、搖勻，稀釋成50 mg·L-1對(duì)照品溶液。

供試品溶液的制備：取CAP-SD粉末，精密稱取適量(約相當(dāng)于CAP 50 mg)，置100 mL 量瓶中，加入無水乙醇超聲溶解，定容，搖勻，準(zhǔn)確量取1 mL置10 mL 量瓶中，加流動(dòng)相定容、搖勻，稀釋成50 mg·L-1供試品溶液。

陰性對(duì)照溶液 另按處方量制備不含藥的空白混合物適量，流動(dòng)相定容，得相當(dāng)于含50 mg·L-1的陰性對(duì)照液。

2.1.2 確定檢測(cè)波長(zhǎng)及色譜條件 依據(jù)課題組前期研究成果[9]及相關(guān)文獻(xiàn)[10]報(bào)道，CAP在280 nm處有最大吸收且空白溶劑甲醇和輔料在此處均無干擾，故選擇 280 nm為測(cè)定波長(zhǎng)。

色譜條件為：色譜柱:Kromasil-C18 (4.6 mm×250.0 mm，5.0 μm)；流動(dòng)相:甲醇-水(80∶20);檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm；柱溫30 ℃，流速:1 mL·min-1；進(jìn)樣量：20 μL；理論板數(shù)(按CAP對(duì)照品峰計(jì)算)應(yīng)不低于3 000，與相臨鄰色譜峰的分離度均>1.5。

結(jié)果顯示，其他成分及溶劑對(duì)CAP測(cè)定無干擾，且峰形較好，無前沿、拖尾現(xiàn)象，保留時(shí)間6.5 min。UV掃描圖譜及高效液相色譜法(HPLC)圖譜見圖1-2。

注：A.CAP對(duì)照品UV圖譜；B.空白輔料UV圖譜

注：A.對(duì)照品 HPLC圖譜；B.供試品HPLC圖譜；C.陰性對(duì)照品HPLC圖譜

2.1.3 線性關(guān)系考察 精密稱取CAP對(duì)照品約50 mg，置100 mL量瓶中，加入無水乙醇超聲溶解，定容，制成 500 mg·L-1CAP對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密量取該溶液 0.2、1.0、2.0、3.0、5.0、7.0、9.0 mL置 10 mL量瓶中，加溶劑定容，按2.1.1色譜條件測(cè)定，每個(gè)濃度進(jìn)樣3次，記錄吸收峰面積A及藥物濃度為C，以 A對(duì)C線性回歸，得出標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為 A=2 903.9 C+91 279，r=0.999 3，線性范圍10～450 mg·L-1。以信噪比S:N≥3及S:N≥10確定實(shí)驗(yàn)最低檢出限、定量限依次為0.02 mg·L-1、0.1 mg·L-1。標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖3。

圖3 標(biāo)準(zhǔn)曲線(n=3)

2.1.4 精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性及加樣回收率測(cè)定 精密度實(shí)驗(yàn)：精密量取CAP對(duì)照品儲(chǔ)備液適量配制濃度分別為50、150、350 mg·L-1的CAP溶液3份，按“2.1.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，每份樣品每隔4 h測(cè)定1次，共測(cè)6次；每份樣品每日測(cè)1次，連續(xù)測(cè)定6 d,分別計(jì)算日內(nèi)及日間精密度。精密度試驗(yàn)結(jié)果可知,日內(nèi)及日間精密度RSD分別為0.98%(n=6)和1.02%(n=6)，表明儀器精密性良好。

重復(fù)性實(shí)驗(yàn):取本品(批號(hào)：20170525)的樣品6份，按照“2.1.1”項(xiàng)下供試品溶液的方法制備，依照“2.1.2”項(xiàng)下色譜條件分析，測(cè)定每份樣品溶液中CAP含量。結(jié)果顯示樣品中CAP濃度平均為49.96 mg·L-1，RSD為0.79%(n=6)，表明重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)：取重復(fù)性試驗(yàn)中的1份樣品,分別在0、3、6、9、12、18、24 h按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件分析，測(cè)得供試品溶液中CAP濃度，RSD為0.99%(n=6)。結(jié)果表明，供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn)：稱取已知含量的樣品(批號(hào)：20170525)內(nèi)容物適量，分別加入低、中、高(50、150、350 mg·L-1)對(duì)照品溶液，各3份，按含量測(cè)定方法進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算加樣回收率?；厥章蕦?shí)驗(yàn)中低、中、高對(duì)照品濃度依次進(jìn)樣，RSD分別為0.7%、0.8%、0.4%(n=3),均小于2.0%，準(zhǔn)確度良好。見表1。

表1 回收率試驗(yàn)

2.1.5 含量測(cè)定 精密稱取CAP-SD(批號(hào)：20170525)適量(約相當(dāng)于CAP 50 mg)，加入無水乙醇超聲溶解，以流動(dòng)相定容至刻度，搖勻、過濾，按照“2.1.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，代入回歸方程計(jì)算含量。

2.1.6 體外溶出度測(cè)定 按照 2015版《中國(guó)藥典》四部[11]0931溶出度及釋放度測(cè)定法第二法(槳法)測(cè)定，設(shè)定轉(zhuǎn)速 (50±1)r·min-1、水浴溫度(37.0±0.5)℃，溶出介質(zhì)為脫氣處理過的質(zhì)量濃度3%十二烷基硫酸鈉(SLS-Na)純水900 mL。稱取CAP和含等量CAP的CAP-SD約500 mg，置于溶出杯中，自藥物接觸溶出介質(zhì)開始計(jì)時(shí)，于 5、15、30、45、60、120、180、240、300、480 min 取樣5 mL，并及時(shí)補(bǔ)加 5 mL 等溫釋放介質(zhì)，0.45 μm微孔濾膜過濾，吸取續(xù)濾液，置于10 mL容量瓶中，按“2.1.2”項(xiàng)下方法測(cè)定，計(jì)算藥物累積釋放度，繪制溶出曲線。

2.2 固體分散體制備 CAP提?。喝AP含量為7.06 % mg·mL-1的CAP適量，加乙醇20 mL超聲30 min，過濾，濾液收集備用，濾渣中加甲醇20 mL繼續(xù)超聲，30 min后過濾，濾液收集，重復(fù)上步操作1次，合并3次的濾液，置70 ℃恒溫干燥箱內(nèi)濃縮，濃縮物備用。

溶劑法：分別稱取處方量CAP濃縮物及輔料(P188，PEG 4000)，加適量無水乙醇于磁力攪拌器上充分?jǐn)嚢柚寥芙猓?0 ℃真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機(jī)溶劑，置冰箱中迅速冷卻固化30 min，40 ℃真空干燥24 h，研磨粉碎過60目篩得CAP-SD。

熔融法：稱取處方比例的CAP濃縮物及輔料(P188，PEG4000)，先將PEG4000和P188在65 ℃水浴不斷攪拌至完全熔化，加入CAP提取物攪拌至完全混合，再迅速轉(zhuǎn)移至冰浴中冷卻至完全固化，然后放置于真空干燥箱中干燥24 h，取出,研磨，過60目篩得CAP-SD。

2.3 藥物及載體材料物理混合物制備 稱取處方量CAP濃縮物及輔料，3次過篩混合均勻，即得物理混合物。

2.4 單因素考察

2.4.1 制備方法考察 實(shí)驗(yàn)中分別采用溶劑法、熔融法制備1∶1藥-載SD，并以CAP原料藥和相應(yīng)比例的藥-載物理混合物的溶出度作為對(duì)照，測(cè)定其體外溶出度。結(jié)果表明，兩種方法制備的SD的溶出度均高于原料藥及物理混合物，120 min左右CAP累計(jì)溶出度均為80%。實(shí)驗(yàn)表明，兩種方法均可以制備SD且體外釋放度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但由于溶劑法制備的SD黏性較大，后續(xù)制備腸溶膠囊時(shí)不利于膠囊殼的穩(wěn)定，且制備過程中使用大量的有機(jī)溶劑，釋放度重現(xiàn)性不及熔融法，故最終選擇熔融法制備SD。4種樣品的體外溶出度測(cè)定結(jié)果見圖4。

2.4.2 載體種類考察 實(shí)驗(yàn)過程中，課題組分別考察了零載體(即物理混合物)、單一載體(P188或PEG4000)、兩聯(lián)載體(P188-PEG4000)對(duì)藥物釋放的影響，采用熔融法制備SD并進(jìn)行釋放度考察。考察發(fā)現(xiàn)，純藥物和輔料的物理混合物體外釋放最為緩慢且釋放不完全，兩聯(lián)載體相較于單一載體對(duì)藥物的釋放有一定的促進(jìn)作用，且實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)兩載體聯(lián)用試驗(yàn)中，隨著載體P188用量增大，釋放度明顯增加。最終選擇P188-PEG4000為本制劑制備的聯(lián)用載體。具體釋放結(jié)果見圖5。

注：1.熔融法制備CAP-SD； 2.溶劑法制備CAP-SD；

注：1.CAP-P188-PEG4000(1∶1∶1);2.CAP-P188-PEG4000(1∶1∶0);3.CAP-P188-PEG4000(1∶0∶1);4.CAP-P188-PEG4000(1∶0∶0)

2.4.3 藥載比考察 精密稱取CAP濃縮物適量，采用熔融法制備，CAP∶P188∶PEG比例分別為1∶1∶1；1∶3∶1；1∶5∶1；1∶1∶3；1∶1∶5。結(jié)果顯示，隨著載體用量的增加，CAP的釋放度增加；且載體中P188用量增加時(shí)，釋放度亦顯著增加，可能原因是由于表面活性劑類的載體能更有效地增加藥物溶出度，同時(shí)抑制藥物重結(jié)晶，防止SD老化，本研究中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)CAP∶P188∶PEG比例為1∶5∶3時(shí)，SD中CAP的體外釋放度60 min可釋放80%以上。故最終選擇藥載比為1∶5∶3。藥載比考察結(jié)果見圖6。

注：1.CAP-P188-PEG4000(1∶5∶1);2.CAP-P188-PEG4000(1∶3∶1);3.CAP-P188-PEG4000(1∶1∶5);4.CAP-P188-PEG4000(1∶1∶3);5.CAP-P188-PEG4000(1∶1∶1)

2.4.4 攪拌時(shí)間的考察 固定載體種類及藥載比，分別考察10、20、30 min不同攪拌時(shí)間對(duì)藥物體外釋放度的影響。根據(jù)釋放結(jié)果可發(fā)現(xiàn)，隨著攪拌時(shí)間的延長(zhǎng)，體外釋放速度呈先快速減緩,故最終選擇攪拌時(shí)間為20 min。

2.5 DSC 分別取CAP原料藥、P188，PEG4000、物理混合物及CAP∶P188∶PEG(1∶5∶3)熔融法操作制備得到的CAP-SD進(jìn)行DSC分析。測(cè)試條件以空白鋁坩堝為參比物，N2為保護(hù)氣，溫度20～200 ℃，升溫速度10 ℃·min-1。見圖7。由圖可知，CAP原料中有1個(gè)熔融峰(約45.6 ℃)；載體材料PEG4000和P188各自有1個(gè)熔融峰且曲線起伏度大；物理混合物有 3個(gè)吸熱峰，依次為藥物峰和兩輔料峰，表明載體與CAP之間沒有發(fā)生相互作用，藥物仍以晶體狀態(tài)存在；SD有1個(gè)吸熱峰 (62.8 ℃)，CAP吸熱峰消失，該峰與原載體峰相比均前移，說明載體P188和PEG形成低共熔物或共沉淀物，即CAP以分子形式或者無定形狀態(tài)存在。

圖7 CAP、輔料、物理混合物及CAP-SD的DSC曲線

3 討論

CAP屬于脂溶性物質(zhì)，文獻(xiàn)[12]顯示其表觀溶解度為(22.85±0.06) mg·L-1，極微溶于水，制備過程中使用半極性物質(zhì)PEG4000，借助其較強(qiáng)的潤(rùn)濕性和分散性，使得極性較差的CAP潤(rùn)濕性能增強(qiáng)，即親水能力增加，與載體材料接觸面亦增大，在與溶出液接觸后可加快藥物溶出；P188是一種由聚氧乙烯(PEO)、聚氧丙烯(PPO)組成的 PEO-PPO-PEO 非離子型三嵌段共聚物，具有獨(dú)特的疏水內(nèi)核-親水外殼結(jié)構(gòu)，能與許多藥物形成孔隙固溶體，使CAP高度分散于P188中，進(jìn)一步使得藥物溶解度和溶出速率增加，生物利用度得以提高，并且PEG4000和P188都是親水性聚合物，彼此分子之間以及與藥物分子之間均可能會(huì)形成氫鍵，使得體系更加穩(wěn)定。通過多次試驗(yàn)篩選，以體外溶出度為考察指標(biāo)，以制備方法、載體種類、藥載比及制備時(shí)攪拌時(shí)間為考察單因素，最終將CAP與表面活性劑P188和親水性極好的PEG4000通過熔融法制備成SD。體外釋放結(jié)果顯示，60 min可溶出80%以上，為原料藥的13.3倍，結(jié)合DSC考察結(jié)果可看出藥物與載體間相容性良好，藥物及兩載體熔點(diǎn)接近且均較低，可快速熔融并迅速冷卻，工藝條件簡(jiǎn)便可控。可見采用固體分散技術(shù)不僅可以解決CAP溶解度低的缺陷，還可以將其制備成質(zhì)量穩(wěn)定可靠中間體，為該成分的進(jìn)一步劑型研究開發(fā)提供重要依據(jù)。

本研究采用熔融法，以P188和PEG4000制備得到的CAP-SD穩(wěn)定性良好，藥物以無定形或共融物狀態(tài)高度分散于載體中，增加了藥物溶出度，工藝條件簡(jiǎn)便可控，便于規(guī)?；a(chǎn)。