流式細(xì)胞術(shù)應(yīng)用及植物種質(zhì)資源倍性研究進(jìn)展

宋云連，張惠云，王躍全，高賢玉，左艷秀，羅心平

(云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 熱帶亞熱帶經(jīng)濟(jì)作物研究所，云南 保山 678000)

前言

植物種質(zhì)資源(Plant germplasm resourse)是指凡攜帶有不同種質(zhì)(基因)的各種栽培植物及其近緣種和野生種。它大多數(shù)存在于特定品種之中，如古老的地方品種、新培育的推廣品種、重要的遺傳材料以及野生近緣植物等。這些資源是經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的自然演變形成的，蘊(yùn)藏著豐富的潛在可利用基因，但在過(guò)去，人們對(duì)植物種質(zhì)資源無(wú)太多關(guān)注。因此，植物種質(zhì)資源的保護(hù)開(kāi)發(fā)利用與創(chuàng)新在遺傳育種中具有十分重要的作用，而其倍性的鑒定則是了解其遺傳背景和進(jìn)一步應(yīng)用的基礎(chǔ)，大量的研究表明，流式細(xì)胞術(shù)是目前可以高效快速準(zhǔn)確的鑒定植物種質(zhì)倍性的一種技術(shù)，是一種應(yīng)用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析、分選的方法[1,2]。目前，流式細(xì)胞儀應(yīng)用已涉及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，如：常規(guī)免疫表型血細(xì)胞監(jiān)測(cè)、白細(xì)胞計(jì)數(shù)和小概率細(xì)胞分析等；生物學(xué)領(lǐng)域，如：微生物活體或死體分析、發(fā)酵控制和細(xì)胞DNA含量計(jì)數(shù)等。由于種質(zhì)資源染色體倍性數(shù)據(jù)是新品種選育必要的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和遺傳背景,且在植物種質(zhì)資源鑒定和開(kāi)發(fā)利用工作中的應(yīng)用還很少。因此，本文對(duì)流式細(xì)胞儀的操作流程、特點(diǎn)、應(yīng)用領(lǐng)域及其在植物種質(zhì)資源上的應(yīng)用進(jìn)展作了綜述[3]。

1 流式細(xì)胞儀

1.1 簡(jiǎn)介

流式細(xì)胞儀(Flow cytometry)是對(duì)細(xì)胞進(jìn)行自動(dòng)分析和分選的裝置。20世紀(jì)60年代后迅速發(fā)展起來(lái)，至80年代，流式細(xì)胞儀進(jìn)入商品化時(shí)期，90年代則進(jìn)入產(chǎn)品優(yōu)化階段，各項(xiàng)功能逐漸強(qiáng)大，人們進(jìn)行科學(xué)研究時(shí)也開(kāi)始涉及流式細(xì)胞儀的應(yīng)用。流式細(xì)胞儀利用光學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)高速流動(dòng)的單細(xì)胞懸浮液進(jìn)行多參數(shù)測(cè)量和信號(hào)處理得到的DNA 含量分布曲線，可以直接觀測(cè)植物倍性，且具有高效率、 高靈敏度、高分辨率和高精確度的特點(diǎn)，檢測(cè)一個(gè)樣品只需幾分鐘，破壞性小，只要幾微克的組織便可進(jìn)行樣品分析，操作技術(shù)簡(jiǎn)單，快速，而且能區(qū)分混倍體[4]。

1.2 特點(diǎn)

流式細(xì)胞儀與普通生物顯微鏡不同，在細(xì)胞分選以及倍性鑒定方面具有明顯的特征和優(yōu)勢(shì)，如表1所示：

表1 流式細(xì)胞儀與普通顯微鏡倍性鑒定優(yōu)勢(shì)比較

1.3 操作流程

流式細(xì)胞儀簡(jiǎn)單易操作，待測(cè)樣品的制備只需幾分鐘，檢測(cè)結(jié)果也只需幾分鐘就可以清楚的看到。具體操作流程如圖1所示：

1.4 應(yīng)用領(lǐng)域

1.4.1 醫(yī)學(xué) 王琪等應(yīng)用流式細(xì)胞儀對(duì)患者的淋巴細(xì)胞亞群相對(duì)與絕對(duì)數(shù)量進(jìn)行了檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)CD4+T淋巴細(xì)胞平均數(shù)量較高,免疫功能損傷程度較低。這項(xiàng)檢測(cè)有助于今早發(fā)現(xiàn)HIV感染者，更好的把握治療最佳時(shí)機(jī)，提高生存的質(zhì)量[5]。蘇密龍等應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)多發(fā)性骨髓瘤患者的中骨髓細(xì)胞表面免疫表型特征進(jìn)行了檢測(cè)。研究表明，通過(guò)骨髓瘤細(xì)胞免疫表型可鑒別骨瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞,這對(duì)今后快速，準(zhǔn)確診斷骨瘤細(xì)胞提供了重要手段[6]。閆彬等應(yīng)用流式細(xì)胞儀中流式微球法檢測(cè)血漿血管性血友病因子活性,及其對(duì)缺血性腦卒中(IS)預(yù)后評(píng)估。研究結(jié)果顯示，腦卒中患vWF:GPIbR與vWF:Ag、超敏CRP、Autar評(píng)分和住院天數(shù)呈正相關(guān)。與ELISA法相比,該方法簡(jiǎn)單可靠，特異度高，準(zhǔn)確性高，并且還可以預(yù)測(cè)腦卒中患者形成腦血栓的風(fēng)險(xiǎn)，評(píng)估預(yù)后[7]。Polat G等應(yīng)用流式細(xì)胞儀，確定了鐮狀紅細(xì)胞(RBCs)患者在不同時(shí)間暴露在低氧環(huán)境下時(shí)紅細(xì)胞的形態(tài)變化。與普通顯微鏡相比，可以對(duì)大量的細(xì)胞進(jìn)行快速的評(píng)估以及給出鐮狀紅細(xì)胞的動(dòng)態(tài)變化過(guò)程，并針對(duì)這些統(tǒng)計(jì)相關(guān)信息，提出相應(yīng)的治療手段，這樣就可以有效的提高鐮狀紅細(xì)胞患者的生活質(zhì)量[8]。Liran B.Y等通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)(IFC)來(lái)監(jiān)測(cè)變化感染Mimivirus的棘阿米巴多噬菌體細(xì)胞，評(píng)估氧化應(yīng)激和細(xì)胞骨架干擾物對(duì)病毒感染的影響。研究發(fā)現(xiàn)輕度氧化應(yīng)激可以延緩產(chǎn)生病毒的多個(gè)階段，但發(fā)生感染的頻率大致相同。另外，還發(fā)現(xiàn)功能肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架需要融合病毒復(fù)制中心，才能產(chǎn)生病毒后代。為研究病毒感染周期和病毒-宿主相互作用提供了一種定量、高通量和高度可靠的方法[9]。Vijaya K應(yīng)用流式細(xì)胞儀確定原發(fā)性免疫缺陷(PID)或先天免疫缺陷影響表型免疫系統(tǒng)的一個(gè)或多個(gè)組成部分。其表面、細(xì)胞內(nèi)和核內(nèi)的蛋白質(zhì)都可以通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行評(píng)估鑒定，在遺傳分析PIDs中，可以快速、準(zhǔn)確的診斷。并且成本相對(duì)較低，在醫(yī)學(xué)研究中具有重要的應(yīng)用價(jià)值[10]。

1.4.2 生物學(xué) Shashanka S等對(duì)應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)提高產(chǎn)油微生物在生物處理中的作用，以及流式細(xì)胞術(shù)在產(chǎn)油微生物方面取得的進(jìn)展進(jìn)行了綜述。通過(guò)大量前人的研究結(jié)果說(shuō)明，在各種高通量篩選細(xì)胞的方法中，流式細(xì)胞術(shù)可操作性最好，還可以實(shí)現(xiàn)同時(shí)測(cè)量單個(gè)細(xì)胞水平上的生理特征和特定化合物的積累，且有希望從群體中分離出具有特定表型的細(xì)胞[11]。陳哲等通過(guò)流式細(xì)胞儀和 SCoT 分子標(biāo)記分別鑒定了 14 種荔枝品種的基因組大小及親緣關(guān)系，流式細(xì)胞儀測(cè)定結(jié)果顯示‘晚浦’、‘懷枝’和‘白糖罌’和‘井崗紅糯’基因組大小相近，荔枝品種間親緣關(guān)系與嫁接親和性具有一定的相關(guān)性。該研究將為荔枝砧木的篩選及嫁接親和力早期鑒定提供理論依據(jù)[12]。李雯雯等應(yīng)用流式細(xì)胞儀對(duì)野杏的細(xì)胞倍性和DNA含量進(jìn)行了鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)供試野杏均為二倍體；該研究還篩選出了最適合杏的解離液——MgSO4-LB01混合液。為杏屬植物基因組學(xué)和遺傳進(jìn)化研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)[13]。王婷婷等通過(guò)比較離心和不離心，碘化丙啶(Propidium iodide，PI)和4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)對(duì)流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果的影響。結(jié)果表明，離心的懸浮液中目的細(xì)胞比不離心的懸浮液中目的細(xì)胞少；染料DAPI與PI的染色效果無(wú)明顯差異。根據(jù)上述結(jié)果，初步建立起一套利用流式細(xì)胞術(shù)鑒定馬鈴薯倍性的方法，該方法樣品需求量小，步驟簡(jiǎn)單，快速準(zhǔn)確，是鑒定馬鈴薯染色體倍性的理想方法[14]。羅智等應(yīng)用流式細(xì)胞儀分析了‘冬棗’的5個(gè)自然變異材料，結(jié)果顯示，5個(gè)自然變異材料均為二倍體，同時(shí)評(píng)價(jià)了其果實(shí)形態(tài)、果實(shí)營(yíng)養(yǎng)、物候期以及 DNA 指紋，發(fā)現(xiàn)變異1號(hào)屬于優(yōu)良大果變異，變異3、4、5號(hào)為晚熟變異。這項(xiàng)研究為今后‘冬棗’遺傳育種工作提供了理論基礎(chǔ)[15]。陳敏敏等采用流式細(xì)胞儀鑒定了百合的倍性，同時(shí)發(fā)現(xiàn)采用Kiwifruit buffer 解離液解離、400 目濾膜過(guò)濾,并進(jìn)行 1 次離心后流式細(xì)胞儀鑒定百合倍性的結(jié)果更加精準(zhǔn)，且應(yīng)用優(yōu)化后的流式細(xì)胞術(shù)快速的鑒定出了百合的四倍體，這項(xiàng)研究為百合倍性研究提供了理論基礎(chǔ)[16]。吉乃喆等利用流式細(xì)胞術(shù)結(jié)合染色體壓片對(duì)后代進(jìn)行倍性檢測(cè)，得到三倍體。結(jié)果顯示，‘春水綠波’、‘羽士妝’不僅可以作為親本或者中間材料將其中的一些優(yōu)質(zhì)基因傳遞到現(xiàn)代基因庫(kù)中，而且還為后續(xù)三倍性育種研究提供理論基礎(chǔ)[17]。

2 流式細(xì)胞儀在植物種質(zhì)鑒定上的應(yīng)用

植物種質(zhì)資源是極其珍貴的農(nóng)業(yè)遺產(chǎn)與自然資源。如今，自然資源減少，生態(tài)環(huán)境破壞以及新品種及雜交種不斷推廣，古老品種逐漸被替代，導(dǎo)致某些重要遺傳資源瀕臨消失。一旦環(huán)境氣候發(fā)生變化，或者出現(xiàn)新病害和蟲(chóng)害，大面積推廣新品種地區(qū)將會(huì)面臨毀滅性的損失。人們已經(jīng)意識(shí)到植物種質(zhì)資源逐漸流失后帶來(lái)的嚴(yán)重影響，特別是在植物育種工作中，如果沒(méi)有相應(yīng)的種質(zhì)資源，就無(wú)法實(shí)現(xiàn)突破性成就。隨著流式細(xì)胞儀功能的不斷完善，其用途也越來(lái)越廣泛。目前，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)快速鑒定植物種質(zhì)資源的倍性，為植物種質(zhì)資源的保護(hù)及后期育種打下了基礎(chǔ)。

閆東玲等應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)了東北地區(qū) 6 種主要越桔屬(Vaccinium)植物的染色體倍性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有3種為四倍體，分別是篤斯越桔、紅豆越桔和朝鮮越桔；2種為二倍體，高山篤斯越桔和小果蔓越桔；1種為六倍體，大果蔓越桔。該研究將為中國(guó)越桔屬植物資源的遺傳學(xué)評(píng)價(jià)以及種質(zhì)資源開(kāi)發(fā)利用等提供重要的科學(xué)依據(jù)[18]。許蕾等采用流式細(xì)胞術(shù)，鑒定了鴨茅染色體倍性，鴨茅遺傳背景研究及多倍體材料的創(chuàng)制提供技術(shù)支撐，加快育種進(jìn)度，鴨茅遺傳背景研究和種質(zhì)資源利用建立依據(jù)，同時(shí)為遠(yuǎn)緣雜交及多倍體育種提供便利。[19,20]田路明等采用流式細(xì)胞儀鑒定了21種梨種質(zhì)資源的倍性，結(jié)果新發(fā)現(xiàn)了9份三倍體種質(zhì)，分別為‘細(xì)皮梨’‘黑酸梨’‘冀蜜梨’‘世紀(jì)梨’‘敦煌香水梨’‘Beure Bosk’ ‘William Laspave’‘Yakumo’‘Butirra Rosata’；為梨種質(zhì)資源的創(chuàng)新和開(kāi)發(fā)利用提供參考[21]。閆蕊等采用流式細(xì)胞儀鑒定了97份油茶種質(zhì)資源的染色體倍性，結(jié)果表明，其中倍性為二倍體的有29 份，倍性為四倍體的有58 份，倍性為六倍體的有9 份；并結(jié)合了SSR-PAGE 和 SSRseq方法，校正了8個(gè)二倍體為四倍體。該研究發(fā)現(xiàn)將三種技術(shù)結(jié)合能快速準(zhǔn)確的鑒定出多倍體植物的倍性，為油茶種質(zhì)資源的充分利用提供了理論基礎(chǔ)[22]。李偉強(qiáng)等采用流式細(xì)胞儀對(duì)8 份三倍體候選種質(zhì)材料進(jìn)行倍性鑒定，發(fā)現(xiàn)編號(hào)為 1346 的種質(zhì)材料為三倍體，其余 7 份種質(zhì)材料疑似為非整倍體。這為今后大量篩選多倍體種質(zhì)資源提供了重要依據(jù)[23]。閆佼利用流式細(xì)胞術(shù)完成了183份栽培香蕉和野生香蕉以及雜交后代的倍性分析，有69個(gè)二倍體,91個(gè)三倍體,23個(gè)四倍體，為品種選育工作提供分子鑒定依據(jù)。也通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),利用IRAP可以進(jìn)一步研究香蕉種質(zhì)資源的遺傳多樣性[24]。

朱敏等研究利用流式細(xì)胞儀分別測(cè)定鳶尾、射干和巴西鳶尾新鮮葉片的基因組大小。研究表明：3種鳶尾科藥用植物的基因組較為復(fù)雜，射干屬和鳶尾屬基因組相差較大，同屬植物鳶尾和巴西鳶尾的基因組大小差異較小。通過(guò)該項(xiàng)研究，為傳統(tǒng)藥用植物射干屬和鳶尾屬種質(zhì)資源、品種鑒定和基因組研究提供參考[25]。謝卓宓等通過(guò)對(duì)比研究，通過(guò)流式細(xì)胞儀鑒定了9種金線蓮種質(zhì)均為4倍體，且相互的親緣關(guān)系也較近。這為為進(jìn)一步大范圍開(kāi)展金線蓮不同遺傳資源親緣關(guān)系研究提供了技術(shù)依據(jù)，同時(shí)，也為金線蓮的優(yōu)良資源篩選和品種鑒定奠定基礎(chǔ)[26]。呂順利用 FCM 技術(shù)分析 169 份香蕉種質(zhì)資源及雜交后代的倍性，為香蕉的遺傳進(jìn)化、系統(tǒng)分類(lèi)研究以及香蕉的雜交育種提供基礎(chǔ)[27]。張燕梅等利用流式細(xì)胞術(shù)與常規(guī)檢測(cè)方法相結(jié)合，檢測(cè)了25份劍麻種質(zhì)資源的倍性及農(nóng)藝性狀，研究結(jié)果顯示，二倍體14份，三倍體2份，四倍體5份，五倍體2份，粵西 75、六倍體1份，混倍體1份。且不同種質(zhì)資源的農(nóng)藝性狀存在顯著差異。該研究為劍麻種質(zhì)資源的鑒定、保存和推廣應(yīng)用提供參考，為劍麻雜交育種提供理論依據(jù)[2]。郭計(jì)華等利用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)11份香蕉種質(zhì)資源進(jìn)行分析，從細(xì)胞學(xué)層面上揭示了不同基因組類(lèi)型香蕉種質(zhì)的真實(shí)倍性。這種方法不僅能更好地反映香蕉種質(zhì)資源之間的遺傳特征，而且還可以為今后香蕉種質(zhì)的基因組學(xué)、物種分類(lèi)以及種群進(jìn)化等相關(guān)研究提供支撐[28]。劉昔輝等利用流式細(xì)胞儀鑒定了甘蔗及其近緣屬的倍性。結(jié)果表明，倍性最低的為芒屬的芒，其倍性為 1.4；倍性最高的是印度種的盤(pán)沙鞋，為 16.8，說(shuō)明甘蔗是一種遺傳背景復(fù)雜的非整倍體植物。該研究結(jié)果可用于指導(dǎo)甘蔗雜交組合的配置，能夠有效的開(kāi)發(fā)利用其種質(zhì)資源[29]。王磊利用流式細(xì)胞儀測(cè)定了中國(guó)各地63份生姜種質(zhì)資源的倍性，在此基礎(chǔ)上，建立了生姜細(xì)胞懸浮系等生物育種技術(shù)體系，為創(chuàng)新生姜種質(zhì)材料和新品種的選育提供有力的保證[30]。張靖國(guó)等采用流式細(xì)胞術(shù)較為系統(tǒng)全面地對(duì)國(guó)家果樹(shù)種質(zhì)武昌砂梨圃中收集保存的466份砂梨種質(zhì)進(jìn)行倍性鑒定, 明晰了中國(guó)砂梨基于染色體水平的多樣性,為砂梨多倍體育種和起源進(jìn)化等研究提供依據(jù)[31]。

Burson B.L等采用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定了568份黃樟草種質(zhì)資源，研究表明，308份是四倍體，139份是五倍體，20份是六倍體，2份是七倍體，99份為非整倍體。該研究不僅明確了568份黃樟草種質(zhì)資源的倍性，而且還為今后黃樟草種質(zhì)的創(chuàng)新及開(kāi)發(fā)利用提供了理論基礎(chǔ)[32]。Tian L利用流式細(xì)胞儀對(duì)毛里求斯的相關(guān)種質(zhì)資源進(jìn)行了倍性檢測(cè)，并建立了一套可靠的SSR標(biāo)記物。結(jié)果顯示，毛里求斯種質(zhì)資源的遺傳關(guān)系與地理起源基本一致，也為為毛里求斯茅屬植物的品種鑒定和遺傳多樣性、多倍體化和馴化提供新的理論依據(jù)[33]。Postman J等利用流式細(xì)胞術(shù)是對(duì)1284份基因庫(kù)的梨種質(zhì)幼葉組織進(jìn)行倍性鑒定，研究發(fā)現(xiàn)其中有一個(gè)歐洲品種是四倍體，有三個(gè)亞洲品種是三倍體。這項(xiàng)研究明確了梨種質(zhì)的倍性，不僅可以有效的幫助種植者避免使用三倍體不育花粉，有效的提高了育種的效率，而且還有助于該種質(zhì)資源遺傳圖譜的建立以及今后的開(kāi)發(fā)利用[34]。Metin T溴草種質(zhì)資源的DNA含量和倍性測(cè)定通過(guò)流式細(xì)胞術(shù),用普通二倍體做對(duì)照，測(cè)定發(fā)現(xiàn)不同倍性水平的溴草種質(zhì)資源[35]。Brummer等流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定紫花苜蓿種質(zhì)資源的倍性，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，20分之三紫花苜蓿屬二倍體。并且通過(guò)流式細(xì)胞儀確定了之前采用根尖染色體計(jì)數(shù)評(píng)估倍性存在一些不準(zhǔn)確性，說(shuō)明了流式細(xì)胞儀比根尖染色體計(jì)數(shù)法更快捷、更準(zhǔn)確，為植物種質(zhì)資源倍性研究人員提供了有力、可靠的技術(shù)支撐[36]。

3 結(jié)語(yǔ)

近年來(lái)，隨著流式細(xì)胞儀組件的不斷更新，染色劑的不斷改進(jìn)，流式細(xì)胞術(shù)已逐步應(yīng)用于多個(gè)科學(xué)研究領(lǐng)域，可檢測(cè)指標(biāo)逐漸增多，在植物倍性鑒定等方法上則具有其他技術(shù)不可替代的優(yōu)勢(shì)。由于流式細(xì)胞儀檢測(cè)的指標(biāo)對(duì)應(yīng)的試驗(yàn)方法各不相同，需要注意的事項(xiàng)也存在差異，因此，筆者所提供的試驗(yàn)流程僅適用于檢測(cè)植物的倍性、DNA含量等生物信息。為此，今后在進(jìn)行植物科學(xué)試驗(yàn)時(shí)，針對(duì)待測(cè)樣品需要，設(shè)計(jì)相應(yīng)的試驗(yàn)方法，還需要不斷地實(shí)踐總結(jié)，積累經(jīng)驗(yàn)。總之，隨著相關(guān)研究的不斷深入，流式細(xì)胞術(shù)涉及到的試驗(yàn)方法也會(huì)越來(lái)越成熟，應(yīng)用范圍也會(huì)越來(lái)越廣泛，檢測(cè)結(jié)果也會(huì)更加準(zhǔn)確。