新疆庫爾勒地區(qū)不同來源食源性葡萄球菌的耐藥性比較及相關(guān)耐藥基因檢測(cè)

王舒豐，姚曉慧，王凱，馬木爾·阿克木漢，夏利寧

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052)

葡萄球菌是造成人類食物中毒的常見致病菌之一，也是引起化膿性疾病的重要病原菌[1]。該菌廣泛分布于空氣、土壤、水中，人和動(dòng)物有較高的帶菌率。因此，食品受其污染的機(jī)會(huì)很多[2]。葡萄球菌病是一種重要的人獸共患病，動(dòng)物源葡萄球菌還可成為耐藥基因的貯存庫[3]。食物鏈?zhǔn)羌?xì)菌耐藥散播的重要環(huán)節(jié)，研究結(jié)果表明，耐藥菌可直接或間接通過食物鏈感染人，并具有將抗藥特性病原菌通過食物鏈轉(zhuǎn)移給人體的潛在危險(xiǎn)[4]。在美國由葡萄球菌引起的食物中毒占整個(gè)細(xì)菌性食物中毒的33%，加拿大則更多，占45%[5]。我國有多家醫(yī)院對(duì)葡萄球菌引起的食源性疾病進(jìn)行調(diào)查[6-8]，葡萄球菌所引起的食源性疾病也日益成為世界性的衛(wèi)生問題[9-10]。因此，開展食品中葡萄球菌的耐藥性調(diào)查，對(duì)食源性疾病的檢測(cè)和指導(dǎo)臨床用藥都具有十分重要的意義。本文通過對(duì)新疆庫爾勒地區(qū)各大市場(chǎng)及屠宰場(chǎng)的肉類、胴體進(jìn)行采樣，從中分離葡萄球菌，對(duì)其進(jìn)行耐藥性及相關(guān)耐藥基因檢測(cè)的研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)菌株

2017年4月在新疆庫爾勒市各大批發(fā)市場(chǎng)、屠宰場(chǎng)進(jìn)行隨機(jī)采樣，共采集樣品201份。其中市場(chǎng)采集牛肉樣31份、羊肉樣37份，共68份市場(chǎng)源樣品；屠宰場(chǎng)采集胴體樣133份。將采集的樣品放入裝有1 mL肉湯的2 mL EP管中，低溫保存帶回實(shí)驗(yàn)室，從中分離試驗(yàn)用葡萄球菌。

1.1.2 培養(yǎng)基

MH肉湯培養(yǎng)基，購自北京奧博星生物技術(shù)有限公司；BP瓊脂基礎(chǔ)、亞碲酸鹽卵黃增菌液，購自青島高科園海波生物有限公司。

1.1.3 質(zhì)控菌株及藥物

金黃色葡萄球菌質(zhì)控菌ATCC29213，購自杭州天和微生物試劑有限公司。

藥敏試驗(yàn)所用藥物包括：阿莫西林/克拉維酸(A/C)、頭孢噻呋(EFT)、苯唑西林(OX)、四環(huán)素(TE)、氧氟沙星(DF)、氟苯尼考(FFC)、慶大霉素(GEN)、阿米卡星(AMK)、利福平(RP)、克林霉素(CM)。上述藥品均購自中國獸藥監(jiān)察所。

1.2 方法

1.2.1 葡萄球菌的分離與鑒定

吸取4 μL采集的樣品至1 mL含7.5%氯化鈉滅菌肉湯中，37 ℃培養(yǎng)18～24 h，初步篩選葡萄球菌。培養(yǎng)后，用無菌接種環(huán)蘸取上述菌液劃線接種于BP瓊脂上，37 ℃培養(yǎng)24～48 h。在BP瓊脂上挑取圓形、表面光滑、凸起、濕潤、顏色呈灰色至黑色的單個(gè)菌落于MH肉湯中，作為疑似葡萄球菌保存。對(duì)疑似葡萄球菌進(jìn)行革蘭染色，對(duì)鏡下觀察到紫色、呈葡萄串狀排列、無芽胞、無莢膜的菌落，進(jìn)行觸酶試驗(yàn)。用接種環(huán)取鏡檢培養(yǎng)物在一張潔凈玻片中央，滴加3%過氧化氫，觀察氣泡出現(xiàn)；若有，則為觸酶試驗(yàn)陽性，確定為葡萄球菌。

通過檢測(cè)Nuc基因來鑒定樣品中的金黃色葡萄球菌。引物合成參考文獻(xiàn)[11]，由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。

表1 Nuc基因引物

1.2.2 藥物敏感試驗(yàn)

參照抗生素敏感性測(cè)試歐洲協(xié)會(huì)(EUCAST)指導(dǎo)原則和執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)，采用瓊脂稀釋法測(cè)定葡萄球菌對(duì)10種抗菌藥的最小抑菌濃度(MICs)。結(jié)果判定參照EUCAST(2016)標(biāo)準(zhǔn)表，以敏感、中介、耐藥3種形式對(duì)MICs值做出判定。判定標(biāo)準(zhǔn)見表2。

表2 EUCAST(2016)瓊脂稀釋法葡萄球菌屬質(zhì)控范圍及MIC判定值

1.2.3 耐藥基因的檢測(cè)

根據(jù)文獻(xiàn)[12-13]公布的基因序列設(shè)計(jì)erm(B)、optrA、las(E)、norA、tet(M)、femA、mecA這7種耐藥基因引物，對(duì)分離的耐藥菌株進(jìn)行上述耐藥基因的PCR檢測(cè)。引物由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。詳見表3。

表3 耐藥基因的引物序列及目標(biāo)片段長度

1.2.4 數(shù)據(jù)的處理

耐藥率差異分析采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行單因素方差模型分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄球菌分離

經(jīng)過分離與鑒定，從201份樣品中分離出147株葡萄球菌，分離率為73.1%。市場(chǎng)源分離出60株葡萄球菌，分離率為88.2%；屠宰場(chǎng)源分離87株葡萄球菌，分離率為65.4%。未檢出Nuc基因，說明樣品中沒有金黃色葡萄球菌。結(jié)果詳見表4。

表4 不同來源葡萄球菌的分離率

2.2 不同來源食源性葡萄球菌耐藥性比較

147株葡萄球菌分離株對(duì)10種常用抗菌藥物的敏感性結(jié)果見圖1。市場(chǎng)源葡萄球菌對(duì)阿莫西林/克拉維酸、頭孢噻呋、苯唑西林、四環(huán)素、氧氟沙星、氟苯尼考、慶大霉素、阿米卡星、利福平、克林霉素的耐藥率依次為18.3%、23.3%、95.0%、56.7%、25.0%、1.7%、5.0%、5.0%、10.0%、53.3%。屠宰場(chǎng)源葡萄球菌對(duì)阿莫西林/克拉維酸、頭孢噻呋、苯唑西林、四環(huán)素、氧氟沙星、氟苯尼考、慶大霉素、阿米卡星、利福平、克林霉素的耐藥率依次為17.2%、32.2%、95.4%、64.4%、65.5%、28.7%、24.1%、2.3%、27.6%、60.9%。屠宰場(chǎng)源葡萄球菌對(duì)氧氟沙星、氟苯尼考、慶大霉素以及利福平的耐藥率極顯著高于市場(chǎng)源葡萄球菌的耐藥率(P<0.01)。而市場(chǎng)源葡萄球菌對(duì)阿米卡星的耐藥率極顯著高于屠宰場(chǎng)源葡萄球菌的耐藥率(P<0.01)。屠宰場(chǎng)源葡萄球菌與市場(chǎng)源葡萄球菌在阿莫西林/克拉維酸、頭孢噻呋、苯唑西林、四環(huán)素及克林霉素的耐藥率上差異不顯著(P>0.05)。

注：A/C.阿莫西林/克拉維酸；EFT.頭孢噻呋；OX.苯唑西林；TE.四環(huán)素；DF.氧氟沙星；FFC.氟苯尼考；GEN.慶大霉素；AMK.阿米卡星；RP.利福平；CM.克林霉素。**表示差異極顯著(P<0.01)圖1 不同食品源葡萄球菌對(duì)被檢藥物的耐藥率

2.3 不同食源性葡萄球菌多藥耐藥比較

市場(chǎng)源葡萄球菌以2耐(20%)、3耐(23.3%)和4耐(25%)為主，占68.3%；屠宰場(chǎng)源葡萄球菌在1～10耐均有分布，其中以3耐(16.1%)、4耐(16.1%)和5耐(17.2%)為主，占49.4%。耐5種以上抗生素的多藥耐藥菌株在市場(chǎng)和屠宰場(chǎng)有各自的比例，且屠宰場(chǎng)源比市場(chǎng)源更嚴(yán)重。結(jié)果詳見圖2。

圖2 不同食品源葡萄球菌多藥耐藥結(jié)果

2.4 食品源葡萄球菌中7種耐藥基因檢測(cè)結(jié)果

由表5、表6可知，147株葡萄球菌對(duì)7種耐藥基因檢測(cè)結(jié)果。葡萄球菌中四環(huán)素耐藥基因tet(M)和克林霉素耐藥基因erm(B)的檢出率最高，分別為28.6%(42/147)和24.5%(36/188)。其他耐藥基因的檢出率依次為：optrA(17.0%，25/147)；lsa(E)(4.1%，6/147)；norA(2.7%，4/147)；femA(2.0%，3/147)；mecA(0.7%，1/147)。有38株菌同時(shí)攜帶有2種或者2種以上的耐藥基因。

表5 食源性葡萄球菌耐藥基因檢出情況

表6 葡萄球菌攜帶2個(gè)及2個(gè)以上的耐藥基因型

3 討論

從新疆庫爾勒地區(qū)采集樣品201份，分離出葡萄球菌147株，分離率為73.1%，該地區(qū)的分離率要明顯高于福建地區(qū)的分離率[14]。其中市場(chǎng)源樣品分離率為88.2%，明顯高于嵇辛勤等[15]對(duì)市場(chǎng)源葡萄球菌的分離率。屠宰場(chǎng)源樣品分離率為65.4%。雖然屠宰加工過程中可減少胴體表面各種腐敗菌、致病菌的污染[16]，但是在運(yùn)輸以及銷售環(huán)節(jié)很可能對(duì)產(chǎn)品造成二次污染[17]。食源性葡萄球菌分離率的增高，很可能導(dǎo)致由葡萄球菌引起的感染增加，使人患病的風(fēng)險(xiǎn)增高。此次試驗(yàn)中未檢出金黃色葡萄球菌，與王曉蘭等[18]報(bào)道的石河子市豬肉中金黃色葡萄球菌的檢測(cè)一致。因此，應(yīng)避免食品在加工、運(yùn)輸?shù)冗^程中的污染，降低食源性細(xì)菌的感染，注重食品衛(wèi)生監(jiān)管。

通過耐藥性比較，市場(chǎng)源葡萄球菌和屠宰場(chǎng)源葡萄球菌對(duì)被檢藥物的耐藥程度存在顯著差異。屠宰場(chǎng)源葡萄球菌的耐藥情況比市場(chǎng)源葡萄球菌的耐藥情況更嚴(yán)重。屠宰場(chǎng)源葡萄球菌的耐藥性是動(dòng)物在活體狀態(tài)下使用抗菌藥物或者食用添加抗菌藥物的飼料所獲得耐藥性，而肉樣在進(jìn)入市場(chǎng)前都會(huì)進(jìn)行滅菌處理，所以市場(chǎng)源葡萄球菌可能是來自運(yùn)輸以及銷售過程中的二次污染，大部分為不攜帶耐藥性的普通葡萄球菌。這可能是導(dǎo)致屠宰場(chǎng)源葡萄球菌的耐藥情況嚴(yán)重的原因。市場(chǎng)源葡萄球菌與屠宰場(chǎng)源葡萄球菌對(duì)苯唑西林的耐藥率高達(dá)95%以上，與軒慧勇等[19]報(bào)道的耐藥率結(jié)果相似。這可能與當(dāng)?shù)卮罅渴褂帽竭蛭髁炙幬镏委熂膊。瑢?dǎo)致葡萄球菌對(duì)苯唑西林的耐藥率較為普遍有關(guān)。應(yīng)該減少苯唑西林在臨床的使用，可以嘗試使用敏感率較高的阿莫西林或者頭孢噻呋來治療疾病，避免濫用造成交叉耐藥。市場(chǎng)源葡萄球菌與屠宰場(chǎng)源葡萄球菌對(duì)四環(huán)素和克林霉素的耐藥率均達(dá)到60%以上，與蘇靜等[20]報(bào)道的耐藥結(jié)果相似，這可能是由于兩地在治療疾病上都采用了相同的抗菌藥物進(jìn)行治療造成的結(jié)果。屠宰場(chǎng)源葡萄球菌對(duì)氧氟沙星的耐藥率為65.5%，與馬木爾·阿克木漢等[21]對(duì)新疆地區(qū)養(yǎng)殖場(chǎng)葡萄球菌對(duì)氧氟沙星耐藥性調(diào)查結(jié)果相似。市場(chǎng)源葡萄球菌與屠宰場(chǎng)源葡萄球菌對(duì)四環(huán)素、克林霉素、氧氟沙星的耐藥率較高，臨床上應(yīng)該減少上述3種抗菌藥物的使用并及時(shí)監(jiān)測(cè)3種抗菌藥物的耐藥情況，以免出現(xiàn)多藥耐藥菌株數(shù)量暴增事件的發(fā)生。

多藥耐藥結(jié)果顯示屠宰場(chǎng)源葡萄球菌的多藥耐藥情況較為嚴(yán)重。市場(chǎng)源葡萄球菌的多藥耐藥主要集中在2～4耐，占68.3%；屠宰場(chǎng)源葡萄球菌多藥耐藥主要集中在3～5耐，占49.4%。市場(chǎng)源葡萄球菌未檢出10耐的耐藥菌，而屠宰場(chǎng)源檢出1株10耐的耐藥菌株，低于李靜媚[22]等報(bào)道動(dòng)物肉類及其他食品的多重耐藥結(jié)果。本研究中市場(chǎng)源產(chǎn)品將會(huì)直接進(jìn)入居民餐桌，這可能導(dǎo)致肉樣攜帶的耐藥菌污染居民餐具，使耐藥菌進(jìn)一步傳播給人，增加人患病風(fēng)險(xiǎn)的同時(shí)增加治療的難度。

耐藥基因的檢測(cè)能為細(xì)菌的耐藥機(jī)制以及流行病學(xué)提供更多的依據(jù)。本試驗(yàn)中選擇與抗菌藥物相對(duì)應(yīng)的7種耐藥基因erm(B)、optrA、lsa(E)、norA、tet(M)、femA、mecA進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，食源性葡萄球菌中erm(B)、optrA、tet(M)基因的檢出率明顯高于其他被檢耐藥基因，且147株葡萄球菌有38株攜帶有2種及2種以上的耐藥基因。

tet(M)基因作為四環(huán)素類抗生素常見耐藥基因，通過編碼核糖體保護(hù)蛋白與核糖體結(jié)合從而阻止四環(huán)素對(duì)蛋白合成的抑制作用，使細(xì)菌對(duì)四環(huán)素類藥物耐藥[23]。本研究中的tet(M)基因的陽性檢出率為28.6%，與福建地區(qū)(23%)檢出率相近[14]，低于廣東地區(qū)(44.4%)檢出率[24]。攜帶tet(M)基因的菌株占攜帶耐藥基因菌株總數(shù)的92.1%，說明該地區(qū)食品源葡萄球菌以攜帶tet(M)基因?yàn)橹鳎沫h(huán)素類抗生素對(duì)當(dāng)?shù)仄咸亚蚓鸬募膊≈委熜Ч跷?，?yīng)及時(shí)停止使用，避免造成不必要的經(jīng)濟(jì)損失。

大環(huán)內(nèi)酯類藥物的抗菌作用是通過抑制細(xì)菌內(nèi)的核糖體23S rRNA基因活性，阻斷蛋白質(zhì)合成來實(shí)現(xiàn)的。其耐藥性是因甲基轉(zhuǎn)移酶erm基因催化23S rRNA基因甲基化，致使藥物與RNA親和力降低而產(chǎn)生[25]。本研究中erm(B)基因的陽性檢出率為24.5%，遠(yuǎn)低于廣東地區(qū)(43.3%)[21]、福建地區(qū)(38.3%)[14]的陽性檢出率，但與軒慧勇等[19]對(duì)新疆地區(qū)erm(B)基因的檢出率相近。這可能與地域有關(guān)，導(dǎo)致erm(B)基因的檢出率出現(xiàn)差異。

optrA基因是除cfr外，另外一個(gè)引起惡唑烷酮類和酰胺醇類類抗生素耐藥的基因。目前關(guān)于葡萄球菌攜帶optrA基因的報(bào)道不多，孫城濤等[26]、李德喜等[27]有該方面的報(bào)道，但未有關(guān)于食品源葡萄球菌中檢測(cè)出optrA基因的報(bào)道，Tamang等[28]報(bào)道了食品源腸球菌中檢測(cè)出optrA基因。本研究檢測(cè)出25株攜帶有optrA基因菌株，檢出率為17.0%。該基因的出現(xiàn)嚴(yán)重危害到人類健康和畜禽養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，應(yīng)該引起人們的高度重視[29]。

綜上所述，食品源葡萄球菌對(duì)多數(shù)被檢抗菌藥都存在不同程度的耐藥，耐藥基因以erm(B)、optrA、tet(M)為主。為防止耐藥菌的傳播，應(yīng)該加強(qiáng)對(duì)屠宰場(chǎng)的監(jiān)管力度，提高對(duì)散戶養(yǎng)殖產(chǎn)品的收購標(biāo)準(zhǔn)。市場(chǎng)應(yīng)該加大對(duì)產(chǎn)品來源的調(diào)查，從源頭上防止耐藥菌向人類的傳播。