17種消毒劑對(duì)大腸桿菌、沙門菌及金黃色葡萄球菌的殺菌試驗(yàn)

鄧同煒，齊亞如，石月航，郭冰潔，蔣增海，彭志鋒，徐耀輝,2*

(1.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院動(dòng)物醫(yī)藥學(xué)院，河南 鄭州 450046；2.河南省家禽疾病防控工程技術(shù)研究中心，河南 鄭州 450046)

隨著畜禽養(yǎng)殖模式向規(guī)?；⒓s化發(fā)展，在提高生產(chǎn)效率的同時(shí)，飼養(yǎng)密度的增加也增大了動(dòng)物傳染病的傳播機(jī)率和速度[1]。除了疫苗接種和藥物防控外，做好飼養(yǎng)環(huán)境衛(wèi)生、消毒等生物安全措施對(duì)于畜禽傳染病防控至關(guān)重要。規(guī)范的消毒措施已成為降低環(huán)境中病原微生物數(shù)量的有效手段。消毒劑在殺滅病原時(shí)所需要的濃度和作用時(shí)間也會(huì)隨著環(huán)境溫度和畜舍中有機(jī)物濃度大小等的影響發(fā)生改變。使用濃度過(guò)高的消毒液會(huì)造成對(duì)消毒劑的浪費(fèi)，增加了成本，甚至?xí)?duì)環(huán)境造成污染和危害，使用濃度過(guò)低的消毒液會(huì)導(dǎo)致病原菌不能被完全殺死[2-3]。養(yǎng)殖場(chǎng)消毒作為一項(xiàng)經(jīng)常性工作，也存在由于長(zhǎng)期使用相同的消毒劑導(dǎo)致病原菌產(chǎn)生了耐藥性，殺菌效果降低[4]。

目前，市場(chǎng)上用于養(yǎng)殖場(chǎng)的消毒劑種類繁多，消毒效果也存在一定程度差異，合理選擇使用消毒劑成為消毒成敗的關(guān)鍵因素之一[5-6]。實(shí)際生產(chǎn)中，養(yǎng)殖場(chǎng)在選擇與使用消毒劑時(shí)，往往存在一定的盲目性。本試驗(yàn)以禽源大腸桿菌、沙門菌、金黃色葡萄球菌為受試菌，采用懸液定量殺菌試驗(yàn)比較養(yǎng)雞場(chǎng)17種常用消毒劑殺菌效果，并選擇其中9種性價(jià)比高的消毒劑，在不同濃度的有機(jī)物干擾下進(jìn)行殺菌試驗(yàn)，為養(yǎng)殖場(chǎng)消毒劑的選擇與使用提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株

大腸桿菌(菌株編號(hào)18-2-26)、德爾卑沙門菌(菌株編號(hào)18-SD-3)和金黃色葡萄球菌(菌株編號(hào)18-SA-1)由河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院動(dòng)物傳染病實(shí)驗(yàn)室分離保存。

1.2 主要試劑

普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂、MH肉湯、牛血清白蛋白(BSA)。

1.3 消毒劑

試驗(yàn)用消毒劑：金保安(海南育奇藥業(yè)有限公司生產(chǎn))、醛力美(新鄉(xiāng)市百醫(yī)百順動(dòng)物藥業(yè)有限公司生產(chǎn))、新歐福(瑞普(天津)生物藥業(yè)有限公司生產(chǎn))、戊二醛癸甲溴胺(河南后羿實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司生產(chǎn))、安滅殺(英國(guó)考文垂化學(xué)藥品有限公司生產(chǎn))、樂(lè)福醛(河南大華生物技術(shù)有限公司生產(chǎn))、瘟毒凈(徐州金牌藥業(yè)公司)、泛福露益溶液(廣州市畜牧科學(xué)研究所動(dòng)物保健實(shí)驗(yàn)藥廠生產(chǎn))、氯甲酚(上?？道脛?dòng)物藥品有限公司生產(chǎn))、復(fù)合酚(齊魯動(dòng)物保健有限公司生產(chǎn))、衛(wèi)可1(英國(guó)安德國(guó)際有限公司生產(chǎn))、衛(wèi)可2(杜邦公司生產(chǎn))、安立消(瑞普(天津)生物藥業(yè)有限公司生產(chǎn))、月芐三甲氯胺(江蘇康巴特生物工程有限公司生產(chǎn))、百敵克(美國(guó)龍沙公司生產(chǎn))、百能(廣東嘉華生物科技有限公司生產(chǎn))、新潔爾滅(北京中農(nóng)大生物技術(shù)股份有限公司生產(chǎn))，共17種消毒劑。

1.4 17種消毒劑對(duì)3種病原菌最小殺菌濃度的確定

將17種消毒劑，采用試管二倍稀釋法[7-8]，以消毒劑推薦噴霧使用濃度為中間值，向上稀釋3個(gè)濃度，向下稀釋2個(gè)濃度。將大腸桿菌、沙門菌、金黃色葡萄球菌各2株分別劃線于普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上37 ℃ 24 h，挑取單個(gè)菌落接種于5 mL營(yíng)養(yǎng)肉湯，對(duì)比比色卡培養(yǎng)至0.5麥?zhǔn)蠞舛龋?×108cfu/mL。取0.1 mL制備好的菌懸液，分別加入含有不同濃度消毒劑的肉湯中，每株菌做1個(gè)重復(fù)，放入37 ℃搖床培養(yǎng)18～20 h。設(shè)1管陽(yáng)性對(duì)照(菌液+雙倍肉湯)，1管陰性對(duì)照(雙倍肉湯)，計(jì)數(shù)結(jié)果取平均值。

以無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)的消毒劑最高稀釋度濃度為該消毒劑的最小殺菌濃度(MBC)，用平板計(jì)數(shù)方法確定。平板上菌落數(shù)≤5個(gè)，視為無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)[7-8]。

1.5 不存在有機(jī)干擾物時(shí)9種消毒劑對(duì)受試菌的殺菌效果比較

根據(jù)1.4試驗(yàn)結(jié)果，先將消毒劑配成各自相應(yīng)的2 MBC濃度。每個(gè)離心管中加入2.5 mL 2 MBC消毒劑、2.5 mL雙倍肉湯、0.1 mL菌懸液，在不同時(shí)間點(diǎn)：5 min、1 h、12 h、24 h、48 h、72 h，分別取100 μL 倍比稀釋后平行涂板于普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂，37 ℃培養(yǎng)24 h計(jì)數(shù)，每個(gè)稀釋度涂培養(yǎng)基平板2個(gè)，結(jié)果取平均值。以無(wú)菌超純水代替消毒劑作為陽(yáng)性對(duì)照，以無(wú)菌超純水代替消毒劑和菌懸液作為陰性對(duì)照[7-8]。

殺滅率=(消毒前細(xì)菌數(shù)-消毒后細(xì)菌數(shù))/消毒前細(xì)菌數(shù)×100%

1.6 存在有機(jī)干擾物時(shí)9種消毒劑對(duì)受試菌的殺菌效果比較

1.6.1 有機(jī)干擾物濃度的選擇

將干擾物BSA預(yù)先配成0.3%、10%的濃度，根據(jù)1.5試驗(yàn)結(jié)果，選擇無(wú)干擾物存在時(shí)消毒劑的最小殺菌濃度進(jìn)行定量殺菌試驗(yàn)，若均有細(xì)菌生長(zhǎng)，可提高消毒劑濃度，暫定為干擾物終濃度為0.03%、1%時(shí)消毒劑的濃度分別選擇其MBC的1倍、2倍。

1.6.2 有機(jī)干擾物對(duì)消毒劑殺菌的干擾試驗(yàn)

在離心管中分別加入0.4 mL菌懸液、0.6 mL干擾物、2 mL 3倍肉湯、3 mL消毒劑，進(jìn)行定量殺菌實(shí)驗(yàn)；在不同時(shí)間段吸100 μL 涂布于普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)平行涂培養(yǎng)基平板2個(gè)，37 ℃培養(yǎng)24 h計(jì)數(shù)，結(jié)果取平均值。以無(wú)菌超純水代替消毒劑作為陽(yáng)性對(duì)照，以無(wú)菌超純水代替消毒劑和菌懸液作為陰性對(duì)照。

2 結(jié)果

2.1 17種消毒劑對(duì)大腸桿菌、沙門菌、金黃色葡萄球菌消毒效果的比較

結(jié)果如表1所示，MBC一般高于推薦噴霧濃度一倍以上，其中百敵克的MBC最小。成分為戊二醛+癸甲溴銨的四種消毒劑(金保安、醛力美、新歐福、戊二醛癸甲溴銨)中，金保安的殺菌效果最差，其余三種效果相差不大。有效成分相同的衛(wèi)可1、衛(wèi)可2殺菌效果相近，安立消、月芐三甲氯銨殺菌效果相近。殺滅金黃色葡萄球菌所需消毒劑最小殺菌濃度普遍低于大腸桿菌。

表1 不同消毒劑對(duì)3種病原菌的殺菌效果比較

對(duì)17種消毒劑進(jìn)行綜合比較，選出9種性價(jià)比較高的消毒劑：戊二醛癸甲溴銨溶液、醛力美、新歐福、樂(lè)福醛、安滅殺、百敵克、百能、月芐三甲氯銨溶液、安立消。以每種消毒劑對(duì)大腸桿菌、沙門菌、金黃色葡萄球菌三種菌MBC中最低稀釋倍數(shù)的濃度進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

2.2 無(wú)有機(jī)干擾物存在時(shí)9種消毒劑對(duì)受試菌殺菌效果的比較

無(wú)干擾物存在時(shí)，樂(lè)福醛對(duì)金黃色葡萄球菌殺滅效果最差，5 min、1 h、12 h、24 h均不能完全殺滅金黃色葡萄球菌，直至48 h時(shí)才完全殺滅，72 h時(shí)殺菌作用已消失，總體殺菌效果比其他8種消毒劑差。在5 min時(shí)，安滅殺、百能、醛力美即可對(duì)大腸桿菌殺滅率達(dá)到100%，但不能全部殺滅金黃色葡萄球菌；在1 h時(shí)，醛力美對(duì)金黃色葡萄球菌可100%殺滅，安滅殺、百能仍不能全部殺滅；隨著時(shí)間延長(zhǎng)，在12 h開始對(duì)細(xì)菌殺滅率達(dá)到100%，直至72 h(72 h后未檢測(cè))。戊二醛癸甲溴銨、新歐福、百敵克、月芐三甲氯銨、安立消在5 min即可對(duì)大腸桿菌與葡萄球菌殺滅率達(dá)到100%，直至72 h(72 h后未檢測(cè))。結(jié)果見表2。

表2 無(wú)干擾物時(shí)9種消毒劑對(duì)受試菌的作用效果

2.3 存在有機(jī)干擾物時(shí)9種消毒劑對(duì)受試菌殺菌效果的比較

結(jié)果見表3。在0.03% BSA、1MBC消毒劑濃度下，戊二醛癸甲溴銨、醛力美、新歐福、安滅殺、百敵克、安立消6種消毒劑5min時(shí)即可對(duì)大腸桿菌殺滅率100%，直至72 h；百能、月芐三甲氯銨從1 h開始，樂(lè)福醛從12 h開始，直至72 h對(duì)大腸桿菌殺滅率100%。在同樣的干擾物濃度和消毒劑濃度下，百敵克、月芐三甲氯銨5 min時(shí)即對(duì)金黃色葡萄球菌殺滅率100%，直至72 h；戊二醛癸甲溴銨在1 h、新歐福、安滅殺、安立消在12 h、樂(lè)福醛在48 h對(duì)金黃色葡萄球菌殺滅率100%，直至72 h；醛力美直至72 h，才能對(duì)金黃色葡萄球菌全部殺滅。

表3 存在干擾物時(shí)9種消毒劑對(duì)受試菌的作用效果

將干擾物BSA濃度加大至1%、消毒劑濃度加大至2 MBC時(shí)，百敵克、月芐三甲氯銨、安立消5 min時(shí)即可對(duì)大腸桿菌殺滅率100%，直至72 h；新歐福、安滅殺、百能從1 h開始，醛力美、樂(lè)福醛從12 h開始，戊二醛癸甲溴銨從24 h開始對(duì)大腸桿菌殺滅率100%。

在同樣的干擾物濃度和消毒劑濃度下，月芐三甲氯銨在1 h，戊二醛癸甲溴銨、百敵克、百能、安立消在12～24 h對(duì)金黃色葡萄球菌殺滅率100%，樂(lè)福醛、安滅殺在72 h內(nèi)均不能殺滅全部金黃色葡萄球菌。

上述研究結(jié)果表明：有機(jī)干擾物濃度越大，所需要的消毒劑濃度越高，殺滅細(xì)菌需要時(shí)間越長(zhǎng)；9種消毒劑抗有機(jī)物干擾能力不同；在相同濃度的有機(jī)物干擾下，消毒劑對(duì)不同細(xì)菌的抗干擾能力也不相同，殺滅金黃色葡萄球菌所需時(shí)間長(zhǎng)于大腸桿菌。月芐三甲氯銨、百敵克、安立消、新歐福抗有機(jī)物干擾的能力較強(qiáng)。

3 討論

大腸桿菌、沙門菌和金黃色葡萄球菌是重要的人獸共患病原菌，對(duì)動(dòng)物和人的危害巨大。雞舍中上述3種菌廣泛存在[1,9-10]。因此，本研究選擇這3種細(xì)菌進(jìn)行試驗(yàn)，具有一定代表性。本研究中17種消毒劑殺滅金黃色葡萄球菌最小殺菌濃度普遍低于大腸桿菌，可能與細(xì)菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)有關(guān)，其他研究者也有相似的報(bào)道[11]。其中安滅殺、安立消以及月芐三甲氯銨的MBC均小于推薦噴霧濃度；樂(lè)福醛、瘟毒凈的的MBC均大于推薦噴霧濃度，也高于毛倩倩等[12]的報(bào)道。其余12種消毒劑的MBC值與推薦噴霧使用濃度基本一致。17種消毒劑之間消毒效果均存在差異,即使成分完全相同的消毒劑，其最小殺菌濃度也不同，比如成分相同的4種消毒劑(金保安、醛力美、新歐福、戊二醛癸甲溴銨)，金保安對(duì)3種試驗(yàn)菌株MBC大于推薦使用濃度的4～5倍，其余三種除對(duì)金黃色葡萄球菌MBC與推薦使用濃度一致外，對(duì)大腸桿菌、沙門菌MBC均大于推薦使用濃度；主要成分相同的安立消、月芐三甲氯銨消毒效果相差不大，但其MBC值均大于王繼[13]和李雯等[14]的報(bào)道；復(fù)合酚的MBC值大于李寶棟等[15]報(bào)道的復(fù)合酚對(duì)總菌落數(shù)的殺菌效果，瘟毒凈的MBC小于李雯等[14]的報(bào)道。

畜禽養(yǎng)殖場(chǎng)消毒會(huì)受到消毒對(duì)象、有機(jī)物、溫度、作用時(shí)間、污染物、消毒方式等因素的影響[16-18]，因此消毒時(shí)需根據(jù)消毒對(duì)象選擇適宜的消毒劑并適當(dāng)調(diào)整使用濃度，以期達(dá)到較好的消毒效果。本研究使用不同濃度干擾物模擬養(yǎng)殖環(huán)境潔凈程度差異，干擾物濃度≤0.03%時(shí)，模擬環(huán)境潔凈度較好的養(yǎng)殖場(chǎng)；干擾物濃度為1%時(shí)模擬環(huán)境潔凈度較差的養(yǎng)殖場(chǎng)。試驗(yàn)結(jié)果表明，有機(jī)干擾物濃度越大，所需要的消毒劑濃度越高。戊二醛癸甲溴銨、醛力美抗干擾能力較弱，月芐三甲氯銨、百敵克、安立消、新歐福抗有機(jī)物干擾的能力較強(qiáng)。根據(jù)本研究結(jié)果，建議消毒時(shí)使用月芐三甲氯銨、百敵克、安立消、新歐福4種消毒劑輪換使用。環(huán)境潔凈度較差的養(yǎng)殖場(chǎng)，消毒前盡可能提高潔凈度，并且通過(guò)加大消毒劑濃度至推薦使用濃度的2～4倍，延長(zhǎng)消毒時(shí)間保證消毒效果。

細(xì)菌的抗生素和消毒劑存在共同耐藥現(xiàn)象[19]。為減少細(xì)菌對(duì)消毒劑的抗性及食品安全風(fēng)險(xiǎn)，養(yǎng)殖場(chǎng)要定期清潔，保持良好的養(yǎng)殖環(huán)境[20-21]。不同消毒劑的消毒效果存在差異，建議具備條件的養(yǎng)殖場(chǎng)選用消毒劑時(shí)，結(jié)合實(shí)驗(yàn)室手段，對(duì)比不同消毒劑的MBC值，合理選擇及使用消毒劑。