人肺癌H1299阿霉素耐藥性細(xì)胞株的建立及鑒定*

陳 慧，陳玉梅，胡招娣，楊 潮

(贛南師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，江西 贛州 341000)

癌癥是威脅人類身體健康最嚴(yán)重的疾病之一，對癌癥的預(yù)防和有效治療已成為當(dāng)今世界最具有挑戰(zhàn)性的課題.在諸多癌癥類型中，肺癌是一類最為常見的惡性腫瘤，其病理類型包括小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌[1].世界衛(wèi)生組織公布的數(shù)據(jù)顯示，在2018 年肺癌是全球發(fā)病率和致死率最高的惡性腫瘤，約有 210 萬肺癌新發(fā)病例，而因肺癌死亡的患者人數(shù)高達(dá)176 萬人[2].在我國，肺癌的發(fā)病率和死亡率也同樣位居所有癌癥的首位，2015年我國肺癌新發(fā)病例高達(dá)78.7萬人，死亡人數(shù)則達(dá)到63.1萬人[3].目前，早期肺癌可通過手術(shù)成功切除，中晚期肺癌則需要放化療治療[4].但隨著化療次數(shù)增多，耐藥率越來越高，目前晚期肺癌尚無理想治療的方法.因此，深入研究肺癌的耐藥機制，對肺癌的化學(xué)預(yù)防和治療具有重要意義.

阿霉素(Doxorubicin，Dox)是一種廣譜性的抗腫瘤抗生素，通過抑制細(xì)胞中RNA 和DNA的合成，實現(xiàn)對癌細(xì)胞的殺傷.但在治療過程中，長期使用Dox常會導(dǎo)致癌細(xì)胞發(fā)生耐藥性.為了深入研究肺癌獲得性Dox耐藥的分子機制，構(gòu)建穩(wěn)定的耐藥細(xì)胞模型是開展這方面研究的基礎(chǔ).本研究采用濃度梯度遞增的誘導(dǎo)方式建立人肺癌細(xì)胞H1299 Dox耐藥細(xì)胞株H1299 R，并對其耐藥性進(jìn)行初步鑒定，包括比較耐藥細(xì)胞株H1299 R和野生型細(xì)胞H1299 W形態(tài)特征、增殖曲線；Real-time PCR檢測耐藥細(xì)胞株H1299 R和野生型細(xì)胞H1299 W與癌細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性、發(fā)生轉(zhuǎn)移和侵襲相關(guān)的基因表達(dá)量.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料

人肺癌H1299細(xì)胞株由中國科學(xué)院干細(xì)胞庫提供.

1.1.2 試劑

RPMI-1640培養(yǎng)基和胎牛血清(Gibco 公司)；10×PBS和胰酶TEMED(碧云天生物技術(shù)公司)；阿霉素(Doxorubicin)、二甲亞基砜(DMSO)和引物合成(上海生工生物工程有限公司)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara公司)；Trizol 和2×SYBR Green Mix(百泰克生物公司).

1.2 實驗方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

人肺癌H1299細(xì)胞株選用含10% FBS和1%抗生素的1 640培養(yǎng)基，置于37 ℃和5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng).

1.2.2 耐藥細(xì)胞株的建立

采用濃度梯度遞增法處理人肺癌H1299細(xì)胞，使用的阿霉素濃度依次為0.1、0.2、0.5、1.0、2.0 μg/mL，連續(xù)培養(yǎng)6個月，獲得耐藥細(xì)胞株H1299 R.具體步驟如下:阿霉素的使用濃度從0.1 μg/mL開始，加藥24 h后換液，細(xì)胞穩(wěn)定3～5 d后再進(jìn)行傳代.待細(xì)胞呈對數(shù)生長時再次添加與之前相同濃度的藥物處理，照該步驟重復(fù)3遍后再開始增加藥物濃度，每傳2～3代逐步提高阿霉素濃度，提高的濃度梯度以每次提高濃度后72 h存活細(xì)胞比例達(dá)80%以上，最終篩出耐藥細(xì)胞株H1299 R.

1.2.3 MTT實驗

取對數(shù)生長期H1299 W和H1299 R細(xì)胞，以3 000個/孔(耐藥增殖實驗則以5 000個/孔)的量接種于96孔板(同時設(shè)置3-5個復(fù)孔，)，分別培養(yǎng)1、2、3和4 d后進(jìn)行OD值檢測.耐藥增殖實驗則在細(xì)胞接種時，在培養(yǎng)液中直接添加終濃度為5 μg/mL阿霉素.檢測時每孔加入20 μL 5mg/mL的MTT 溶液，與細(xì)胞培養(yǎng)4 h后去除舊培養(yǎng)液，PBS清洗1次，每孔加入200 μL DMSO，避光置于水平搖床上震蕩10 min.在490 nm處檢測吸光度(A)值，記錄數(shù)據(jù)后繪制H1299 W和H1299 R的生長曲線.

1.2.4 熒光定量PCR實驗

提取未處理的肺癌細(xì)胞H1299 W和耐藥細(xì)胞H1299 R的總RNA，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄實驗獲得相應(yīng)樣本的cDNA.以cDNA為模版，進(jìn)行熒光定量PCR實驗，檢測H1299 W和H1299 R細(xì)胞中β-actin、MDR1、MMP-2、MMP-9、ABCG2、E-Cadherin、N-Cadherin和Vimentin等基因的mRNA表達(dá)水平.所采用引物序列如表1：

表1 熒光定量PCR引物序列

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

實驗數(shù)據(jù)通過Excel 2003軟件進(jìn)行分析，采用T-Test參數(shù)比較不同組別的差異性，其中0.001≤P≤0.01具有高度統(tǒng)計學(xué)意義，標(biāo)注為**，P≤0.001具有顯著性差異，標(biāo)注為***.

2 結(jié)果與分析

2.1 Dox處理人肺癌H1299細(xì)胞形態(tài)的變化

倒置熒光顯微鏡下觀察人肺癌H1299 W和H1299 R細(xì)胞的形態(tài)時，發(fā)現(xiàn)H1299 R細(xì)胞形態(tài)較H1299野生型細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生了較大變化，細(xì)胞大小、形態(tài)均發(fā)生變化，細(xì)胞更細(xì)長，細(xì)胞內(nèi)尤其是近胞膜處有較多深色物質(zhì)聚集(圖1).

圖1 H1299 W 和H1299 R細(xì)胞形態(tài)

2.2 細(xì)胞增殖曲線測定

耐藥性細(xì)胞株H1299 R和野生型細(xì)胞H1299在相同條件下培養(yǎng)4 d.MTT法檢測耐藥性細(xì)胞株H1299 R和H1299野生型細(xì)胞,增殖未產(chǎn)生一定的差異(見圖2).

圖2 H1299 W 和H1299 R細(xì)胞增殖曲線

2.3 Dox對H1299 W和H1299 R細(xì)胞毒性的檢測

耐藥性細(xì)胞株H1299 R和H1299野生型細(xì)胞在Dox藥物的處理下培養(yǎng)4 d，MTT法檢測細(xì)胞增殖情況。由圖3可看出，用5 ug/ml Dox處理細(xì)胞后，耐藥性細(xì)胞株H1299 R細(xì)胞增殖曲線仍呈現(xiàn)上升趨勢，但是增長緩慢；而H1299野生型細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)呈現(xiàn)上升趨勢.

圖3 DOX處理H1299 W 和H1299 R的細(xì)胞增殖曲線

2.4 H1299 W和H1299 R的細(xì)胞中耐藥基因和轉(zhuǎn)移性基因表達(dá)差異

為了考察耐藥細(xì)胞株H1299 R的基因變化情況，收集耐藥性細(xì)胞株H1299 R和H1299野生型細(xì)胞的RNA樣本，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行Real-time PCR檢測.實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)耐藥性細(xì)胞株H1299 R中與癌癥耐藥、轉(zhuǎn)移和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)基因如MDR1、MMP-2、MMP-9、ABCG2、E-Cadherin、N-Cadherin和Vimentin的mRNA表達(dá)水平均高于H1299野生型細(xì)胞組，呈顯著性差異且具有統(tǒng)計學(xué)意義(見圖4).

圖4 腫瘤耐藥性相關(guān)基因在H1299 W和H1299 R中的mRNA表達(dá)水平

3 討論

阿霉素(Adriamycin)是一種蒽環(huán)類抗菌化學(xué)藥物，對細(xì)胞增長具有抑制作用，其在結(jié)構(gòu)上與柔紅霉素相類似[5]，在各種惡性腫瘤臨床治療中具有重要的作用.它作為一種新型抗腫瘤藥物，在實體瘤(乳腺癌、惡性肉瘤、支氣管癌和神經(jīng)母細(xì)胞瘤)以及血液學(xué)惡性腫瘤(惡性淋巴瘤和急性白血病)中抑制細(xì)胞的增殖[6].阿霉素抑制腫瘤細(xì)胞的增殖的作用機制是，其本身可插入DNA雙鏈結(jié)構(gòu)中，使雙鏈DNA的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，另外，其可抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ的功能，導(dǎo)致DNA的結(jié)構(gòu)損傷，使得腫瘤細(xì)胞凋亡[7].阿霉素雖有作用機制清晰、費用便宜等優(yōu)點，但在臨床應(yīng)用中仍被發(fā)現(xiàn)會導(dǎo)致癌癥患者的耐藥性產(chǎn)生，影響治療效果.

多藥耐藥是目前腫瘤細(xì)胞免受化療藥物攻擊的最重要的細(xì)胞防御機制[8].MDR1基因的過表達(dá)是腫瘤產(chǎn)生多藥耐藥的主要機制之一[9].MDR1可通過水解ATP獲取能量，將細(xì)胞中的化學(xué)藥物排出癌細(xì)胞外，以減少癌細(xì)胞內(nèi)的化學(xué)藥物濃度，從而使細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性[10].有研究證實，通過RNA干擾技術(shù)沉默 MDR1 基因表達(dá)，可提高多種腫瘤細(xì)胞對化療藥物的敏感性，如肺癌、乳腺癌等[10-11].除此之外，在一些新輔助治療和手術(shù)后輔助治療中使用一些紫杉類藥物，使腫瘤患者在疾病復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移時往往會對這類藥物產(chǎn)生耐藥[12-13].已有研究評估治療非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)和小細(xì)胞肺癌(SCLC)的腫瘤藥物氨柔比星(amrubicin)的活性，發(fā)現(xiàn)該藥物難以治愈復(fù)發(fā)性的小細(xì)胞肺癌[14].近年來，篩選耐藥細(xì)胞株已成為研究者研究工作的重要研究工具，研究者們運用耐藥細(xì)胞株來揭示腫瘤細(xì)胞的耐藥機制，為治療腫瘤提供更有效的方法.因此，建立癌細(xì)胞的耐藥細(xì)胞株在科研工作中具有重要意義.

本實驗首先建立了人肺癌阿霉素耐藥性細(xì)胞株H1299 R，在熒光倒置顯微鏡下觀察到H1299 R細(xì)胞形態(tài)較野生型細(xì)胞H1299 W的形態(tài)發(fā)生了較大變化，細(xì)胞大小、形態(tài)均發(fā)生變化，細(xì)胞更細(xì)長，細(xì)胞內(nèi)尤其是近胞膜處有較多深色物質(zhì)聚集.MTT法檢測出在正常情況下培養(yǎng)耐藥性細(xì)胞株H1299 R和H1299野生型細(xì)胞增殖未產(chǎn)生一定的差異，而Dox對H1299 W 和H1299 R細(xì)胞毒性存在顯著性差異.Real-time PCR研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)耐藥性細(xì)胞株H1299 R中與癌細(xì)胞耐藥性、轉(zhuǎn)移和侵襲相關(guān)基因MDR1、MMP-2、MMP-9、ABCG2、E-Cadherin、N-Cadherin和Vimentin基因mRNA的表達(dá)量均高于野生型細(xì)胞H1299 W組.這些結(jié)果預(yù)示著細(xì)胞耐藥性增強可能是這些基因表達(dá)增加，也可能存在多種基因共同通過不同的信號通路對癌細(xì)胞所用化療藥物產(chǎn)生耐藥性.本研究建立人肺癌細(xì)胞H1299 Dox耐藥細(xì)胞株H1299 R，并對其耐藥性進(jìn)行初步鑒定，為深入研究肺癌獲得Dox耐藥的分子機制奠定了基礎(chǔ).