全普CBD 油大鼠灌胃長期毒性試驗(yàn)研究

唐 敏，王振宇，郭 翀，項(xiàng) 偉，宋京風(fēng)

（1） 云南省第二人民醫(yī)院麻醉科，云南昆明 650021；2） 昆明醫(yī)科大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程中心，云南昆明 650500；3） 昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，云南昆明 650032；4） 云南省漢木森科技有限公司，云南昆明 650500；5） 昆明醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院暨云南省天然藥物藥理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南昆明 650500）

大麻二酚 （cannabidiol，CBD）是大麻（Cannabis sativa） 提取物的主要成分之一。大麻中的主要活性成分是大麻素類化合物，目前已知天然大麻素有113 種[1-2]，四氫大麻酚（THC）、CBD含量最高[3]，是大麻中的主要化學(xué)成分。它們互為同分異構(gòu)體[4]。雖然THC 被認(rèn)為是其最重要的活性成分，具有神經(jīng)活性，可用于治療癌癥引起的嘔吐，但THC 具有致幻作用，這成為許多國家禁種大麻的唯一原因[5]。與THC 不同的是，CBD 是大麻中的非成癮性成分，能阻礙THC 對人體神經(jīng)系統(tǒng)影響，并具有抗痙攣、抗風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、抗焦慮等藥理活性[6]。最近Daniel Friedman 等[7]發(fā)現(xiàn)全普CBD 油能夠有效治療難治性癲癇Lennox-Gastaut 綜合癥和Dravet 綜合癥。Fabricio 等[9]發(fā)現(xiàn)在治療難治性癲癇和兒童癲癇方面，全譜CBD 油較純品CBD 具有更好的臨床效果和更低的臨床用量。Schrader 等[8]發(fā)現(xiàn)THC 和CBD 的混合物治療EB 病毒引起的疼痛，相比于阿片類鎮(zhèn)痛藥物，其目前尚未發(fā)現(xiàn)成癮性和耐受性，且具有良好的止疼效果。這正符合了新藥研發(fā)高效、低毒的思路和目標(biāo)。目前全譜CBD 的抗腫瘤、抑制精神疾病、抗氧化等藥理作用成為研究的熱點(diǎn)，但是，有關(guān)全譜CBD 油的毒性和安全性評價(jià)尚未見報(bào)道。為進(jìn)一步研究其安全性，探索其給藥安全范圍，本研究對SD 大鼠連續(xù)經(jīng)口染毒13 周，恢復(fù)4 周的安全性進(jìn)行評價(jià)研究，旨在研究全普CBD 油毒性的作用性質(zhì)、程度、量效和時(shí)效關(guān)系以及可逆性等，為臨床應(yīng)用安全性及防治提供毒理學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 受試藥物全普CBD 油中含有CBD 化學(xué)成分約為67%，THC 含量低于0.2%，由云南省漢木森科技有限公司提供。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物160 只SPF 級SD 大鼠，來源于昆明醫(yī)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號：SCXK（滇） 2015-002，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證：SYXK（滇） 2015-002。飼養(yǎng)環(huán)境為SPF 級。

1.1.3 主要儀器Roche Cobas311 全自動(dòng)生化分析儀；SysmexHST-302 血液分析儀；STAGO STA-R Evolution 血凝儀；Nikon ECLIPSE 50i 研究型系統(tǒng)生物顯微鏡。

1.2 方法

1.2.1 劑量設(shè)計(jì)臨床應(yīng)用劑量[10-13]：本品臨床為口服用藥，臨床擬用量以CBD 算為30～200 mg/d，按60 kg 體重計(jì)算人用藥最大劑量為3.33 mg/(kg.d)。

急性毒性試驗(yàn)：SD 大鼠急性毒性試驗(yàn)最大耐受量（MTD） 以CBD 計(jì)算為837.5 mg/(kg.bw)。

1.2.2 分組適應(yīng)性飼養(yǎng)后，選擇合格動(dòng)物150只，雌雄各半隨機(jī)分為五組，每組30 只，實(shí)驗(yàn)設(shè)全普CBD 油50、125、250 mg/kg 三個(gè)劑量組，以CBD 算為33.5、83.75、167.5 mg/kg，分別為臨床推薦劑量的10、25、50 倍，同時(shí)設(shè)玉米油溶媒對照，高壓滅菌水陰性對照，每天5 mL/kg 等容量灌胃一次。進(jìn)行連續(xù)經(jīng)口染毒13 周，停藥恢復(fù)觀察4 周。

1.2.3 給藥及觀察檢測試驗(yàn)期間密切觀察大鼠一般狀況，記錄每周動(dòng)物的體重、攝食量。在給藥13 周及停藥后4 周，每組各解剖20、10 只大鼠，雌雄各半。采用腹主動(dòng)脈采血做血液學(xué)及血清生化檢查。停藥觀察4 周做可逆性觀察。解剖并對主要臟器進(jìn)行病理組織學(xué)檢查。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS 軟件統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料，符合正態(tài)分布，結(jié)果采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差方式表示，多組間比較用單因素方差分析，方差齊性時(shí)兩兩比較用LSD 方法分析，方差不齊時(shí)用秩和檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 對大鼠一般狀況及體質(zhì)量的影響

大鼠灌胃給于全普CBD 油13 周和停藥恢復(fù)性觀察4 周內(nèi)，對照組和各給藥組大鼠精神狀態(tài)良好，行為活動(dòng)、呼吸正常，唾液腺、淚腺等腺體未見有異常分泌，皮毛光滑，糞便和尿液也未見異常。全普CBD 油對各組大鼠體質(zhì)量增長變化未出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），見圖1。

2.2 攝食量變化

給藥期各給藥組和溶媒對照組各時(shí)段雌、雄鼠攝食量均低于陰性對照組，比較均有顯著性差異（P＜0.05/0.01），恢復(fù)期各給藥組和溶媒對照組攝食量逐漸增加，見圖2。

2.3 血液學(xué)檢測結(jié)果

給藥末期和恢復(fù)期血液學(xué)指標(biāo)各組間比較均無顯著性差異（P＞0.05），見表1，2。

圖1 CBD 油給藥13 周大鼠體質(zhì)量的經(jīng)時(shí)變化Fig.1 Effect of the full spectrume CBD oil on the changes of dodyweight of rats

圖2 全普CBD 油給藥13 周大鼠耗食量的經(jīng)時(shí)變化Fig.2 Effect of the full spectrume CBD oil on the changes of food consuptio

表1 全普CBD 油給藥末期對血液學(xué)指標(biāo)的影響（）Tab.1 Effect of the full spectrume CBD oil haematological indexes after 13 weeks medication （）

表1 全普CBD 油給藥末期對血液學(xué)指標(biāo)的影響（）Tab.1 Effect of the full spectrume CBD oil haematological indexes after 13 weeks medication （）

表2 全普CBD 油恢復(fù)期對血液學(xué)指標(biāo)的影響（）Tab.2 Effect of the full spectrume CBD oil haematological indexes after withdrawing medication for 4 weeks（）

表2 全普CBD 油恢復(fù)期對血液學(xué)指標(biāo)的影響（）Tab.2 Effect of the full spectrume CBD oil haematological indexes after withdrawing medication for 4 weeks（）

2.4 血清生化學(xué)及電解質(zhì)指標(biāo)檢查結(jié)果

給藥末期谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、血清堿性磷酸酶（ALP），給藥中、高劑量組高于溶媒對照組，比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01）；血清白蛋白（ALB）、甘油三脂（Tri）、尿素氮（Urea） 高劑量組低于溶媒和陰性對照組，比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01）；血糖（GLU） 高、中、低劑量組均低于陰性對照組，比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01）；血清Na+，Cl-高劑量組低于溶媒和陰性對照組，比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01），K+高劑量組低于陰性對照組，比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01）?；謴?fù)期，除高劑量Tri 低于溶媒對照組外，其余各項(xiàng)檢查指標(biāo)均恢復(fù)正常，給藥組與對照組比較無顯著性差異（P＞0.05），見表3，4。

表3 全普CBD 油給藥末期血清生化學(xué)檢查結(jié)果（）Tab.3 Effect of the full spectrume CBD oil serum biochemical indexes of rats after 13 weeks medication （）

表3 全普CBD 油給藥末期血清生化學(xué)檢查結(jié)果（）Tab.3 Effect of the full spectrume CBD oil serum biochemical indexes of rats after 13 weeks medication （）

與陰性對照組間比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01；與溶媒對照組比較，▲P ＜0.05，▲▲P ＜0.01。

表4 全普CBD 油恢復(fù)期血清生化學(xué)檢查結(jié)果（）Tab.4 Effect of the full spectrume CBD oil serum biochemical indexes of rats after withdrawing medication for 4 weeks （）

表4 全普CBD 油恢復(fù)期血清生化學(xué)檢查結(jié)果（）Tab.4 Effect of the full spectrume CBD oil serum biochemical indexes of rats after withdrawing medication for 4 weeks （）

2.5 臟器重量及系數(shù)

給藥末期雌、雄鼠肝臟重量及系數(shù)高、中劑量組，肝腦系數(shù)，高、中、低劑量均高于溶媒和陰性對照組，比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01/0.05），脾臟重量、系數(shù)及脾腦系數(shù)高、中劑量組低于溶媒和陰性對照組，比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01/0.05）?；謴?fù)期各劑量組各臟器重量、系數(shù)及臟腦系數(shù)均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），見表5～表10。

2.6 對肝臟的病理組織學(xué)檢查結(jié)果

給藥末期高劑量組部分動(dòng)物（7/10），中劑量組部分動(dòng)物（5/10）、可見肝細(xì)胞脂肪變性，肝細(xì)胞胞漿可見大小不等的圓形空泡（圖3、圖4），圖5 為正常的肝組織，且給藥中、高劑量組與對照組比發(fā)生率有顯著性差異（P＜0.05）。部分可見肝細(xì)胞點(diǎn)狀壞死、小灶炎，心臟局部間質(zhì)有少量淋巴細(xì)胞為主的炎細(xì)胞浸潤，此病理改變屬大鼠常見自發(fā)性病理改變。

表5 全普CBD 油給藥末期對雌鼠臟器系數(shù)的影響[g/100 g，（）]Tab.5 Effect of the full spectrume CBD oil organ coefficients of the female rats after 13 weeks medication[g/100 g，（）]

表5 全普CBD 油給藥末期對雌鼠臟器系數(shù)的影響[g/100 g，（）]Tab.5 Effect of the full spectrume CBD oil organ coefficients of the female rats after 13 weeks medication[g/100 g，（）]

與陰性對照組間比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01；與溶媒對照組比較，▲P ＜0.05，▲▲P ＜0.01。

表6 全普CBD 油給藥末期對雄鼠臟器系數(shù)的影響[g/100 g，（）]Tab.6 Effect of the full spectrume CBD oil organ coefficients of the male rats after 13 weeks medication[g/100 g，（）]

表6 全普CBD 油給藥末期對雄鼠臟器系數(shù)的影響[g/100 g，（）]Tab.6 Effect of the full spectrume CBD oil organ coefficients of the male rats after 13 weeks medication[g/100 g，（）]

與陰性對照組間比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01；與溶媒對照組比較，▲P ＜0.05，▲▲P ＜0.01。

表7 全普CBD 油恢復(fù)期對雌鼠臟器系數(shù)的影響[g/100 g，（）]Tab.7 Effect of the full spectrume CBD oil organ coefficients of the female rats after withdrawing medication for 4 weeks [g/100 g，（）]

表7 全普CBD 油恢復(fù)期對雌鼠臟器系數(shù)的影響[g/100 g，（）]Tab.7 Effect of the full spectrume CBD oil organ coefficients of the female rats after withdrawing medication for 4 weeks [g/100 g，（）]

表8 全普CBD 油恢復(fù)期對雄鼠臟器系數(shù)的影響[g/100 g，（）]Tab.8 Effect of the full spectrume CBD oil on organ coefficients of the male rats after withdrawing medication for 4 weeks[g/100 g，（）]

表8 全普CBD 油恢復(fù)期對雄鼠臟器系數(shù)的影響[g/100 g，（）]Tab.8 Effect of the full spectrume CBD oil on organ coefficients of the male rats after withdrawing medication for 4 weeks[g/100 g，（）]

表9 全普CBD 油給藥末期對大鼠臟腦比的影響[g/g，（）]Tab.9 Effect of the full spectrume CBD oil on Viscera/brain coefficients after 13 weeks medication[g/g，（）]

表9 全普CBD 油給藥末期對大鼠臟腦比的影響[g/g，（）]Tab.9 Effect of the full spectrume CBD oil on Viscera/brain coefficients after 13 weeks medication[g/g，（）]

與陰性對照組間比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01；與溶媒對照組比較，▲P ＜0.05，▲▲P ＜0.01。

表10 全普CBD 油恢復(fù)期對大鼠臟腦比的影響[g/g，（）]Tab.10 Effect of the full spectrume CBD oil on Viscera/brain coefficients after withdrawing medication for 4 weeks[g/g，（）]

表10 全普CBD 油恢復(fù)期對大鼠臟腦比的影響[g/g，（）]Tab.10 Effect of the full spectrume CBD oil on Viscera/brain coefficients after withdrawing medication for 4 weeks[g/g，（）]

圖3 全普CBD 油高劑量組肝臟輕度脂肪變性（HE 40×）Fig.3 Liver is mildly steatotic in CBD high group（HE 40×）

圖4 全普CBD 油中劑量組肝臟輕度脂肪變性（HE 40×）Fig.4 Liver is mildly steatotic in middle group （HE 40×）

3 討論

3.1 體重及攝食量

本研究對SD 大鼠連續(xù)經(jīng)口染毒13 周，恢復(fù)4周的安全性進(jìn)行評價(jià)研究。試驗(yàn)期間，每天觀察大鼠的外觀、行為等表現(xiàn)，整個(gè)試驗(yàn)過程中各劑量組大鼠未出現(xiàn)死亡情況，且所有大鼠的行為、精神狀態(tài)、飲飼等無異常。給藥期及恢復(fù)期，各劑量組動(dòng)物體重呈穩(wěn)步上升趨勢，符合正常生長規(guī)律[15-16]。給藥各劑量組攝食量有所降低，但降低程度與溶媒對照組相當(dāng)，原因主要考慮溶媒植物油對大鼠食欲、消化功能的影響，而非全普CBD油本身的毒性所致。

圖5 CBD 油低劑量組肝臟小灶炎（HE 40×）Fig.5 Liver has focal inflammation in CBD low group（HE 40×）

圖6 溶媒組正常肝組織（HE 40×）Fig.6 Liver is normal in solvent group （HE 40×）

3.2 血液學(xué)及血清生化指標(biāo)

給藥末期和恢復(fù)期對大鼠采血進(jìn)行血液學(xué)和血清生化學(xué)檢測。給藥末期和恢復(fù)期血液學(xué)指標(biāo)各組間比較均無顯著性差異。

血清生化指標(biāo)，ALT、AST 和ALP 等生物酶學(xué)指標(biāo)，是評價(jià)肝細(xì)胞損傷的敏感指標(biāo)[17-19]，大多數(shù)情況下ALT 和AST 升高程度與肝細(xì)胞受損程度相一致，是目前最常用的肝功能檢測指標(biāo)。給藥末期，給藥高、中劑量組血清中ALT、ALP 明顯升高，ALB 降低，提示服用全普CBD 油用高、中劑量組藥物時(shí)對可能引起肝細(xì)胞損傷，但停藥后該影響即消失，提示在后期的研究和臨床應(yīng)用過程中注意監(jiān)測肝功能變化。

血清K+、Na+、Cl-對保持細(xì)胞外液容量、調(diào)節(jié)酸堿平衡、維持正常滲透壓和細(xì)胞生理功能有重要意義，并參與維持神經(jīng)肌肉的正常應(yīng)激性。而本研究中、高劑量K+、Na+、Cl-及高劑量組血清Tri、Urea 低于陰性對照或溶媒對照組，GLU 高、中、低劑量組均低于陰性對照組，但降低程度較低，是其藥理作用的延申或毒性作用，可以通過增加劑量或延長給藥時(shí)間來進(jìn)一步研究判斷。

3.3 臟器重量、臟器系數(shù)和病理組織學(xué)檢查

給藥末期雌、雄鼠肝臟重量及系數(shù)高、中劑量組，肝腦系數(shù)，高、中、低、劑量均高于溶媒和陰性對照組，比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01/0.05），且具有劑量-反應(yīng)關(guān)系。病理組織學(xué)顯示高、中劑量組均出現(xiàn)肝臟的輕度脂肪變性，且高劑量組發(fā)生率增加。脾臟重量、系數(shù)及脾腦系數(shù)高、中劑量組低于溶媒和陰性對照組，比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01/0.05），但毒性判斷必須綜合考慮脾臟重量的劑量相關(guān)性及組織病理學(xué)改變才具有一定的毒理學(xué)意義[20]。該研究血液學(xué)、血清生化學(xué)和病理組織學(xué)檢查未發(fā)現(xiàn)關(guān)聯(lián)性變化，因此無毒理學(xué)意義?；謴?fù)期各劑量組各臟器重量、系數(shù)及臟腦系數(shù)均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。本實(shí)驗(yàn)表明全普CBD 油無毒反應(yīng)劑量為50 mg/kg，相當(dāng)于人體推薦用量的10 倍以下為安全劑量，但在臨床應(yīng)用過程中需要密切監(jiān)測肝功變化。