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    高黏液型肺炎克雷伯菌耐藥性和感染患者臨床特征研究

    2020-11-12 01:28:52丁潔霞蔣小仙王淑穎岑盼盼
    健康研究 2020年5期
    關(guān)鍵詞:耐藥檢測

    吳 旻,丁潔霞,鄒 菁,蔣小仙,金 潔,王淑穎,岑盼盼,陳 瓊

    (浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬杭州市第一人民醫(yī)院 1.感染科;2.院感科;3.細(xì)菌室,浙江 杭州 310006)

    高黏液型肺炎克雷伯菌(hypermucoviscousKlebsiellapneumoniae, HMKP)是經(jīng)典肺炎克雷伯菌(classicalKlebsiellapneumoniae, cKP)的一個變種,具有較厚的莢膜和脂多糖(lipopolysaccharide, LPS),能保護(hù)細(xì)菌免受血清因子和吞噬作用的影響[1]。HMKP可導(dǎo)致膿毒血癥、膿腫、腦膜炎、眼炎和重癥肺炎等,致死率高[2-3]。因此,HMKP也被稱為高毒力肺炎克雷伯菌(hypervirulentKlebsiellapneumoniae,hvKP)。2013年,北京佑安醫(yī)院報道了多重耐藥hvKP[4];2015年,Zhang等[5]首次報道了碳青霉烯類耐藥HMKP(carbapenem resistant HMKP,CR-HMKP)菌株;之后浙江[6]、四川[7]、安徽[8]、香港[9]等多地出現(xiàn)了CR-HMKP流行。本研究對HMKP菌株耐藥性和感染患者的臨床特征進(jìn)行分析,以期為臨床控制HMKP流行提供理論依據(jù)。

    1 材料和方法

    1.1 菌株來源和鑒定 收集2017年1月—12月于浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬杭州市第一人民醫(yī)院臨床分離的65株HMKP菌株,來自41例患者,所有菌株拉絲試驗均為陽性[10]。65株HMKP菌株采集自血液18株(27.7%),膽汁19株(29.2%),膿液7株(10.8%),痰液7株(10.8%),動靜脈導(dǎo)管液3株(4.6%),潔尿3株(4.6%),關(guān)節(jié)液、胸水、腹水和腦脊液共8株(12.3%)。13例感染患者在≥2個不同部位培養(yǎng)到HMKP菌株。10例CR-HMKP感染患者中有3例來自消化科,2例來自ICU,2例來自肝膽外科,胃腸外科、腦外科、腎內(nèi)科各1例。選取來自不重復(fù)患者的不重復(fù)HMKP菌株41株作為研究菌株,利用基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF/MS)進(jìn)行菌種鑒定。質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC25922和肺炎克雷伯菌ATCC700603。

    1.2 藥物敏感試驗和產(chǎn)廣譜β內(nèi)酰胺酶(extended-spectrum β-lactamases,ESBLs)表型測定 藥物敏感試驗和ESBLs表型測定采用Vitek 2 Compact全自動細(xì)菌鑒定及藥敏分析系統(tǒng)(Marcy-l étoile, France)。藥敏結(jié)果根據(jù)2017年美國臨床和實驗室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(CLSI)標(biāo)準(zhǔn)判定,對亞胺培南或厄他培南耐藥的菌株判定為CR-HMKP,對亞胺培南和厄他培南均敏感的菌株判定為碳青霉烯類敏感HMKP(carbapenem susceptible HMKP,CS-HMKP)。

    1.3 CR-HMKP菌株多位點序列分型(multilocus sequence typing,MLST)和莢膜血清學(xué)分型(K分型) 按照巴斯德研究所MLST網(wǎng)站(http://bigsdb.Pasteur.fr/klebsiella/klebsiella.html)描述,對7個管家基因進(jìn)行MLST分析:孵育和收集4 mL CR-HMKP菌液,提取菌株的DNA。以7個管家基因 (gapA、infB、rpoB、phoE、mdh、pgi、tonB) DNA為模板,配制25 μL反應(yīng)體系,PCR擴(kuò)增目的基因。PCR反應(yīng)條件:預(yù)變性94 ℃ 2 min,循環(huán)94 ℃ 30 s,50 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,共35個循環(huán);最后延伸 72 ℃ 5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化及雙向測序, 將7個管家基因的序列與MLST數(shù)據(jù)庫中已知的等位基因序列比對,獲得相應(yīng)序列號。采用PCR對CR-HMKP菌株進(jìn)行莢膜血清學(xué)分型,包括K1、K2、K5、K16、K20、K54、K57[4]。

    1.4 HMKP菌株毒力因子檢測和CR-HMKP菌株碳青霉烯酶基因檢測 參考相關(guān)文獻(xiàn)[11-13],對41株不重復(fù)的HMKP 菌株進(jìn)行10個毒力因子基因檢測,包括莢膜(rmpA,magA)、LPS (uge,wabG)、菌毛(fimH)、含鐵細(xì)胞(iutA,iroN,entB)和其他毒力基因(allS,kfu)[11-12]。對CR-HMKP菌株的碳青霉烯酶基因(blaKPC-2,blaVIM,blaIMP,blaOXA-48,blaNDM-1)[13]進(jìn)行檢測:孵育和收集4 mL HMKP菌液,提取菌株的DNA;PCR擴(kuò)增上述目的基因[11-13]。DNA測序,采用Bioedit軟件進(jìn)行序列比對。

    1.5 患者臨床特征分析 對患者的臨床資料進(jìn)行回顧性分析,包括患者一般資料、感染狀況、治療結(jié)局等。

    1.6 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 13.0軟件,計量資料比較采用t檢驗,計數(shù)資料比較采用χ2檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 菌株耐藥性情況 41株HMKP菌株中有31株CS-HMKP和10株CR-HMKP。3株CS-HMKP菌株檢測到ESBLs。CS-HMKP和CR-HMKP菌株抗生素藥物敏感性分布見表1。CS-HMKP菌株對除阿莫西林克拉維酸、頭孢菌素和氨曲南外的其他測定抗生素敏感,10株CR-HMKP均對替加環(huán)素敏感,對其他測定抗生素表現(xiàn)為高度耐藥。

    表1 HMKP菌株抗生素敏感性分布情況 (mg/L)

    2.2 CR-HMKP菌株分子生物學(xué)分析結(jié)果 10株CR-HMKP均為ST11,莢膜血清型K57型3株,K2型1株,6株未成功分型。40株HMKP分離株中檢測到rmpA基因, 39株HMKP中檢測到uge基因,34株HMKP中檢測到allS基因,36株HMKP中檢測到kfu基因。iutA、entB、iroN、fimH和wabG在41株HMKP中均檢測到。CS-HMKP菌株與CR-HMKP菌株的毒力基因譜分布相似。10株CR-HMKP菌株均產(chǎn)KPC-2碳青霉烯酶,未檢測到其他碳青霉烯酶(VIM, IMP, OXA-48和NDM-1)。

    2.3 感染患者臨床特征分析 20例(48.8%)感染患者發(fā)生遷徙性膿腫,以肝膿腫發(fā)生率最高,且主要來自CS-HMKP感染。CR-HMKP感染患者的多部位感染發(fā)生率,肺部感染率,尿路感染率及關(guān)節(jié)液、胸水、腹水和腦脊液的感染率均高于CS-HMKP感染患者,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。16例(39.0%)HMKP感染患者有合并復(fù)數(shù)菌感染,主要為腸球菌。CR-HMKP感染患者合并復(fù)數(shù)菌感染率高于CS-HMKP感染患者,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。CR-HMKP感染患者的30天手術(shù)外傷史比例、90天內(nèi)住院史比例、呼吸系統(tǒng)疾病比例均高于CS-HMKP感染患者,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。留置導(dǎo)管方面,深靜脈置管、導(dǎo)尿管留置和胃腸道置管的CR-HMKP感染患者的比例高于CS-HMKP感染患者,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。CR-HMKP感染患者白細(xì)胞計數(shù)高于CS-HMKP感染患者,血清白蛋白水平低于CS-HMKP感染患者,凝血酶原時間和住院天數(shù)長于CS-HMKP感染患者,SOFA評分、死亡率和醫(yī)療費用高于CS-HMKP感染患者,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

    表2 HMKP感染患者臨床特征分析

    3 討論

    本研究從宿主、病原體和宿主—病原體相互關(guān)系對HMKP菌株耐藥性、毒力因子分布和感染患者臨床特征進(jìn)行系統(tǒng)研究。本研究分離的CS-HMKP菌株對抗生素保持較高的敏感性,7.3%(3/41)的HMKP菌株產(chǎn)ESBLs,4.9%(2/41)的HMKP菌株表現(xiàn)為多重耐藥,低于文獻(xiàn)[14]報道的16.3% hvKp產(chǎn)ESBLs和20.0%多重耐藥表現(xiàn)。近幾年,CR-HMKP頻繁地從中國患者中分離[5-9],且同一株HMKP上常攜帶多種耐藥基因,可能與HMKP對亞裔人種的高感染力和碳青霉烯耐藥肺炎克雷伯菌(carbapenem resistantKlebsiellapneumoniae, CRKP)菌株在我國流行傳播有一定關(guān)系。研究[15]表明,K1和K2莢膜血清型是HMKP主要的莢膜血清型。本研究分離的CR-HMKP菌株莢膜血清型主要以K57型(30%)為主,這是鮮有報道的[16]。質(zhì)粒介導(dǎo)的碳青霉烯酶是目前造成肺炎克雷伯菌乃至高毒力肺炎克雷伯菌產(chǎn)生碳青霉烯類抗生素耐藥的重要原因[17]。本研究中的CR-HMKP菌株均為含有blaKPC-2基因的ST11型,未檢測到其他碳青霉烯酶。研究[18]發(fā)現(xiàn),ST11是產(chǎn)碳青霉烯酶KPC酶的主要克隆型,但在HMKP菌株中很少被報道。自2015年以來,浙江多家醫(yī)院發(fā)生ST11型CR-HMKP菌株的暴發(fā)流行[11,19]。有研究[20]發(fā)現(xiàn),CR-hvKP 菌株可同時攜帶毒力質(zhì)粒和耐藥質(zhì)粒,甚至耐藥基因和毒力基因可通過同一質(zhì)?!肮矀鞑ァ薄_€有研究[21]發(fā)現(xiàn), ST11型肺炎克雷伯菌株存在外膜蛋白OmpK36缺失,這可能是造成菌株高耐藥、高毒力和高致病力的原因[22]。CR-HMKP合并ST11在全球范圍內(nèi)的流行應(yīng)引起關(guān)注。

    本研究中的10例CR-HMKP感染患者中有8例(80%)發(fā)生了多部位侵襲感染,6例(60%)最終死亡,其中1位尿毒癥患者和1位腦外傷原發(fā)肺部感染患者均在5處不同的標(biāo)本中培養(yǎng)到CR-HMKP,提示CR-HMKP的傳播力和致死率較高。41例HMKP感染的研究病例中,20例(48.8%)出現(xiàn)遷徙性膿腫,其中17例為CS-HMKP感染。12例(29.3%)HMKP感染患者表現(xiàn)為肝膿腫,高于研究[14]報道的hvKP可致10.0%的肝膿腫發(fā)生率。本研究還發(fā)現(xiàn)3例CS-HMKP感染的社區(qū)獲得肛周膿腫。

    臨床特征比較分析表明,有以下情況的患者更易發(fā)生CR-HMKP感染: 90天內(nèi)有住院病史、30天內(nèi)有手術(shù)外傷史、深靜脈留置、留置導(dǎo)尿管、胃腸道置管以及低下的營養(yǎng)狀態(tài)(血清白蛋白水平低下)。CR-HMKP感染也更易出現(xiàn)肺部感染、尿路感染和多部位感染,同時易合并復(fù)數(shù)菌感染,表現(xiàn)出更明顯的白細(xì)胞水平上升,SOFA評分提高,凝血酶原時間延長,更高的死亡率和高額醫(yī)療費用的支出。這與普遍認(rèn)同的CRKP感染危險因素一致。

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